Abstract
De embryonale nier van Xenopus laevis (kikker), de pronephros bestaat uit een nefron en kan worden gebruikt als model voor nierziekte. Xenopus embryo's groot extern ontwikkelen, en kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door micro-injectie of chirurgische procedures. Daarnaast zijn lot kaarten vastgesteld voor vroege embryonale ontwikkeling. Gerichte micro-injectie in individuele blastomere die uiteindelijk leiden tot een orgaan of weefsel van belang geven kan worden gebruikt om selectief overexpressie of neerslaan van genexpressie in deze beperkte regio afneemt neveneffecten in de rest van de ontwikkelende embryo. In dit protocol beschrijven we hoe u gebruik maken van gevestigde Xenopus lot toegewezen aan de ontwikkeling van Xenopus nier (de pronephros), door middel van micro-injectie te richten op specifieke blastomeren van 4- en 8-cellige embryo. Injectie van lineage tracers maakt verificatie van de specifieke targeting van de injectie.Na embryo's ontwikkeld stadium 38-40, whole-mount immunokleuring gebruikt om pronephric ontwikkeling visualiseren, en de bijdrage van doelcellen om het pronephros kan worden beoordeeld. Dezelfde techniek kan worden aangepast aan targeten andere weefseltypen naast de pronephros.
Introduction
De Xenopus embryonale nier, de pronephros, is een goed model voor het bestuderen nier ontwikkeling en ziekte. De embryo's ontwikkelen extern, zijn groot, kan worden geproduceerd in grote aantallen, en zijn gemakkelijk te manipuleren door middel van micro-injectie of chirurgische procedures. Bovendien worden de betreffende genen nierontwikkeling in zoogdieren en amfibieën geconserveerd. Zoogdieren nieren verder komt in drie fasen: de pronephros, mesonephros en metanefros 1, terwijl embryonale amfibieën hebben een pronephros en volwassen amfibieën hebben een metanefros. De basis filtering eenheid van deze nier vormen is het nefron, en beide zoogdieren en amfibieën vereisen dezelfde signaling cascades en inductieve evenementen om nefrogenese 2, 3 ondergaan. De Xenopus pronephros bevat één nefron bestaat uit proximale, tussengelegen, distale en buisjes verbinden, en een glomus (analoog aan het zoogdier glomerulus) 1, 4-6 (figuur 1 Xenopus pronephros maakt het geschikt als een eenvoudig model voor de studie van genen betrokken bij nier- ontwikkeling en ziekteprocessen.
Lot van de cel kaarten zijn vastgesteld voor de vroege Xenopus embryo's, en zijn vrij bij Xenbase 11/7 online beschikbaar. We beschrijven een techniek voor micro-injectie van lineage tracers voor de ontwikkeling Xenopus pronephros gericht, hoewel dezelfde techniek kan worden aangepast aan andere weefsels zoals het hart of ogen targeten. Lineage tracers zijn labels (zoals vitale kleurstoffen, fluorescent gelabelde dextranen, histochemisch detecteerbare enzymen en mRNA coderend fluorescerende eiwitten) die kan worden geïnjecteerd in een vroeg blastomeer, waardoor de visualisatie van de nakomelingen van die cel tijdens de ontwikkeling. Dit protocol maakt gebruik van MEM-RFP mRNA coderend membraan gerichte rood fluorescerend eiwit 12, een lijn tracer. De beoogde micro-injectie technieken voor individuele blastomeren in de 4- en 8-cellige embryo beschreven kunnen worden gebruikt voor injectie met morpholinos te breken genexpressie, of exogene RNA een gen van belang tot overexpressie. Door injecteren in de ventrale, vegetale blastomeer, vooral de pronephros van het embryo zal gericht, waardoor de contralaterale pronephros als ontwikkelings controle. Co-injectie van een tracer controleert of de juiste blastomere werd geïnjecteerd, en laat zien welke weefsels in het embryo is ontstaan uit de geïnjecteerde blastomere, het verifiëren van de gerichtheid van de pronephros. Immunokleuring van de pronephros maakt visualisatie van hoe goed de pronephric buisjes zijn gericht. Overexpressie en knockdown effecten kunnen dan worden gemaakt tegen de contralaterale zijde van het embryo, die als ontwikkelings- controle en kan worden gebruikt om de pronephric index 13 berekend. De beschikbaarheid die het lot maps toelaat gerichte micro-injectie technieken worden gebruikt om weefsels oth targetener dan pronephros en co-injectie van een fluorescente tracer kan de gerichte micro-injectie op elk weefsel vóór de analyse worden geverifieerd.
Tijdens embryo micro-injectie, dient ontwikkelings temperatuur strak gereguleerd, omdat de snelheid van Xenopus ontwikkeling sterk afhankelijk is 14. Embryo's worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (14-16 ° C) voor de 4- en 8-cell injecties omdat de ontwikkeltijd wordt vertraagd. Bij 22 ° C, ontwikkeltijd uit stap 1 (1 cel) naar fase 3 (4 cellen) ongeveer 2 uur, terwijl bij 16 ° C ontwikkelingstijd naar fase 3 ongeveer 4 uur. Het duurt ongeveer 15 minuten om een 4-cel embryo een 8-cel (stap 4) embryo bij 22 ° C, maar duurt ongeveer 30 minuten bij 16 ° C. Evenzo, bij 22 ° C duurt slechts 30 minuten voor een 8-cellige embryo op weg naar een 16-cel embryo (stap 5). Ditmaal echter 45 minuten bij 16 ° C. Dewaardo or, is het nuttig om langzaam de ontwikkelingssnelheid van de embryo voldoende voor injecties in het 8-cellig stadium schakelen voordat de embryo's ontwikkelen tot het 16-cellig stadium. Bovendien kan groeitemperatuur gemoduleerd versnellen of vertragen van embryonale ontwikkeling tot de nier volledig is ontwikkeld.
De epidermis van kikkervisje stadium Xenopus embryo's is relatief transparant, zorgen voor gemakkelijke beeldvorming van de ontwikkelingslanden pronephros zonder dissectie of clearing van het weefsel 15. Door de relatieve transparantie van embryonale ontwikkeling, live cell imaging is ook mogelijk 16,17. Whole-mount immunokleuring aan de pronephros visualiseren is mogelijk met gevestigde antilichamen die de proximale, tussengelegen, distale en het aansluiten van buisjes van het podium 38 labelen - 40 embryo's die het mogelijk maken voor de beoordeling van pronephric ontwikkeling na gerichte manipulatie van genexpressie in Xenopus embryo's 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston's Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, dat dient als de institutionele zorg en gebruik Comite (protocol #: HSC-AWC-13-135).
1. Identificatie en selectie van blastomeren voor-Kidney gerichte Injecties
- Voorafgaand aan productie embryo Gebruik Normal Table of Xenopus Development 21 de oriëntatie van de eerste celdelingen in het embryo begrijpen. Als alternatief, de toegang schema's van de vroege ontwikkelingsstadia van Xenopus op Xenbase 11.
- Toegang tot de interactieve Xenopus lot van de cel kaarten op Xenbase 11 om te selecteren welke blastomere zal worden gericht voor micro-injectie.
- Merk op dat de enkele cel embryo heeft een donkergekleurde dier paal en een vegetatieve pool, die is wit en Yolky. Merk op dat een beschermend membraan, bekend als de vitelline envelope, heeft het embryo.
- Merk op dat de eerste klieving treedt meestal tussen de linker- en rechterkant van het embryo. Deze cellen in gelijke mate bijdragen aan de pronephric afstamming.
- Merk op dat de tweede splitsing verdeelt de dorsale en ventrale helften van het embryo, waardoor een 4-cel embryo. De dorsale cellen zijn kleiner en hebben minder pigment dan de ventrale cellen (Figuur 2A en Figuur 3A).
- Identificeer de ventrale blastomeren (V, de grote donkere cellen) links en rechts, waarbij meer de ontwikkelende nier dragen dan de dorsale (D, kleine, lichte cellen) blastomeren (Figuur 2A).
- Als het injecteren in een 4-cel embryo, injecteer de linker ventrale blastomeer naar de linker nier (figuur 3A en deel 3) richten.
- De derde splitsing doorsnijdt de dierlijke en plantaardige kanten, waardoor een achtcellige embryo. Op dit moment zijn er vier dieren blastomeren [linker en rechter ventrale(V1) en dorsale (D1)] en vier plantaardige blastomeren [linker en rechter ventrale (V2) en dorsale (D2)] (Figuur 2B en Figuur 3B).
- Zoek het ventrale, plantaardige blastomeren (V2). Deze blastomeren meer bijdragen aan de ontwikkeling van nieren andere cellen in deze fase (Figuur 2B). Om de linker nier van een 8-cel embryo te richten, te injecteren in de linker V2 blastomere (Figuur 3B en hoofdstuk 3).
- Merk op dat de vierde en vijfde breuklijnen halveren van het dier en plantaardige blastomeren. Twee nageslacht wordt geproduceerd uit elk blastomeer, resulterend in een 16-cel embryo. De cellen worden genoemd naar hun voorganger. Bijvoorbeeld, de V2 blastomeer van het 8-cellig stadium ontstaat V2.1 en V2.2 nakomelingen op de 16-cellig stadium (figuur 2C). De V2.2 cel aan het 16-cellig stadium geeft de meerderheid van de cellen die bijdragen tot de ontwikkeling van nieren.
- Let op de zesde en zevende breuklijnen resulteren in een 32-cel embryO. Nogmaals, twee nakomelingen worden geproduceerd uit elk blastomere, die genoemd na hun voorganger. Bijvoorbeeld, de V2.2 blastomeer van de 16-cellig stadium leidt tot V2.2.1 en V2.2.2 bij de 32-cellig stadium. Er is een alternatieve naamgeving systeem de 32-cellig stadium waarin geïdentificeerd zijn in vier rijen A, B, C en D (van dieren bij plantaardig), en vier kolommen 1, 2, 3 en 4 ( van dorsale ventrale). Dus de V2.2.2 blastomeer, waarvan de meest bijdraagt aan de ontwikkeling pronephros, heet C3 onder deze alternatieve naamgeving (figuur 2D).
2. Voorbereiding van embryo's
- Bereid 50 ml Dejelly oplossing (2% cysteine, NaOH tot pH 8,0).
- Isoleer beide testes van een mannelijke kikker volgens standaardprotocollen 14. Plaats de testes in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml testes opslagoplossing (1x Marc's gemodificeerd Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% runderserumalbumine, 50 ug / ml gentamycine). Bewaar de testes bij 4 ° C.
Opmerking: Testes kan worden opgeslagen gedurende ongeveer 7-10 dagen bij 4 ° C, maar bevruchting efficiëntie zal afnemen hoe langer de testes werden vastgelegd. - Knijp een vrouwelijke kikker om eieren volgens standaardprotocollen 14 te verkrijgen. Verzamel de eieren in een 100 mm petrischaal. Giet het overtollige water.
- Snijd ¼ van een testis terwijl deze in Testikels Storage Solution behulp van een tang en een scheermesje. Transfer het stukje testis aan de petrischaal met eieren. Pas de grootte van de testis gebruikte gedeelte rekening voor de grootte van de testis, hoe lang de testis is opgeslagen, en hoeveel eieren worden bevrucht. Over het algemeen gebruiken ¼ tot 1/3 van een vers ontleed testis een koppeling van de eieren te bevruchten.
- Snijd de testis gedeelte in kleine stukjes met behulp van een tang en een scheermesje. Voeg genoeg 0.3x MMR+ 30 mg / ml gentamycine de petrischaal om de eieren te dekken. Swirl de BMR in de schaal te mengen.
- Wacht ongeveer 30 min voor de bevruchting te laten plaatsvinden bij kamertemperatuur. Merk op dat het dier hemisfeer (de gepigmenteerde zijde van het embryo) bovenop het embryo op effectieve bevruchting zitten. Verwijder vervolgens de BMR van de petrischaal met behulp van een overdracht pipet. Voeg genoeg Dejelly Solution om de schotel naar de embryo's te dekken.
- In de komende paar minuten zachtjes wervelen de schotel met tussenpozen. Krachtig schudden van de schotel op dit moment kunnen defecten as veroorzaken. De gelei laag op de embryo's zal oplossen, en de embryo's zullen samenkomen in het midden van het gerecht tijdens de wervelende. Zodra de embryo's sterk op elkaar raken in het midden van de schaal, verwijdert het Dejelly oplossing met een transferpipet. Niet embryo's in de Dejelly Solution vertrekken langer dan 5 minuten, of de embryo's kunnen worden beschadigd.
- Was de dejellied embryo 3-5 keer in 0.3xMMR + 30 mg / ml gentamycine door voorzichtig te gieten of pipetteren uit de BMR en het vullen van de schaal met nieuwe MMR. Niet alle MMR uit de schotel of het embryo kan worden beschadigd.
- Verwijder eventuele onbevruchte eieren of stukjes van testis van de petrischaal met behulp van een overdracht pipet.
- Incubeer embryo's tussen de 14 en 22 ° C.
Opmerking: Embryo's gekweekt bij lagere temperaturen langzamer ontwikkelen dan embryo's gekweekt bij hogere temperaturen. Timing van de ontwikkelingsstadia is te vinden op Xenbase 22.- Om ruimte hun ontwikkeling plaats helft van de embryo's van een enkele bevruchting in een petrischaal bewaard bij 14 ° C, en de andere helft van de embryo's in een petrischaal bewaard bij 18 ° C. Dit maakt twee injecties in 4-cel of 8-cel embryo's van een enkele bevruchting.
3. Bereiding van injectieoplossingen en Micro-injectie van embryo
- Bereid de injectie oplossing die 0,01ng / nl membraangebonden rood fluorescerend eiwit (RFP-MEM) mRNA 9 terwijl de embryo's ontwikkelen om de 4-cel of 8-cellig stadium. Bewaar de injectie-oplossing op ijs pas klaar om te injecteren.
- Laad een 7 "vervangingsglas capillaire buis in een naald trekker, waarbij de bovenkant van de vervangende buis uitgelijnd met de top van de naald trekker geval. Zet de warmte # 2 waarde 800, en uitschuifbare waarde 650. Druk de" pull "toets om de naald te trekken. Dit zal 2 naalden te maken van een enkele 7" glazen capillaire buis.
- Knip de punt van een naald getrokken met een paar Dumont tang.
Let op: Na het trekken van de naald, is de tip dichtgemaakt en moet worden opengesneden. Hoe dichter bij het punt van de naald die het uitsnijden hoe kleiner de diameter van de naald zijn. Hoewel de diameter van de punt niet van invloed op de injectievolume de micro-injectie systeem hier gebruikt, een tip met een grotere diameter is waarschijnlijk een embryo beschadigen. - Zet de micropipette Collet op de achterkant van de naald. Vervolgens zet de grote gat O-ring op de achterkant van de naald achter de kraag.
- Vul de naald met minerale olie met behulp van een 27 gauge injectienaald, zorg dat u luchtbellen in de naald niet te krijgen.
- Zet de naald op de plunjer van de microinjector, het plaatsen van de naald in het grote gat van de witte plastic spacer op de plunjer geïnstalleerd. De plunjer moet een kleine O-ring dichtst bij het lichaam van de microinjector, gevolgd door de blanke afstandhouder groot gat O-ring en spantang. Zet de naald door het aandraaien van de kraag. Trek voorzichtig aan de naald om ervoor te zorgen dat deze goed is beveiligd.
- Houd de "lege" knop op de microinjector regelkast tot er twee piepjes.
- Pipetteer 3 pi injectieoplossing op een stuk Parafilm. Steek de punt van de naald in de parel injectieoplossing op de Parafilm. Houd de "vullen" knop op de microinjector schakelkast aan de injectie oplossing in de naald te trekken.
- Vul een 60 mm petrischaal bekleed met 500 micron polyester gaas met 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine. Zorgvuldig pipetteren 20-30 april-cel of 8-cellige embryo in de schaal.
- Met behulp van een haar lus 14, manipuleren van de embryo's, zodat de blastomere te injecteren wordt geconfronteerd met de naald. Om de linker nier te richten, line-up van de embryo's, zodat de linker ventrale blastomeren van 4-cellige embryo's of links V2 blastomeren van 8-cellige embryo gezicht van de naald.
- Injecteer 10 nl injectieoplossing in de geselecteerde blastomeren van elk embryo in de schaal.
Opmerking: De mazen onderaan de petrischaal stabiliseert het embryo en stopt de rollen, waardoor ze worden geïnjecteerd zonder het gebruik van een haar lus te stabiliseren. - Transfer geïnjecteerde embryo's in putjes van een kweekplaat die worden opgevuld met 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine. Incubeer de geïnjecteerde embryos bij 16 ° C gedurende ten minste één uur, om het geïnjecteerde blastomeren te genezen.
- Breng de genezen embryo's in putjes van een nieuwe kweekplaat die worden opgevuld met 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycine per stadium 9 (voor gastrulatie).
- Incubeer de embryo's bij 14-22 ° C totdat het embryo bereiken stadium 38-40 21.
4. Fixatie en Immunokleuring van embryo's
- Bereid 50 ml MOPS / EGTA / Magnesiumsulfaat / formaline Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) formaldehyde].
- Met behulp van een overdracht pipet, zet 10-20 stadium 38-40 embryo's in een glazen flacon. Voeg 10 ul 5% benzocaïne in 100% ethanol aan de flacon en flacon omkeren om te mengen. Wacht 10 minuten om de embryo verdoven.
- Verwijder de MMR uit de flacon met behulp van een glazen pipet. Indien voor flesjes met meerdere tegelijk, kan de flesjes rechtop gehouden in een 24-well celcultuur plaat.
- Met een glas pijptte, vul de flacon met MEMFA. Plaats de flacon op een driedimensionale rocking platform gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder de MEMFA uit de flacon met een glazen pipet. Vul het flesje met 100% methanol. Plaats de flacon op een driedimensionale schudapparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap nog een keer, en de embryo's in 100% methanol gedurende de nacht opgeslagen bij -20 ° C.
- Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing-runderserumalbumine-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml bovine serum albumine, 0,1% Triton X-100.
- Bereid de primaire antilichaamoplossing: 1x PBT met 10% geit serum met een 1: 5 verdunning van monoklonaal antilichaam 4A6, een 1:30 verdunning van muis monoklonale antilichaam 3G8 (aan de membranen van de tussenliggende en distale tubuli verbinden 20 label) (etiket lumen van de proximale tubuli 20), en een 1: 250 verdunning van konijn polyklonaal antilichaam RFP (de MEM-RFP tracer label). Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid de secondary antilichaamoplossing: 1x PBT met 10% geit serum, 1: 500 Alexa 488 geit anti-muis IgG (stock concentratie 2 mg / ml; labelen 4A6 en 3G8), en 1: 500 Alexa 555 geit anti-konijn IgG (stock concentratie 2 mg / ml, om de MEM-RFP tracer label). Bewaren bij 4 ° C, die de buis folie ter bescherming tegen licht.
- U kunt ook het verzamelen van de primaire en secundaire antilichamen na kleuring, en op te slaan bij 4 ° C voor hergebruik in toekomstige experimenten. Als het antilichaam moet worden opgeslagen voor hergebruik, voeg 0,01% natriumazide.
- Immunostain de embryo behulp vastgestelde protocollen 18.
5. Visualisatie van embryo's en analyse van Gerichte Pronephric Tissue
- Zeef de immunostained embryo's om te controleren of de juiste blastomere werd geïnjecteerd door het bekijken van de fluorescentie van de tracer onder een tl-stereomicroscoop bij 1X (op hele embryo te zien) en 5X vergroting (tot nier bekijken). Plaats embryo in een multi-well glasplaat met de weLLS gevuld met 1x PBT met behulp van een overdracht pipet met de tip afgesneden. Manipuleren van de embryo's met een haar loop. Gebruik alleen embryo's die de co-geïnjecteerde tracer in de pronephros aan de linkerzijde van het embryo hebben (figuur 3C, F en figuur 4C, F) overexpressie of knockdown analyse.
- Als alternatief duidelijk de embryo's in Murray's Clear (2 delen benzylbenzoaat: 1 deel benzylalcohol) door het plaatsen van de embryo's in een glazen flesje en het vullen van de flacon met Murray's Clear. Visualiseer de embryo's met behulp van een glazen plaat goed.
Opmerking: Murray's Clear is een organisch oplosmiddel, en moet met zorg worden behandeld. Draag handschoenen, en alleen gebruik maken van glazen flesjes en pipetten met Murray's Clear. - WINKEL embryo bij 4 ° C in 1x PBT gedurende 2-3 weken. Voor langdurige opslag van embryo, dehydrateren de embryo's door tweemaal in 100% methanol wassen bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Bewaar de embryo's bij -20 ° C in 100% methanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micro-injecties van 4- en 8-cell Xenopus embryo's met MEM-RFP mRNA tonen verschillende richten naar de pronephros. Figuur 4 toont stage 40 embryo's met correcte MEM-RFP mRNA expressiepatronen. Embryo's werden geïnjecteerd in de linker ventrale blastomeer (figuur 4A) en gesorteerd voor de goede expressiepatroon van MEM-RFP mRNA. Naast expressie MEM-RFP in de proximale, tussenliggende en distale tubuli van de nier verbinden, correct geïnjecteerde embryo wordt naar fluorescentie vertonen in de epidermis van hoofd, romp en staart. Zij moeten ook fluorescentie in de otocyst, cement klier, proctodeum en somieten (figuur 4C) tonen. De verdeling van MEM-RFP fluorescentie in de nieren van 8 goed geïnjecteerde embryo's werd bepaald met een fluorescentie stereomicroscoop (figuur 4B). Embryo's met hoge MEM-RFP expressie in de epidermis dieblokkeerde de detectie van nier regio werden als "afgesloten". MEM-RFP expressie werd gedetecteerd in de proximale, tussenliggende en distale tubuli verbinden van alle embryo's die werden niet gescoord als afgesloten. Stereoscoop (Figuur 4D-F) en confocale microscopen (Figuur 4G-I) werden gebruikt om de co-lokalisatie van MEM-RFP en nierweefsel immunologisch gekleurd met 3G8 en 4A6 verifiëren. Confocale beeldvorming verifieerde de co-lokalisatie van MEM-RFP de proximale, tussenliggende en distale verbinden tubuli van de nier, hetgeen aangeeft dat micro-injectie van MEM-RFP in de linker ventrale blastomeer correct gericht op de nieren.
Embryo geïnjecteerd met MEM-RFP mRNA in het 8-cellig stadium (figuur 5A) tonen een geringer aantal weefsels tonen fluorescentie, wat aangeeft dat 8-cell injecties verminderen de kans op secundaire effecten op de nieren. Net als embryo geïnjecteerd in het 4-cellig stadium, embryos geïnjecteerd op het 8-cellig stadium toont fluorescentie in de proximale, tussenliggende en distale verbinden tubuli van de nier, evenals de somieten en proctodeum (Figuur 5C-F). In tegenstelling tot embryo geïnjecteerd in het 4-cel fase worden het cement klier en otocyst niet gelabeld met MEM-RFP. Van 10 doelgerichte embryo een embryo vertoonde MEM-RFP in bijna alle van de proximale tubuli en 3 vertoonden MEM-RFP in bijna alle tussenliggende en distale tubuli van de nier (figuur 5B). De verbindende tubuli van 7 embryo's werden gedeeltelijk gelabeld met MEM-RFP. Bovendien, de nieren van embryo geïnjecteerd in het 8-cellig stadium makkelijker te visualiseren, en slechts één werd gescoord als afgesloten. Co-lokalisatie van MEM-RFP en antilichamen labelen van de nier (3G8 en 4A6) werd bepaald met een stereomicroscoop (Figuur 5D-F), en geverifieerd met behulp van een confocale microscoop (Figuur 5G-I). De proximale, tussenliggende en distale verbinden tubules van de nier werden gelabeld met MEM-RFP embryo geïnjecteerd op het 8-cellig stadium, aan te tonen dat gerichte injectie van de V2 blastomeer labelt de nier terwijl het tonen fluorescentie in minder weefsels dan embryo geïnjecteerd in de linker ventrale blastomeer in de 4-cell stadium.
Deze test maakt gebruik van een fluorescent gelabeld mRNA als tracer aan te geven welke weefsels doelwit van micro-injectie. Het is belangrijk om embryo consistente tracer lokalisatie vóór screenen analyse en alle embryo's die de verwachte tracer verdelingspatroon niet weergegeven moet worden weggegooid. Figuur 6 toont een voorbeeld van een stage 40 embryo elke verkeerd gericht met MEM-RFP mRNA in het 4-cellig stadium. MEM-RFP mRNA bevindt zich aan de rechterkant van het embryo in plaats van links (figuur 6A). Bovendien zijn de meeste van de mRNA expressie in de huid van de onderste romp en staart, metweinig expressie in de somieten. Geen mRNA-expressie wordt gezien in de proximale, tussenliggende en distale tubuli aansluiten (figuur 6B), bevestigd onjuiste gerichtheid van de nier. Daarom moet deze embryo niet worden gebruikt voor analyse.
Figuur 1:. Xenopus embryonale Kidney Diagram van de nier van een stadium 35 Xenopus embryo, waarin de proximale, tussengelegen, distale en buisjes verbinden. Gebaseerd op Raciti et al. (2008) 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Xenopus Maps Fate Embryonale. Fate kaarten identificeren en benoemen van de blastomeres die bijdragen aan de ontwikkeling van pronephros. A) kaart lot van een 4-cel embryo. B) kaart van een 8-cel embryo Fate. C) Fate kaart van een 16-cellige embryo. D) Fate kaart van een 32-cellige embryo. Blastomeren van de 32-cel embryo's worden ook gelabeld met een alternatief blastomere naamgeving systeem. Fate kaarten gebaseerd op Moody (1987) 8, 9 en Moody en Kline (1990) 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Injection Regeling Gericht op de Xenopus Pronephros Rode pijlen geven de cel te injecteren. A) Dier en ventrale uitzicht op een 4-cel embryo toont injectie van de linker ventrale blastomere naar links pronephros targeten. Rode pijlen geven de linker ventrale blastomere. B) Dier en ventrale uitzicht op een 8-cel embryo waaruit de injectie van de linker V2 blastomeer naar links pronephros richten. Rode pijlen geven de linker V2 blastomere. AB) Beelden van embryo's genomen op een stereoscoop op 4x vergroting. Injecties op basis van de Xenopus lot kaarten ontwikkeld door Moody (1987) 8, 9 en Moody en Kline (1990) 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Voorbeelden van embryo's gericht op de 4-cels Stage immunostained stadium 40 Xenopus embryo's toont gerichte injectie aan de linkerkant pronephros op de 4-cel stadium met behulp van MEM-RFP mRNA als een tracer. MEM-RFP labelscelmembranen rood. A) schematische weergave van injectie van MEM-RFP mRNA in de linker ventrale blastomere van een 4-cel embryo. B) weefsellokalisatie MEM-RFP fluorescentie in de nieren van goed geïnjecteerde embryo. C) Stage 40 embryo geïnjecteerd met MEM-RFP in de linker ventrale blastomeer op de 4-cel stadium. MEM-RFP lokalisatie rood wordt weergegeven, terwijl de nier groen gelabeld. 1x vergroting. D) Kidney gekleurd met 3G8 het lumen van de proximale tubuli label en 4A6 aan de membranen van cellen te labelen in de tussenliggende en distale tubuli verbinden. 5X vergroting. E) Uitbreiding van de regio in de nier tonen MEM-RFP lokalisatie. 5X vergroting. F) Samengevoegd beeld dat co-lokalisatie van de MEM-RFP tracer met de nieren. 5X vergroting. CF) Beelden van embryo's genomen met een Olympus DP71 camera op een stereoscoop. G) Confocale beeld van de nier van een tweede embryo gekleurd met 3G8 en 4A6. H) lokalisatie van de MEM-RFP in de nieren en het omringende weefsel. I) Samengevoegd image showing co-lokalisatie van MEM-RFP, 3G8 en 4A6 in de nieren. GI) confocale beelden met behulp van een maximale projectie op een vergroting van 20x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Voorbeelden van embryo Gericht op het 8-cellig stadium immuno stadium 40 Xenopus embryo tonen gerichte injectie links pronephros het 8-cellig stadium middels MEM-RFP mRNA als een tracer. MEM-RFP labels celmembranen rood. A) schematische weergave van injectie van MEM-RFP mRNA in de linker V2 blastomere van een 8-cel embryo. B) weefsellokalisatie MEM-RFP fluorescentie in de nieren van goed geïnjecteerde embryo. C) Stage 40 embryo geïnjecteerd met MEM-RFP links V2 blastomeer het 8-cellig stadium. MEM-RFP localisatie is weergegevenrood, terwijl de nier groen gelabeld. 1x vergroting. D) Kidney gekleurd met 3G8 het lumen van de proximale tubuli label en 4A6 aan de membranen van cellen te labelen in de tussenliggende en distale tubuli verbinden. 5X vergroting. E) Uitbreiding van de regio in de nier tonen MEM-RFP lokalisatie. 5X vergroting. F) Samengevoegd beeld dat co-lokalisatie van de MEM-RFP tracer met de nieren. 5X vergroting. CF) Beelden van embryo's genomen met een Olympus DP71 camera op een stereoscoop. G) Confocale beeld van de nier van een tweede embryo gekleurd met 3G8 en 4A6. H) lokalisatie van de MEM-RFP in de nieren en het omringende weefsel. I) Samengevoegd beeld dat co-lokalisatie van MEM-RFP, 3G8 en 4A6 in de nieren. GI) confocale beelden gemaakt met behulp van een maximale projectie op een vergroting van 20x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeld van een embryo ten onrechte gericht op de 4-cel stadium immunostained stadium 40 Xenopus embryo toont onjuiste targeting van de linker pronephros op de 4-cel stadium met behulp van MEM-RFP mRNA als een tracer.. MEM-RFP labels celmembranen rood. A) Stage 40 embryo toont onjuiste verdeling van de MEM-RFP indicatief voor injectie in de verkeerde blastomere. Naast het hebben van onjuiste verdeling aangeeft tracer injectie in de verkeerde blastomere, was dit embryo geïnjecteerd rechts. 1x vergroting. B) Samengevoegd beeld van de nier met een gebrek aan co-lokalisatie van MEM-RFP met antilichamen labelen van de nier (3G8, 4A6). 5X vergroting. AB) Beelden van embryo genomen op een stereoscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gericht op de pronephros van het ontwikkelen van Xenopus embryo's baseert zich op het identificeren en het injecteren van de juiste blastomere. Injectie van de V2 blastomeer 8-cellige embryo richt zich op de linker pronephros 18. Dit laat de contralaterale rechter pronephros als een interne controle. Als morfolino knockdown of RNA overexpressie wordt gebruikt om nierontwikkeling veranderen, kan de contralaterale rechter pronephros worden gebruikt om de effecten van gen knockdown of overexpressie van de linkerzijde pronephros. In dit geval moeten de juiste controles zoals een mismatched controle morfolino of dominant negatieve RNA construct worden gebruikt naast de contralaterale interne controle om de resultaten van veranderingen in genexpressie te analyseren. Door de relatieve transparantie van de Xenopus embryo kan nierafwijkingen gemakkelijk gekwantificeerd worden met verschillende technieken. Bijvoorbeeld kan knockdown gen of overexpressie eenvoudig worden gekwantificeerd door het berekenen van de index pronephric embryoimmunologisch gekleurd met antilichaam 3G8 13, die de ontwikkeling van de proximale tubuli van de ingespoten controle zijden van het embryo vergelijkt. Naast het bestuderen pronephric ontwikkeling Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere weefsels targeten door op de juiste blastomere te injecteren met goedgekeurde lot kaarten 7-10. Naast het richten andere weefseltypen, kan dit protocol ook worden gebruikt om nierontwikkeling in verschillende stadia bestuderen. Dit protocol keek stadium 40 embryo's gekleurd met antilichamen 3G8 en 4A6, die gedifferentieerd nierweefsel detecteren. Jongere embryo kan immuungekleurd met verschillende antilichamen nier- of onderworpen aan in situ hybridisatie 5, 6, 20. Zo kan het antilichaam LIM1 ontwikkelingslanden pronephros sporen 21, 22. Evenzo LIM1, PAX8 chromosomale en hnf1- β transcripten worden gedetecteerd met in situ hybridisatie vanaf stadium 12,5 22-24 in situ hybridisatie markers kunnen worden gebruikt om verschillende gebieden van de nier te detecteren in latere ontwikkelingsstadia. Bijvoorbeeld probes ontworpen voor expressie van nphs1, clckb, slc5a1 en atp1a1 detecteren de glomus, distale en buisjes, proximale tubuli en de gehele nier verbinden respectievelijk zijn beschreven 25, 5, 26, 27. De beoordeling van de nier meerdere fasen met verschillende antilichamen of in situ analyse moet zorgen voor een beter begrip van hoe een behandeling verandert nierontwikkeling.
Een cruciaal aspect van dit protocol is de juiste selectie en identificatie van de blastomeren te injecteren. In dit protocol beschrijven we hoe u de pronephros richten door het injecteren van de linker V2 blastomere 8-cel embryo's of de linker ventrale blastomere van 4-cellige embryo's. Als het verkeerde blastomere wordt geïnjecteerd, pronephros niet juist gericht. Daaromis van cruciaal belang om vertrouwd te raken met de ontwikkeling en cel splitsing vliegtuigen van vroege Xenopus embryo's voorafgaand aan de micro-injectie 28 geworden, heeft 29. Embryo splitsing niet altijd volgen de gevestigde ontwikkelingsfase charts, dus het is handig om alleen te injecteren embryo's waarin de vroege cel breuklijnen kijken "normaal" en de juiste blastomere kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Dit zal het aantal embryo's die niet goed is gericht te verlagen. Bovendien is het ook belangrijk dat de blastomeren van het embryo volledig worden verdeeld op het moment van injectie. Als bijvoorbeeld de splitsing tussen blastomeren V1 en V2 van een 8-cel embryo niet volledig voor micro-injectie, kan de tracer verspreiden in V1 en V2. Dit zou de richtende efficiëntie van de micro-injectie te verminderen, en de resulterende embryo tracer zodat meer lijkt op die van een embryo geïnjecteerd op de 4-cellig stadium plaats van de 8-cellig stadium lijkt tonen.
Eenandere kritische deel van dit protocol is de verificatie dat pronephros correct is doelwit van micro-injectie. Dit moet voorafgaand aan het analyseren pronephric ontwikkeling worden gedaan, omdat embryo's die nog niet de pronephros doelgerichte kan de resulterende dataset scheef gehad. Om een goede targeting controleren, analyseren van de tracer verstrekking in elke geïnjecteerd embryo. De geïnjecteerde (linker) zijde van het embryo zou de overgrote meerderheid van de fluorescerende tracer geven. Wanneer de besturing (rechts) van de embryo toont een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie, dan embryo moet worden weggegooid. Als dit gebeurt, was ofwel de onjuiste blastomere geïnjecteerd, of de geïnjecteerde blastomere nog niet voltooid gesplitst vóór de injectie. Tweede fluorescentie op de geïnjecteerde (linker) zijde van het embryo moet correct richten op de pronephros. Indien het embryo in het 8-cellig stadium, de dorsale en ventrale somieten, zijplaat, dikke darm, proctodeum, geïnjecteerd huid van de romp en de neurale lijst in de kofferbak verwacht griep tonenorescence naast de pronephros 6, 29. Naast de genoemde voor de 8-celinjectie weefsels, embryo geïnjecteerd op de 4-cellig stadium moet bredere verdeling van de fluorescerende tracer in de huid en somieten Tegelijkertijd trachtte het hebben cement klier, otocyst, lens en olfactorische placode. Wanneer het embryo de juiste weefseltargeting niet weergeeft, moet worden verwijderd vóór de analyse (figuur 5).
De beoogde injecties beschreven in dit protocol een middel van het manipuleren van genexpressie in een gewenst weefsel. Een beperking van deze techniek is dat hoewel deze injecties zijn gericht, en niet alleen de ontwikkeling nier beïnvloeden. De 4- en 8-cell injecties in deze techniek beschreven doeltreffender dan injecties uitgevoerd bij de eencellige stadium waarin genexpressie zal veranderen in het gehele embryo en injecties gedaan bij de twee-cellig stadium, waarbij de helft van de embryo displays veranderde gen expression. Ze doen echter niet richten op slechts één weefsel. Hoewel injecties in de ventrale blastomeren van 4-cellige embryo en V2 blastomeren van 8-cellige embryo wijzigen genexpressie in de pronephros, zij veranderen ook genexpressie in andere weefsels. Andere aangetaste weefsels onder de huid, somieten, gut, en de neurale lijst. Daarom is het belangrijk om te begrijpen dat hoewel 4- en 8-cell injecties zijn doeltreffender dan één of twee injecties cel, ze nog steeds genexpressie in verschillende weefsels te veranderen. Naast het injecteren van embryo's in het 4- en 8-cel stadium kan injecties worden uitgevoerd op de 2-, 16-, en 32-cel stadium. Embryo geïnjecteerd op de 2-cellig stadium zal een breder scala van weefsels getroffen dan embryo geïnjecteerd in latere stadia hebben. Hoewel er meer technisch uitdagende, zal embryo geïnjecteerd op de 16- en 32-cell etappes een kleiner bereik van weefsels aangetast dan embryo geïnjecteerd op de 4- en 8-cell etappes hebben.
De MEM-RFP lijn tracer wordt gebruikt in dit protocol om een goede targeting controleren na micro-injectie. MEM-RFP mRNA labels celmembranen nadat de cellen eiwit vertaald uit de geïnjecteerde RNA. De concentratie van de MEM-RFP lijn tracer gebruikt in dit protocol (0,1 ng van MEM-RFP mRNA in een 10 nl injectie) moet worden gewijzigd als nodig is om rekening te houden met embryonale sterfte en de gewenste intensiteit van de tracer fluorescentie. Naast het wijzigen van de hoeveelheid afstamming tracer geïnjecteerd, een ander geslacht tracer, zoals rhodamine-dextran, quantum dots, of histochemisch detecteerbare β-galactosidase, worden gebruikt in plaats van MEM-RFP. Lineage tracers worden meer verdunde als de cellen delen, waardoor de niveaus van fluorescentie af te nemen naarmate de embryo zich ontwikkelt. Een extra toepassing van deze techniek is om samen te injecteren een exogeen RNA of morfolino de lijn tracer aan overexpressie of slopen de expressie van een gen van interesse. De afstamming tracer wordt gebruikt om de juiste afstemming van de pronephros te controleren, maar nietaan te geven waar gezamenlijk geïnjecteerd exogeen RNA of morfolino lokaliseert in het embryo. Exogene RNA en morpholinos mag niet verspreid door de geïnjecteerde blastomeer tegen hetzelfde tarief als de co-geïnjecteerde tracer, die kunnen leiden tot de dochter cellen die de tracer, maar niet de exogene RNA of morfolino aanwezig 30 te hebben. In feite hebben we geconstateerd dat twee verschillende RNA constructen geïnjecteerd in een enkele cel niet altijd samen lokaliseer (ongepubliceerde gegevens). Daarom aanwezigheid van de tracer in een cel niet noodzakelijk dat het co-injectie exogeen RNA of morfolino is altijd aanwezig in die cel.
Dit protocol Gegevens een procedure voor het richten microinjectie de blastomeren die tot de pronephros ontwikkelen Xenopus embryo geven. Genexpressie wordt vaak gemanipuleerd in Xenopus embryo's door middel van injectie morpholinos of exogene RNA, welke beide kunnen voorkomen oorzaak vroege ontwikkelingsanomalieën geval van injectie in één oftwee-cel embryo's. Embryo geïnjecteerd ééncellig stadium vertonen overexpressie of knockdown in alle cellen van de ontwikkelende embryo. Indien het gen vlot te vroege ontwikkelingsprocessen is, kan de embryo ontwikkelde geen pronephros. Injecties uitgevoerd in een later stadium, zoals de 8-cell injecties hier beschreven, kan leiden tot embryo's die gastrulatie en eventuele ontwikkeling pronephric 18 ondergaan. Derhalve kan de beoogde injecties besproken de gastrulatie defecten veroorzaakt door verandering van de expressie van bepaalde genen te overwinnen, zodat het embryo om de voortgang door pronephric ontwikkeling. In de toekomst kan dit protocol worden gebruikt CRISPR constructen gewenste blastomeren targeten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health subsidie NIDDK (K01DK092320) en het opstarten van de financiering van de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Texas McGovern Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
