Introduction
De belangrijkste oorzaak van de sterfte aan borstkanker is door middel van metastase 1, 2. Taxanen zoals paclitaxel en docetaxel, worden momenteel gebruikt als eerstelijnsbehandeling regimes voor de behandeling van metastatische borstkanker 2, 3, 4, 5, 6. Ze behoren tot een groep van microtubulus richtende middelen (MTA) die dynamiek van microtubuli verstoren. Een van de grootste uitdagingen voor gebruik taxanen curatieve therapie is de ontwikkeling van resistentie taxaan in kankercellen, wat leidt tot terugkeer van de ziekte 7. Geneesmiddelresistentie goed voor meer dan 90% van alle sterfgevallen bij patiënten met metastatische borstkanker 7.
Microtubuli worden gevormd door de polymerisatie van α- en β-tubuline heterodimerenclass = "xref"> 8, 9. De precieze regeling van de dynamiek van microtubuli is van belang voor vele cellulaire functies, zoals mobiele polarisatie, voortgang van de celcyclus, intracellulair transport en cell signaling. Ontregeling van microtubuli en hun dynamiek celfunctie verstoren en leiden tot celdood 10, 11. Afhankelijk van hoe zij veroorzaken deze ontregeling, kan MTA drugs worden geclassificeerd als microtubule stabiliserende middelen (dat wil zeggen, taxanen) of microtubule-destabalizing middelen (dat wil zeggen, vinca alkaloïden of colchicine plaatse bindmiddelen) 20. Ondanks hun tegengestelde effecten op microtubuli massa, op een voldoende dosering, beide klassen kunnen kankercellen te doden door hun effecten op de dynamiek van microtubuli 21.
Taxanen werken voornamelijk door het stabiliseren van de microtubule as 12, waardoorchromosomale foutieve uitlijning. De daaropvolgende voortdurende activering van de spindel montage checkpoint (SAC) arresteert de cel in mitose. Langdurige mitose veroorzaakt apoptose dan 13, 14. Taxaan reageert met microtubuli door het taxaan bindingsplaats op β-tubuline 8, 15, die alleen aanwezig in gemonteerde tubuline 16.
Meerdere mechanismen voor taxaan weerstand zijn voorgesteld 9, 17. Deze mechanismen omvatten zowel algemene multidrug resistentie door de overexpressie van drug-efflux eiwitten en taxaan-specifieke weerstand 5, 9, 18, 19. Bijvoorbeeld kan taxaan-resistente kankercellen veranderde expressie en functie van bepaalde β-badUlin isotypen 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Door toepassing van een in vivo methode om microtubule dynamische instabiliteit meten, laten we zien dat, in vergelijking met niet-resistente, ouderlijke MCF-7 cellen 17 CC, de microtubule dynamiek van docetaxel-resistente MCF-7 TXT cellen zijn ongevoelig voor behandeling met docetaxel.
Om een beter begrip van de functie van MTA en het exacte mechanisme van taxaan-resistentie in kankercellen, is het essentieel om microtubule dynamiek meten. Hier rapporteren we een in vivo werkwijze voor het doen. Via levende beeldvorming in combinatie met de expressie van GFP-gelabeld tubuline in cellen, kunnen we de microtubule dynamiek van MCF-7 TXT en MCF-7 cellen met CC en wi metenthout de behandeling met docetaxel. Het resultaat kan ons helpen het ontwerpen van meer doeltreffende geneesmiddelen die taxaan weerstand kan overwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Cellen voor Live Imaging
- Celcultuur en zaaien
- Gebruik MCF-7 borstkankercellen geselecteerd op resistentie tegen docetaxel (MCF-7 TXT) en de niet-resistente ouderlijke cellijn (MCF-7 CC). De gedetailleerde selectieproces en de karakterisering van deze geselecteerde cellijnen werden eerder 24 beschreven.
- Groeien alle cellen in 10 cm kweekschalen bij 37 ° C in een medium bestaande 90% Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en 10% foetaal runderserum (FBS) aangevuld met niet-essentiële aminozuren. Handhaaf het medium in een 5% CO2 atmosfeer. Onderhouden MCF-7 cellen bij TXT 5 nM docetaxel.
- Zaad cellen op dekglaasjes voor levende beeldvorming. Steriliseren 24 mm poly-L-lysine beklede dekglaasjes door ze af te spoelen met 70% alcohol en vervolgens bloot te stellen aan UV nachts. Plaats de dekglaasjes in een 6-well cultuur plaat van 35 mm. place één dekglaasje in elk putje.
- Verwijder het medium uit de 10-cm kweekschaal en was de cellen met PBS. Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA op de schotel naar de cellen van de schaal los. Voeg 5 ml kweekmedium de schotel naar de trypsine na het losmaken van de cellen neutraliseren.
- Tel de cellen met een hemocytometer om het aantal cellen per volume-eenheid te bepalen.
- Voeg ongeveer 10 5 cellen aan elke put op basis van het aantal cellen per volume-eenheid. Na voorzichtig schudden, zet de plaat terug in de incubator om de cellen te hechten aan de dekglaasjes.
- Expressie van GFP-gelabeld α-tubuline
- Om te testen microtubule dynamiek transduceren de cellen met GFP-gelabeld α-tubuline de commerciële GFP transductie controle (bv BacMam) volgens het protocol van de fabrikant.
- Cultuur van de cellen in de put gedurende 36 uur in een 37 ° C celkweek incubator com toestaancomplete hechting en 60% samenvloeiing.
- Bereken de juiste hoeveelheid GFP-gelabeld α-tubuline te voegen aan elk putje, volgens de volgende vergelijking:
Het aantal cellen is het geschatte totale aantal cellen in de put bij de etikettering en de gewenste PPC is het aantal deeltjes per cel.
OPMERKING: zaaien MCF-7 cellen moeten verdubbelen het aantal cellen van 10 5 tot 2 x 10 5 met een gewenste PPC van 20, het volume nodig zijn voor elk dekglaasje dus 40 pl. Voor verschillende cellen, berekend op het volume op basis van de bovenstaande formule kan niet de beste. Het exacte volume moet worden aangepast aan de werkelijke expressieniveau van GFP-tubuline. - Meng de GFP hebben herhaaldelijk α-tubuline door inversie om een homogene oplossing te verzekeren. Doe niet vortex.
LET OP: Voor de controle, de Null (controle) reagens mist elke zoogdieren genetischeelementen en kunnen worden gebruikt om te bepalen potentiaal baculovirus gemedieerde effecten en achtergrondfluorescentie. Een niet-gerichte GFP transductie controle kan ook worden gebruikt, die oplichten de gehele cel. - Vervang het kweekmedium met vers medium. Voeg 2 ml van het nieuwe medium en 40 ul van GFP-gelabeld α-tubuline aan elk putje.
- Schud de plaat voorzichtig om volledige menging van GFP-gelabeld α-tubuline met het kweekmedium mogelijk te maken. Zet de plaat naar de incubator en incubeer gedurende 24 uur om de expressie van GFP-tubuline mogelijk.
- Behandel cellen met docetaxel
Opmerking: Dit experiment is het effect van docetaxel op microtubule dynamische instabiliteit testen. Aldus worden de cellen behandeld met de gewenste concentratie van docetaxel.- Bereid een medium bestaande 90% DMEM en 10% FBS aangevuld met niet-essentiële aminozuren. Gebruik DMEM zonder fenolrood omdat fenolrood kunnen interfereren met de fluorescence van GFP-tubuline. Voeg de gewenste concentratie docetaxel (variërend van 10 nM tot 10 uM). De voorraad oplossing van docetaxel 10 mm in dimethylsulfoxide (DMSO).
- Voorverwarmen de docetaxel medium tot 37 ° C in de weefselkweek incubator.
- Vervang het normale kweekmedium met de docetaxel medium en incubeer gedurende 30 min in weefselkweek incubator. Er moet ten minste 3 dekglaasjes per putje voor elke concentratie docetaxel.
2. Live-Imaging te onderzoeken microtubuli Dynamic Instabiliteit
- Opstellen van het systeem
- Experimenten uitvoeren in een kamer gehandhaafd op 37 ° C en 5% CO2. Acquire fluorescentie beelden door tijdsverloop met een microscopische systeem uitgerust met een 60x, 1,42 NA olie-objectief op een omgekeerde fluorescentie microscoop en met een CCD-camera.
- Stel de cellen voor levende beeldvorming. Pre-warm zowel het monster houder enhet medium tot 37 ° C. Kies een dekglaasje te onderzoeken. Monteer de dekglaasje van de rente op een monsterhouder en incubeer het met 1 mL van de docetaxel-medium bereid in stap 1.3.1.
- Live-beeldvorming van microtubule dynamische instabiliteit
- Identificeer de cellen die worden gebruikt voor de beeldvorming. Zij moet vlak zijn, een hoge fluorescentie-intensiteit van GFP expressie-tubuline en microtubuli duidelijke structuren.
- Kies een cel uit de groep van geïdentificeerde cellen uit stap 2.2.1 om eerst te onderzoeken. Focus op het perifere gebied van de geïdentificeerde cel. Het opzetten van het programma voor de belichtingstijd en de frequentie van het beeld acquisitie. Aangezien de blootstelling is meestal 0,5 s, worden de beelden om de twee s worden verworven.
- Laat nog eens 20 min voor de stappen van 1,33 tot 2.2.3. Dus precies 50 minuten na toevoeging van docetaxel, zoals beschreven in stap 1.3.3, start beeldvorming (dit is voor standaardisatie).
- Noteer de microtubule dynamics gedurende 2 minuten, het nemen van een foto om de 2 s. In totaal krijgen 60 beelden voor het geïdentificeerde cel.
- Ga naar de volgende geïdentificeerde cel en herhaal de stappen 2.2.2 tot 2.2.4. Herhaal deze procedure tot 5 cellen zijn afgebeeld. Het is noodzakelijk om dit te doen voor de tijd bereikt 70 min na toevoeging van docetaxel, zoals beschreven in stap 1.3.3.
- Voor elke behandeling staat, herhaalt u de stappen 2.2.1 tot en met 2.2.5 voor 3 verschillende dekglaasjes. In totaal afbeelding 15 cellen, die is genoeg gegevens om microtubule dynamische instabiliteit te meten.
3. Beeldverwerking en data-analyse
- Deconvolutie afbeeldingen
- Deconvolutie van de verkregen beelden van een hoge kwaliteit te bereiken. Open de deconvolutie programma met de microscoop systeem.
- Klik op "Process" en selecteer "Deconvolutie." Sleep het beeldbestand om het venster "Input" en klik op "Do." Het beeldbestand wordt deconvolved, en dedeconvolved bestand wordt automatisch opgeslagen als een nieuw bestand.
- Generatie van video's
- Klik op het deconvolved image-bestand te openen met uitgeruste software.
- Klik op "File" en selecteer "Opslaan als film." Selecteer de "Movie formaat" als "AV" en de "Animation stijl" als "Forward". Stel de "Compression kwaliteit" tot "100%" en de "Frame rate" op "5 / seconde."
- Vink het vakje van "Animate door de tijd" en klik op "Do it." De video wordt gegenereerd.
- Meting van microtubuli verkorting en groeisnelheid
- Identificeer de microtubuli die wordt gebruikt voor de meting. Voor elke cel wordt een paar microtubules kunnen hun verkorting of groei gevolgd duidelijk en volledig.
- Onderzoekt elk frame van de video op het frame of het starten lengte van de microtubule toont een identificatiend het frame met de meest verlengd of verkort microtubuli. Meet de lengteverandering tussen de twee microtubuli en de tijd tussen de twee frames.
- Bereken de snelheid van de groei of verkorting door de verandering in de lengte te delen door de tijd (het apparaat is micrometer / s). Voor elke behandeling staat, volgt ten minste 10 cellen en het meten van ten minste 20 microtubules.
- Bereken het gemiddelde en de standaardafwijking voor elke behandeling conditie. Analyseer het statistisch verschil tussen de voorwaarden voor het gebruik van de Student-test. Rapporteren de gegevens in een tabel en / of in een diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het protocol hier gepresenteerde bestudeerden we het effect van docetaxel op de microtubule dynamiek van normale (MCF-7 CC) en docetaxel-resistente (MCF-7 TXT) borstkankercellen. Twee reeksen beelden tonen het effect van docetaxel (0,5 uM) Groei microtubuli en verkorting in MCF-7 CC en MCF-7 TXT cellen (Figuur 1A).
Ook berekenden de groei microtubuli en beperking onder deze omstandigheden de twee cellijnen en toonde aan dat bij 0,5 uM, docetaxel sterk remt tubuline dynamica van MCF-7 cellen, maar niet CC MCF-7 TXT cellen (Figuur 1B).
Figuur 1: De effecten van docetaxel op de microtubuli Dynamics van MCF-7 TXT en MCF-7 cellen CC. De live beeldvorming werd uitgevoerd zoals beschreven. (A) geselecteerde beelden van de levende imaging dynamiek van microtubuli in MCF-7 CC en MCF-7 TXT cellen na behandeling met 0,5 uM docetaxel gedurende 1 uur. De pijl geeft de uitstrekkende microtubules. De pijl geeft de verkorting microtubules. Grootte bar = 5 micrometer. (B) De uitbreiding tarief en het verkorten snelheid van microtubules werden gemeten van de opgenomen beelden. Elk gegeven is het gemiddelde van 20 metingen van ten minste 8 verschillende cellen. De fout bar is de standaard fout. ** Geeft aan dat het verschil is statistisch significant met p <0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijke methoden microtubule dynamische instabiliteit meten: in vitro en in vivo. In de in vitro werkwijze wordt gezuiverd tubuline gebruikt microtubule dynamische instabiliteit-computer verbeterde time-lapse differentiële interferentie contrast microscopie meten. In de in vivo werkwijze gemicroinjecteerd fluorescerende tubuline of expressie GFP-tubuline, wordt opgenomen in microtubules. De dynamiek (groei en verkorting) van de microtubuli wordt vervolgens geregistreerd door time-lapse gebruik van een gevoelige camera in het omtreksgebied van interfase cellen 10, 20, 25. Hoewel verscheidene soorten microscopen zijn voor dit doel, het protocol we hier vermelde gebruikt een deconvolutie microscoop.
In vivo, dynamische instabiliteit treedt alleen microtubuli plus uiteinden (de uiteinden van de β-tubuline naar buiten), terwijlde min-kant (de uiteinden van de α-tubuline naar buiten) blijven dezelfde lengte 26. Anderzijds, voor microtubuli geassembleerd in vitro, dynamische instabiliteit treedt aan beide uiteinden van de microtubuli, de plus einden robuuster dan minus 27 eindigt. Het belangrijkste voordeel van het analyseren van dynamische instabiliteit in vitro is dat het mechanistische informatie over de specifieke rol van verschillende agenten microtubuli dynamiek in de afwezigheid van cellulaire MAPs. Bovendien, onder in vitro omstandigheden, dynamische instabiliteit kan worden bestudeerd aan beide uiteinden. Dit geeft inzicht in de mechanismen die drugs of regulerende eiwitten beïnvloeden microtubule stabiliteit aan de tegenovergestelde uiteinden. Historisch gezien zijn de min-kant gevolgd minder dan plus 10 eindigt. Veel van onze kennis van microtubule gedrag komt van studies met microtubules samengesteld uit gezuiverd tubuline in vitro. Hoewel veel van de basisprincipes van microtubule gedrag verkregen uit deze studies ook cellen kunnen worden toegepast op microtubuli er bepaalde verschillen in microtubule dynamiek tussen in vitro en in vivo. In cellen, microtubuli groeien vaak op een vijf- tot tienmaal sneller en overgangen tussen groei en / of bakvet voordoen ~ 10 keer vaker dan bij microtubules samengesteld uit gezuiverd tubuline in vitro. Er zijn ook dramatische veranderingen in de organisatie van microtubuli en dynamiek gedurende de celcyclus, die een hoge mate van ruimtelijke en temporele regulatie van cellulaire microtubuli gedrag geven. Dit gedrag kan niet worden bestudeerd door in vitro onderzoek. Bovendien is de regulering van microtubuli dynamiek bereikt tubuline posttranslationele modificatie, tubuline isotype expressie en een grote groep kaarten en andere microtubule-interagerende eiwitten die ofwel stabiliseren of te destabiliseren microbuisjes 28, 29. Daarom bestuderen microtubule instabiliteit in levende cellen is veel fysiologisch toepassing.
De hier beschreven methode is een eenvoudig en zeer betrouwbaar protocol microtubule dynamiek bestuderen in levende cellen. De stappen die meer aandacht nodig zijn de selectie van de cel voor observatie en het bepalen van de belichtingstijd. Het is cruciaal om cellen die plat zijn selecteren en hebben een hoge fluorescentie-intensiteit van GFP-tubuline. Het is ook wenselijk om de intensiteit van excitatie en de blootstellingstijd aan het vervagen van de GFP fluorescentie voorkomen verminderen. Natuurlijk, zoals alle andere in vivo Dit protocol is niet geschikt microtubule dynamische instabiliteit onder verschillende gemanipuleerde condities. Bijvoorbeeld kunnen verschillende isovormen van α- en β-tubuline anders gedragen qua dynamiek van microtubuli. Slechts in vitro werkwijzen kunnen worden gebruikt om study de effecten van individuele isovormen gezuiverd tubuline op microtubule dynamische instabiliteit. Bovendien, vergeleken met de micro-injectie van fluorescent gelabeld tubuline, de expressie van GFP-gelabeld tubuline door transfectie of transductie plasmiden kan een relatief lage signaal-ruisverhouding vertonen. Expressie van GFP-gelabeld tubuline in cellen door transfectie of transductie plasmiden laat meer vrijheid experimenteel veranderen andere cellulaire kenmerken.
De hier vermelde protocol kan worden gebruikt voor verschillende studies. Enerzijds kan het nieuwe en belangrijke inzichten met betrekking tot de functie van microtubuli gedurende verschillende fasen van de celcyclus brengen, met name in mitose. Het kan ook worden gebruikt om de effecten van verschillende cellulaire processen, zoals migratie bestuderen op microtubuli dynamiek. Anderzijds, kan het worden gebruikt om de effecten van verschillende microtubule remmers bestuderen (velen zijn kankermedicijnen) op microtubule dynamiek in normale enkankercellen onder meer fysiologische omstandigheden. Wij hebben deze werkwijze toegepast om de effecten van verschillende anti-mitotische kanker drugs op microtubule dynamische instabiliteit in zowel docetaxel bestendig en niet-docetaxel resistente borstkankercellen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
