This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
安定した三次元折りたたみで折り畳まRNAまたはDNAは、抗腫瘍または抗ウイルス薬の開発において興味深い標的である。 HIV-1の場合には、ウイルスの活動の調節に関与するウイルスタンパク質は、いくつかの核酸を認識する。ヌクレオカプシド蛋白NCp7(NC)は、ウイルス複製の間にいくつかのプロセスを調節する重要なタンパク質である。 NCは、実際にはRNAおよびDNA、それらのアニーリングを容易にする二次構造を不安定化するシャペロンである。 NCの不活性化は、新しいアプローチおよび抗HIV療法のための興味深い標的である。 Nは nnealing- MがEの lectrophoresis ediated ucleocapsid(NAME)アッセイにより、そのようなTARのヘアピン構造およびHIVのCTAR要素として熱力学的に安定な三次元コンホメーションに折り畳まれたRNAおよびDNAの融解およびアニーリングを阻害することができる分子を同定するために開発されたHIV-1のヌクレオキャプシドタンパク質。新しいアッセイは、再いずれかを採用以前の標識を必要とせずcombinantまたは合成タンパク質、およびオリゴヌクレオチド。結果の分析は、従来の核酸の染色に続いて、標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって達成される。この作品で報告されたプロトコルは、核酸シャペロンの両方有能な、全長タンパク質または基本的なN末端ドメインを欠くその切断型と名前がアッセイを実行する方法について説明し、どのようにすることによって、NCのシャペロン活性の阻害を評価するためにインターカレースレッディング。また、NAMEは、識別NC阻害剤の作用の推定機構に関する指標を得るために、2つの異なるモードで便利に行うことができる。
ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のヌクレオカプシドタンパク質NCp7(NC)がしっかりと逆転写中に補因子としてウイルス複製に重要な役割を果たして、成熟した感染性ウイルスゲノムRNAと関連している小さな塩基性タンパク質であるゲノムの認識、および包装1-3 NCは、安定な核酸構造の不安定化と相補的な配列のアニーリングを触媒核酸シャペロンとして作用する。デュプレックス不安定化活性は、そのジンクフィンガー構造(12-55ペプチド)にマッピングされているが、その核酸凝集活性が11アミノ酸で主にN末端 ドメインが存在する。4、正に帯電したタンパク質は、アニーリング反応の静電障壁を低下させ二つの別々の相補的配列が一緒になる速度を増加させる。
安定した立体配座に折り畳まれた核酸はfacilitatするNCのシャペロン活動を必要とする電子彼らのアニーリングを5これはNCは鎖転移イベントにおいて重要である逆転写、特に重要である:。マイナス鎖転送において、 マイナス鎖停止 DNAは、単にレトロ転写、R領域に相補的な配列に転送され、アニールされなければならない熱力学がRNAゲノムの3 '末端にテンプレート6は 、この反応によりR領域中のトランス活性化応答領域 (TAR)RNAの安定した構造の存在のためにNCの不存在下で広範に発生していない、そのは、そのDNAコピー(CTAR DNA)。特徴的なステム-ループ構造を持つ7 CTARとTARが、実際には、高度に構造化された領域に関連付けられている必要があります。 NC蛋白質は、これらのヘアピンを変性し、相補的な核酸鎖間の分子間のアニーリングの速度を増加させることにより、マイナス鎖の転送を促進する。 TARとCTARのNCアニーリングのメカニズムを徹底的に調査し、デされましたいくつかの研究論文でTARアニールアッセイとしてスクライビングと提案方式が優れたレビューに描かれている。8-11要約、NCは、そのようなTAR-RNAなどの安定したRNAの二次構造を不安定にその相補的配列の二次構造を不安定化、CTAR-DNA 、およびTAR / CTARヘテロ形成につながるRNA / DNAのアニーリング反応を促進する。10,11により、HIV複製中鎖転移工程が有利で ある。12
NCをNCに向かって小分子によって誘導される潜在的な干渉が損なわNC活性の結果として、ウイルスゲノムの逆転写の低下をもたらすので、新たな抗ウイルス剤の開発のための魅力的な標的である。2,13このアプローチは可能性最終的に成功した抗HIV薬の開発につながる。 NCのスクリーニングの過程で、我々は、よく知られた特性に頼るアッセイを開発し14阻害剤効率的に相補的なオリゴヌクレオチドを不安定化アニールするヌクレオカプシド。10,11の私たちは、Nが nnealing- Mは、Eの lectrophoresis(NAME)アッセイをediated ucleocapsidそれと呼ばれる。 NAMEアッセイは、ハイブリッドTAR / CTARヘテロを生成するその相補的DNA配列(CTAR)とTAR-RNA配列の先端部に対応するオリゴヌクレオチドの我々の場合、相補的核酸の安定的に構造化されたコピー間のアニーリングを仲介するNCを使用して。 NCの存在下でTAR / CTARアニーリング反応の分析は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって調べることができる。
このプロトコルは、反応および実験の可能性のトラブルシューティングの結果を分析する方法を、急速に安定したヘアピン構造に折り畳ま室温オリゴヌクレオチドでアニールするようにNAMEアッセイを実行する方法を示しています。核酸の放射性標識は、要求された、とdetectiされていませんオリゴヌクレオチドバンドの上に、従来の染色法により行うことができる。組換え全長タンパク質またはNCの切断合成バージョンのどちらを採用してアッセイは、NC、RNAおよびDNAの強い結合と相関することが示される活性を阻害するスレッドインターカレーターの同定を可能にする。14
NAMEは急速にHIV-1、新規な抗HIV薬の探索において興味深い標的のヌクレオキャプシドタンパク質のシャペロン活性の阻害を評価することができるアッセイである。 NCは、高速かつ、その安定した折りたたみそうで注意深いアニーリングに続いて、高温で熱変性を必要とする室温の核酸でアニーリングする。アッセイは、いずれの完全長NCまたは切り捨て(12から55)NCで行うことができます。どちらの場合も2核酸(RNAおよびその相補DNAコピー)が急速にアニールされる。これは、切断NCペプチドと文献の観察と一致している:アニーリングが弱いNC結合部位でその相補心尖ループの相互作用に続くCTARのステムの効率的な溶融によって開始される、TAR心尖ループの相補的配列と、延長アニーリングしたハイブリッドには、いくつかの不安定な中間体を通って終わる。21
NCは非常に安定であるのprotEINといくつかの問題が実行NAMEが発生する可能性がありながら。これが達成されていない場合に、ゲルが正しい位置での核酸バンドを示さない。しかしバッファ反応を停止するために使用されるゲルのロードで作りたてのSDSを追加することが非常に重要である。実際には、正確にゲル電気泳動によってTAR / CTARのヘテロを視覚化するように、NCは、核酸結合タンパク質であるタンパク質を変性させ、核酸との緊密な複合体からそれを解放するためにLoading Bufferをゲル中に存在しなければならない。これはまた、ゲル、実行時 にシフトしたバンドの形成すなわち実験の可能性のトラブルシューティング、である。この効果は、完全長のNCは、 図2のように、採用されたときに特に顕著であり、核酸に強い凝集効果を有する、高度に塩基性のN末端 尾部の存在にリンクされている。
ターミナル基本尾の存在がショーとして、抑えることがアニーリング反応をより困難にするnは化合物1、代表スレッディングインターカレーターを用いて、図3に、TARおよびCTARのステムループ構造を安定に特に効率的なインターカレーター、すなわち 。実際には、核酸との相互作用のこのタイプは、バルジおよびループが塩基対に嵩高い置換基を容易に糸通しを可能にする、二重らせんの連続性を中断するときに有利である。これらの核酸結合剤によってTARとCTARの安定化は、以前に二つのオリゴヌクレオチドの融解温度の上昇を測定することにより分析した。14また、融解温度の上昇は、HIV-1 NCによって触媒アニーリングの阻害と相関するヘテロ二重TAR / CTARの減少形成につながるとスレッディングインターカレーターは、TAR要素としてRNAの動的な構造のためのバインダーの興味深いクラスであることを示している。14
作用機序は、これらのコンポのために呼び出さ図4に示すようにundsはさらに、別の代替フォーマットでNAMEアッセイを行うことによって確認することができる:薬物二つ折り畳まオリゴとともにインキュベートされたときにインターカレーターの場合、アニールヘテロの阻害が増強される。このようなNC蛋白質の直接の結合剤としての作用の異なる機構に作用する化合物は、以下の異なるプレインキュベーションモードによって影響を受ける。 NAMEアッセイは、したがって、NC阻害剤の同定のための化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用することができる二つの方法で行われ、NCを対象に抗HIV薬を探している間にも正のヒットの作用の推定メカニズムを評価する。明らかに、識別されたNC阻害剤の特定の作用機構に主張単独でこれらの技術を使用することは十分ではなく、他の適当な生化学的ア ッセイは、作業仮説を維持するために必要とされる。14
最後に、NAMEは非常に使用していることを強調しなければならない組換えまたは合成のいずれかに精製酵素、試験した化合物によるNCの「 インビトロ 」阻害に関する貴重な情報を与える。これはアッセイの「強さと弱さ」です:NAMEはよく迅速に構築し、解析する構造活性相関を、最終的に合成し、薬剤設計をリダイレクトすることが可能、仮想スクリーニングおよび創薬プログラムの予備的段階における分子モデリングアプローチを補完することができます。しかし、HIVにおける薬剤開発プロジェクトで使用される他の生化学的アッセイとして、NAMEは、ウイルス感染細胞における推定阻害剤の効果についての情報を与えることはありません。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
(12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |