Introduction
乳癌死亡率の主要な原因は、転移1,2を介してです。例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセルのようなタキサンは、現在、転移性乳癌2、3、4、5、6の処置における第一選択レジメンとして使用されます。彼らは、微小管ダイナミクスを混乱させる微小管標的とするエージェント（MTA）のグループの一部です。しかし、治癒的療法にタキサンを使用する最大の課題の一つは、疾患再発7につながる、癌細胞におけるタキサン耐性の発生です。薬剤耐性は、転移性乳癌7患者における全死亡の90％以上を占めています。
微小管は、α-およびβチューブリンヘテロ二量体の重合により形成されていますクラス= "外部参照"> 8、9。微小管動態の正確な調節は、細胞の分極、細胞周期の進行、細胞内輸送、および細胞シグナル伝達を含む多くの細胞機能にとって重要です。微小管およびそれらの力学の調節不全は、細胞機能を破壊し、細胞死10、11をもたらします。彼らは、この調節不全を引き起こす方法に応じて、MTAの薬物は、微小管安定化剤（ 例えば、タキサン）または微小管destabalizing剤（ すなわち、ビンカアルカロイドまたはコルヒチン部位結合剤）20のいずれかに分類することができます。微小管の質量に対するその反対の効果にもかかわらず、十分な用量で、両方のクラスは、微小管ダイナミクス21への影響を介してがん細胞を殺すことができます。
主につながる、微小管スピンドル12を安定化させることにより、タキサン機能染色体不整列。紡錘体チェックポイント（SAC）のその後の永遠の活性化は、有糸分裂中の細胞を逮捕します。長時間の有糸分裂の停止は、その後アポトーシス13、14が発生します 。タキサンは、組み立てられたチューブリン16にのみ存在するβチューブリン8、15、上タキサン結合部位を介して微小管と相互作用します。
タキサン耐性のための複数のメカニズムは、 図9に示すように 、17が提案されています。これらのメカニズムは、原因薬剤排出タンパク質の過剰発現およびタキサン固有抵抗5への一般的な多剤耐性、9、18、19の両方が含まれます。例えば、タキサン耐性癌細胞は、特定のβ-浴槽の発現および機能が変化していてもよいですグロブリンは、5、9、19、20、21、22、23をアイソタイプ。微小管の動的不安定性を測定するためのin vivo法を用いて、我々は、非耐性、親MCF-7 CCセル 17と比較した場合、ドセタキセル耐性MCF-7 TXT細胞の微小管の動態は、ドセタキセル治療に非感受性であることを示しています。
より良いのMTAの機能と癌細胞におけるタキサン耐性の正確なメカニズムを理解するためには、微小管動態を測定することが不可欠です。ここで、我々はそうすることのin vivo法を報告しています。細胞中のGFPタグ付きチューブリンの発現と組み合わせてライブイメージングを用いて、我々は、MCF-7 TXTおよびMCF-7 CC細胞ととWiの微小管動態を測定することができますドセタキセル治療thout。結果は、私たちは、タキサン抵抗性を克服することができ、より効果的な薬物を設計するのに役立つことができます。
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Protocol
1.ライブイメージング用の細胞を準備
- 細胞培養および播種
- ドセタキセル（MCF-7 TXT）及びその非耐性の親細胞株（MCF-7 CC）に対する耐性について選択されたMCF-7乳癌細胞を使用します。詳細な選択プロセスおよびこれらの選択された細胞株の特徴づけは、以前24に記載しました。
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）及びウシ胎児血清（FBS）10％90％からなる非必須アミノ酸を補充した培地中で、37℃で10cmの培養皿内のすべての細胞を増殖させます。 5％CO 2雰囲気中で培地を維持します。 5 nMのドセタキセルでMCF-7 TXT細胞を維持します。
- ライブイメージングのためのカバースリップ上にシード細胞。 70％アルコールでそれらをすすぎ、次いで一晩UVへの露光24によってmmのポリ-L-リジンでコーティングしたカバーガラスを滅菌します。 35ミリメートルの6ウェル培養プレートにカバースリップを置きます。 PL各ウェル中のエース1カバーガラス。
- 10 cmの培養皿から培地を除去し、PBSで細胞を洗浄。皿から細胞を剥離するために皿にトリプシンEDTAの0.5 mLを加え。細胞の剥離、次のトリプシンを中和するために皿に培地の5ミリリットルを追加します。
- 単位体積あたりの細胞の数を決定するために、血球計数器で細胞を数えます。
- 各ウェルの単位体積当たりの細胞数に基づいて、およそ10 5個の細胞を加えます。静かに振とうした後、細胞をカバーグラスに付着することを可能にするためにインキュベーターにバックプレートを置きます。
- GFPタグ付きαチューブリンの発現
- 微小管ダイナミクスをアッセイするために、製造業者のプロトコルに従って、商業GFP伝達制御（ 例えば、BacMamによって）でGFPタグ付きαチューブリンで細胞を形質導入します。
- 37℃の細胞培養インキュベーター中で36時間、ウェル中の細胞は、COM可能にする培養plete接着および60％のコンフルエンス。
- 次式に従って、各ウェルに追加するには、GFPタグαチューブリンの適切な量を計算します。
細胞数は、標識の際にウェルの細胞の推定総数であり、所望のPPCは、セル当たりの粒子数です。
注：MCF-7細胞を播種は20の所望のPPCと10 5〜2×10から細胞数を倍増している必要があり、各カバースリップに必要な量は、したがって、40μLです。異なる細胞については、上記の式に基づいて算出ボリュームが最善ではないかもしれません。正確な量は、GFP-チューブリンの実際の発現レベルに応じて調整する必要があります。 - 均一な溶液を確保するために反転させることによって、GFPタグ付きαチューブリンを数回混ぜます。ボルテックスしないでください。
注：コントロールのために、ヌル（コントロール）試薬は、任意の哺乳動物の遺伝子を欠いています要素とは、潜在的なバキュロウイルス媒介性効果とバックグラウンド蛍光を決定するのを助けるために使用することができます。非標的GFP伝達制御もセル全体を点灯しており、使用することができます。 - 新鮮な培地で培養液を交換してください。各ウェルに新しいメディアの2 mLおよびGFPタグ付きαチューブリンの40μLを追加します。
- 培養培地でGFPタグαチューブリンの完全な混合を可能にするために、静かにプレートを振ります。培養プレートをインキュベーターに戻し、GFPチューブリンの発現を可能にするために、24時間インキュベートします。
- ドセタキセルで細胞を扱います
注：この実験は、微小管動的不安定性に対するドセタキセルの効果をテストすることです。したがって、細胞は、ドセタキセルの所望の濃度で処理しました。- DMEM 90％FBSおよび10％を構成し、非必須アミノ酸を補充した培地を調製。フェノールレッドはfluorescenに干渉する可能性があるため、フェノールレッドを含まないDMEMを使用しますGFPチューブリンのCE。 （10 nMの〜10μMの範囲）ドセタキセルの所望の濃度を追加します。ドセタキセルの原液をジメチルスルホキシド（DMSO）中10mMです。
- 組織培養インキュベーター中で37°Cにドセタキセル含有培地を予め温めます。
- ドセタキセル含有培地での通常の培養培地を交換し、組織培養インキュベーター中で30分間インキュベートします。各ドセタキセル濃度についてウェルあたり少なくとも3カバースリップがあるはずです。
2.ライブイメージングは、微小管の動的不安定性を検査します
- システムのセットアップ
- 37℃、5％CO 2に維持し、チャンバ内の実験を行います。倒立蛍光顕微鏡にCCDカメラで60X、1.42 NA油の対物レンズを搭載した顕微鏡システムを用いて、時間経過により蛍光画像を取得します。
- ライブイメージングのための細胞を設定します。プリ暖かい両方の試料ホルダーと37°Cまでの媒体。調べるために、カバースリップを選択してください。試料ホルダーに関心のカバースリップをマウントして、ステップ1.3.1で製造したドセタキセル含有培地1mLでそれをインキュベートします。
- 微小管動的不安定性のライブイメージング
- イメージングのために使用される細胞を同定します。彼らは、平坦で発現したGFP-チューブリンの高い蛍光強度を持ち、明確な微小管構造を有していなければなりません。
- まず調べるために、ステップ2.2.1から同定された細胞の群からの1つのセルを選択します。同定された細胞の周辺領域に焦点を当てています。露光時間と画像取得の頻度のためのプログラムを設定します。露光時間は、通常0.5秒であるように、画像は、あらゆる2つのSを取得します。
- 1.33から2.2.3へのステップのための追加の20分を許可します。このように、正確に50分ドセタキセルを加えた後、ステップ1.3.3で説明したように、（これは標準化のためである）イメージングを開始します。
- 微小管dを記録しynamics 2分間、写真ごとに2秒を取ります。合計では、同定された細胞のための60の画像を取得します。
- 次の識別されたセルに移動し、手順を繰り返し2.2.4に2.2.2。 5個の細胞が撮像されるまでの手順を繰り返します。時間は、ドセタキセルの添加後70分に到達する前に、ステップ1.3.3に記載のように、これを行うことが不可欠です。
- 各処理条件については、繰り返しは3つの異なるカバースリップのために2.2.5に2.2.1を繰り返します。合計では、画像15細胞、十分なデータが微小管の動的不安定性を測定することです。
3.画像処理およびデータ解析
- 画像のデコンボリューション
- 高品質を達成するために取得した画像をデコンボリューション。顕微鏡システムを装備したデコンボリューションプログラムを開きます。
- 「プロセス」をクリックして選択し、 "逆畳み込みを。」 「入力」ウィンドウに画像ファイルをドラッグし、クリックして "Doを」画像ファイルは、デコンボリューション、およびれますデコンボリューションファイルは自動的に新しいファイルとして保存されます。
- 動画の生成
- 装備ソフトウェアで開くように復元画像ファイルをクリックします。
- 「ファイル」をクリックして選択し、「ムービーとして保存します。」 「AV」と「アニメーションスタイル」と「ムービーのフォーマット」を選択し「進みます。」 「100％」から「圧縮品質」と「フレームレート」を設定します "5 /秒。」
- 「時間を通してアニメイト」のボックスをチェックして、クリックして "それをしなさい。」ビデオが生成されます。
- 微小管の短縮と成長率の測定
- 測定に使用される微小管を同定します。各セルについて、ほんの数微小管は、その短縮や成長がはっきりと完全に従っていることができるようになります。
- 微小管Aの開始長さを示すフレームを識別するために、ビデオの各フレームを調べますndはほとんどの延長または短縮微小管とフレーム。 2微小管と2フレーム間の経過時間と長さの変化を測定します。
- 時間によって長さの変化を分割することによって増殖または短縮の速度を計算する（単位はミクロン/ sです）。各処理条件については、少なくとも10個の細胞に従うと、少なくとも20微小管を測定します。
- 各処理条件に対する平均と標準誤差を計算します。学生の試験を使用して条件間の統計的差異を分析します。表中および/またはグラフ内のデータを報告します。
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Representative Results
ここに提示されたプロトコルを使用して、我々は、通常の微小管動態（MCF-7 CC）とドセタキセル耐性（MCF-7 TXT）乳癌細胞に対するドセタキセルの効果を研究しました。画像の二組は、MCF-7 CC及びMCF-7 TXT細胞 （ 図1A）における微小管の成長と短縮にドセタキセル（0.5μM）の効果を示します。
我々はまた、2つの細胞株のために、これらの条件下で微小管の成長または短縮率を計算し、0.5μMで、ドセタキセルを強くMCF-7 CC細胞のチューブリン動態なく、MCF-7 TXT細胞 （ 図1B）を阻害することを示しました。
図1： 微小管動的にドセタキセルの効果MCF-7 TXTおよびMCF-7 CC 細胞のS。記載されているようにライブイメージングを行いました。 （A）1時間0.5μMドセタキセルで処理した後のMCF-7 CC及びMCF-7 TXT細胞における微小管ダイナミクスのライブイメージングから画像を選択しました。矢印が伸びる微小管を示しています。矢印が短縮微小管を示しています。サイズバー=5μmです。 （B）伸長速度と微小管の短縮率は、記録された画像から測定しました。各データは、少なくとも8つの異なる細胞からの20の測定値の平均です。エラーバーは標準誤差です。 **差は、p <0.01で統計的に有意であることを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
in vitroおよびin vivoで ：微小管動的不安定性を測定するための2つの主要な方法があります。 インビトロの方法では、精製されたチューブリンは、コンピュータ増強経時微分干渉コントラスト顕微鏡法を用いて微小管の動的不安定性を測定するために使用されます。 インビボ法では、蛍光チューブリンのマイクロインジェクション、またはGFPチューブリンを発現し、微小管に取り込まれます。微小管の動態（増殖および短縮）を、間期細胞の10、20、25の周辺領域に感度カメラを用いて、経時により記録されます。顕微鏡の各種この目的のために使用されてきたが、ここで報告されたプロトコルは、デコンボリューション顕微鏡を使用します。
生体内では 、動的不安定性は、一方のみが微小管プラス端（βチューブリンとの端部が外側に向いている）で発生しますマイナス端（外側を向いαチューブリンとの端部）は、同じ長さ26のまま。一方、in vitroで組み立てられた微小管のために、動的不安定性はプラス端がマイナス27を終了するよりも堅牢であると共に、微小管の両端に発生します。 in vitroでの動的不安定性を分析することの主な利点は、それが携帯MAPの不在下での微小管ダイナミクスの異なる薬剤の具体的な役割についての機構的情報を提供することです。さらに、 インビトロ条件下、動的不安定性は両端に研究することができます。これは、薬物または調節タンパク質が両端に微小管の安定性に影響するメカニズムへの洞察を提供します。歴史的に、マイナス端は、プラス10を終了するよりもはるかに少ない追跡されます。微小管の挙動の理解の多くは、in vitroで精製したチューブリンから組み立て微小管の研究から来ています。 しかしながら、これらの研究から得られた微小管の動作の基本原理の多くは、細胞中の微小管に対しても適用することができるが、 インビトロおよびインビボの間の微小管動態における特定の違いがあります。細胞では、微小管は、多くの場合、10倍速い速度、および成長および/または〜10倍、より頻繁に、in vitroで精製したチューブリンから組み立て微小管と比べて発生短縮の間の遷移に五で成長します。携帯微小管の挙動の空間的および時間的規制の高度を反映し、細胞周期を通して微小管の組織とダイナミクスの劇的な変化は、もあります。この動作は、in vitroでの研究によって研究することはできません。また、微小管ダイナミクスの調整はチューブリンの翻訳後修飾、チューブリンアイソタイプの発現、およびマイクロを安定化または不安定化のいずれかのMAPおよび他の微小管と相互作用するタンパク質の大規模なグループによって達成されます28、29を細管。そのため、生きた細胞内の微小管の不安定性を研究することは、はるかに生理的に適用可能です。
ここで説明する方法は、生細胞における微小管ダイナミクスを研究するための、シンプルで非常に信頼性の高いプロトコルです。もっと注意を必要とするステップは、観察のために、セルの選択と露光時間の決意です。平坦であり、GFPチューブリンの高い蛍光強度を有する細胞を選択することが重要です。励起強度およびGFP蛍光の退色を避けるために、露光時間を短縮することが望ましいです。確かに、 インビボの方法における他のすべてのように、このプロトコルは、様々な操作さ条件下での微小管の動的不安定性を研究するのには適していません。例えば、α-およびβチューブリンの異なるアイソフォームは、微小管ダイナミクスの点で動作が異なる場合があります。唯一のインビトロ法で sに使用することができます微小管動的不安定性上の個々の精製したチューブリンアイソフォームの効果をtudy。また、蛍光標識チューブリンのマイクロインジェクションに比べて、プラスミドのトランスフェクションまたは形質導入によってGFPタグ付きチューブリンの発現は、比較的低い信号対雑音比を示すことができます。しかし、プラスミドのトランスフェクションまたは形質導入によって細胞内でのGFPタグ付きチューブリンの発現は、より多くの自由が実験的に他の細胞特性を変更することができます。
ここで報告されたプロトコルは、様々な研究のために使用することができます。一方で、それは、特に、有糸分裂において、細胞周期の様々な段階での微小管の機能についての新規かつ重要な洞察を提供することができます。また、微小管動態に、そのような移行のような種々の細胞プロセスの効果を研究するために使用することができます。一方、正常に微小管動態に（それらの多くは抗癌剤である）は、種々の微小管阻害剤の効果を研究するために使用することができ、より生理的条件下で癌細胞。我々は両方のドセタキセル耐性および非ドセタキセル耐性乳癌細胞における微小管動的不安定性に種々の抗有糸分裂がん剤の効果を研究するために、このメソッドを使用しています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
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