This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
RNA eller DNA foldet i en stabil tredimensional foldning er interessante mål i udviklingen af antitumor eller antivirale lægemidler. I tilfælde af HIV-1, virale proteiner involveret i reguleringen af virusaktivitet genkende flere nukleinsyrer. Nukleocapsidproteinet NCp7 (NC) er et centralt protein regulerer flere processer i virusreplikation. NC er i virkeligheden en chaperone destabilisere sekundære strukturer af RNA og DNA og lette deres annealing. Inaktivering af NC er en ny tilgang og et interessant mål for anti-HIV-behandling. N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (navn) assay blev udviklet til at identificere molekyler stand til at inhibere smelte- og annealing af RNA og DNA foldet i termodynamisk stabile tredimensionale konformationer såsom hårnålestrukturer af tjære og cTAR elementer af HIV ved nukleokapsidproteinet af HIV-1. Den nye assay anvender enten recombinant eller syntetisk protein og oligonukleotider uden behov for deres tidligere mærkning. Analysen af resultaterne opnået ved standard polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) efterfulgt af konventionel nukleinsyre farvning. Protokollen rapporteret i dette arbejde beskriver, hvordan man udfører NAME assay med fuld-længde protein eller dets trunkeret version mangler den grundlæggende N-terminale domæne, såvel kompetent nukleinsyrer chaperoner, og hvordan man vurderer inhiberingen af NC chaperone-aktivitet ved en threading interkalator. Desuden kan NAME udføres i to forskellige tilstande, nyttigt at få indikationer på den formodede virkningsmekanisme af de identificerede NC-hæmmere.
Nukleocapsidproteinet NCp7 (NC) af human immundefekt virus type 1 (HIV-1) er en lille, basisk protein, der er tæt forbundet med genomisk RNA i modne infektiøse virus, spiller en afgørende rolle i virusreplikation som en cofaktor under revers transkription , genom anerkendelse, og emballage. 1-3 NC fungerer som en nukleinsyre anstandsdame katalyserer destabilisering af stabile nukleinsyrestrukturer og annealing af komplementære sekvenser. Dens nukleinsyre aggregere aktivitet findes primært i de 11 aminosyrer N-terminalt domæne, mens duplex destabiliserende aktivitet er blevet kortlagt til sine zinkfinger strukturer (12-55 peptid). 4 positivt ladede protein sænker elektrostatisk barriere annealingreaktionen og øger den hastighed, ved hvilken to separate komplementære sekvenser mødes.
Nukleinsyrer foldet i stabil konformation kræver chaperonen aktiviteter NC til facilitate deres annealing 5 Dette er især vigtigt i revers transkription, hvor NC er kritisk i streng transfer events:. i minus streng overførsel minusstrengen stopper DNA, blot retrotranskriberet, skal overføres og annealet til en komplementær sekvens i R regionen ved 3 'enden af RNA-genomet skabelon. 6 Selv termodynamisk begunstiget, denne reaktion ikke forekommer i vid udstrækning i fravær af NC på grund af tilstedeværelsen af den stabile struktur af trans aktivering responsive region (TAR) RNA i R regioner der skal være knyttet til dens DNA-kopi (cTAR DNA). 7 cTAR og TAR er faktisk meget strukturerede regioner med en karakteristisk hårnåle-konformation. NC protein denaturerer disse hårnåle, og fremmer minus-streng overførsel ved at øge hastigheden af intermolekylære annealing mellem de komplementære nukleinsyrestrenge. Mekanismen for NC annealing af tjære og cTAR er blevet grundigt undersøgt, og debeskrevet som TAR annealing assay i flere forskningsartikler og den foreslåede ordning er afbildet i fremragende anmeldelser. 8-11 Sammenfattende NC destabiliserer den sekundære struktur af stabile RNA såsom TAR-RNA, destabiliserer den sekundære struktur af dens komplementære sekvens, cTAR-DNA og fremmer annealingreaktionen af RNA / DNA fører til TAR / cTAR heteroduplex formation. 10,11 Som et resultat, er trin streng-overførsel under HIV-replikation begunstiget. 12
NC er et attraktivt mål for udviklingen af nye antivirale midler, idet potentiel interferens fremkaldt af små molekyler mod NC ville resultere i en reduktion af revers transkription af det virale genom som følge af en kompromitteret NC aktivitet. 2,13 Denne metode kunne sidste ende føre til udviklingen af vellykkede anti-HIV-midler. I løbet af en screening for NC hæmmere 14 udviklede vi et assay stole på de velkendte egenskaberaf nukleocapsid til effektivt destabilisere og Anneal komplementære oligonukleotider. 10,11 Vi kaldte det N ucleocapsid En nnealing- M ediated E lectrophoresis (navn) assay. NAME assay bruger NC at mediere annealing mellem stabilt strukturerede kopier af komplementære nukleinsyrer, i vores tilfælde af oligonukleotidet svarer til den apikale del af en TAR-RNA-sekvens med dens komplementære DNA-sekvens (cTAR) til opnåelse af hybrid TAR / cTAR heteroduplex . Analysen af TAR / cTAR annealing reaktion i nærvær af NC kan undersøges ved nativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE).
Denne protokol viser, hvordan man udfører NAME assay til hurtigt at anneale ved stuetemperatur oligonucleotider foldet i stabile hårnålestrukturer, hvordan man kan analysere resultatet af reaktionen og eventuel fejlfinding af eksperimentet. Der ikke anmodes radioaktiv mærkning af nukleinsyre, og Detectipå oligonukleotidprimere bånd kan udføres ved konventionelle farvningsmetoder. Assayet, der anvender enten det rekombinante protein med fuld længde eller et trunkeret syntetisk version af NC, tillader identifikation af gevindskæring interkalatorer hæmmer NC, en aktivitet vist sig at korrelere med en stærk binding til RNA og DNA. 14
Navn er et assay, som gør det muligt at hurtigt at vurdere inhibering af chaperone aktivitet nukleokapsidproteinet af HIV-1, et interessant mål i søgningen af hidtil ukendte anti-HIV-lægemidler. NC annealer hurtigt og ved stuetemperatur nukleinsyrer hvis stabil foldning ellers ville kræve termisk denaturering ved høj temperatur, efterfulgt af omhyggelig annealing. Analysen kan udføres med enten fuld længde NC eller med afskåret (12-55) NC: i begge tilfælde de to nukleinsyrer (RNA og dets komplementære DNA-kopi) er udglødet hurtigt. Dette er i overensstemmelse med litteraturen observation med det trunkerede NC peptid: annealing initieres af en effektiv smeltning af stilken af cTAR efterfulgt af interaktion af dens komplementære apikale loop, som er en svag NC bindingssted, med den komplementære sekvens af TAR apikale loop, ender gennem flere ustabile mellemprodukter til den udvidede udglødet hybrid. 21
NC er et meget stabilt protEin og få problemer, mens de udfører navn kunne forekomme. Det er meget vigtigt imidlertid at tilføje frisklavet SDS i Gel Loading Buffer anvendes til at standse reaktionen: Hvis dette ikke opnås, vil gelen ikke viser nukleinsyresekvenser bands ved de korrekte positioner. Faktisk NC er en nukleinsyre-bindende protein, så korrekt at visualisere TAR / cTAR heteroduplex ved gelelektroforese SDS skal være til stede i Gel Loading Buffer at denaturere proteinet og frigøre det fra dets tætte kompleks med nukleinsyrer. Dette er også en mulig fejlfinding af eksperimentet, dvs. dannelsen af forskudte bånd i gelen løb. Denne effekt er særlig tydelig, når fuldlængde NC blev anvendt som i figur 2, og er forbundet med tilstedeværelsen af det stærkt basiske N-terminal hale, der har en stærk aggregerende virkning på nukleinsyrer.
Tilstedeværelsen af terminalen grundlæggende hale gør annealingreaktionen sværere skal inhiberes, som vistn i figur 3 ved hjælp af forbindelse 1, en repræsentativ threading interkalator, dvs. en interkalator særligt effektivt at stabilisere hårnåle-strukturer af tjære og i cTAR. Faktisk er denne type af interaktion med nukleinsyrer stillede når buler og sløjfer afbryde dobbeltspiral kontinuitet, hvilket muliggør en lettere trådning af voluminøse substituenter i basepar. Stabilisering af tjære og cTAR disse nucleinsyre syrebindemiddel tidligere analyseret ved bestemmelse af stigning i smeltetemperaturen af de to oligonukleotider. 14 Endvidere stigning i smeltetemperatur korrelerer med inhibering af annealing katalyseret af HIV-1 NC, fører til reduceret dannelse af heteroduplex TAR / cTAR og indikerer, at gevindskæring interkalatorer er en interessant klasse af bindemidler til dynamiske strukturer af RNA, såsom TAR element. 14
Virkningsmekanismen påberåbes disse kompounds kan valideres yderligere ved at udføre NAME assay i forskellige alternative formater, som vist i Figur 4: i tilfælde af interkalatorer inhiberingen af udglødet heteroduplex er forbedret, når lægemidlet er inkuberet med to foldede oligoer. Forbindelser, der handler med forskellig virkningsmekanisme, såsom direkte bindemidler for NC-proteinet, vil være mindre påvirket af de forskellige forinkubering mode. NAME assay udført i de to metoder kan derfor anvendes til at screene biblioteker af forbindelser til identifikation af NC inhibitorer og også til at vurdere den formodede virkningsmekanisme af de positive hits under søgningen efter anti-HIV-lægemidler rettet mod NC. Det er klart, at brugen af disse teknikker alene, når hævder for en specifik virkningsmekanisme af identificerede NC-inhibitorer er ikke tilstrækkeligt, og andre egnede biokemiske assays er nødvendige for at opretholde arbejdshypotese. 14
Endelig skal det understreges, at NAME bruger megetoprensede enzymer, enten rekombinante eller syntetiske, giver værdifulde oplysninger om "in vitro" inhibering af NC af de testede forbindelser. Dette er den "styrke og svaghed" af analysen: Navnet kan godt supplement virtuel screening og molekylær modellering tilgange i de indledende trin i forskningsprogrammer, der gør det muligt hurtigt at opbygge og analysere struktur og aktivitet og til sidst omdirigere syntesen og udviklingen af lægemidler. Men som andre biokemiske assays anvendes i lægemiddeludvikling projekter i HIV, NAME vil ikke give oplysninger om virkningerne af formodede inhibitorer i virusinficerede celler.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
(12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |