Introduction
La principale cause de mortalité par cancer du sein est par métastase 1, 2. Taxanes, tels que le docétaxel et le paclitaxel, sont actuellement utilisés comme schémas de première intention dans le traitement du cancer du sein métastatique , 2, 3, 4, 5, 6. Ils font partie d'un groupe d'agents de microtubules-ciblage (ATM) qui perturbent la dynamique des microtubules. Cependant, l' un des plus grands défis à l' utilisation de taxanes dans le traitement curatif est le développement de la résistance de taxane dans les cellules cancéreuses, ce qui conduit à la maladie récidive 7. Représente la résistance aux médicaments pour plus de 90% de tous les décès chez les patients atteints d' un cancer du sein métastatique 7.
Les microtubules sont formés par la polymérisation des hétérodimères a et ß-tubulineclass = "xref"> 8, 9. La régulation précise de la dynamique des microtubules est important pour de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la polarisation cellulaire, de la progression du cycle cellulaire, le transport intracellulaire et la signalisation cellulaire. Dysrégulation des microtubules et leur dynamique va perturber la fonction cellulaire et provoquer la mort cellulaire 10, 11. Selon la façon dont ils provoquent cette dysrégulation, les médicaments MTA peuvent être classés comme des microtubules agents stabilisants ( par exemple, taxanes) ou agents microtubules destabalizing (ie, vinca - alcaloïdes ou colchicine site des agents de liaison) 20. En dépit de leurs effets opposés sur la masse des microtubules, à une dose suffisante, les deux classes peuvent tuer les cellules cancéreuses grâce à leurs effets sur la dynamique des microtubules 21.
Les taxanes fonctionnent principalement par la stabilisation de la broche microtubules 12, conduisant àdésalignement chromosomique. L'activation perpétuelle ultérieure du point de contrôle de l'assemblage de broche (SAC) arrête la cellule en mitose. Prolongée mitotique arrestation provoque alors l' apoptose 13, 14. Taxane interagit avec les microtubules par le biais du site de liaison du taxane sur la β-tubuline 8, 15, qui est présent seulement dans la tubuline 16 assemblé.
Plusieurs mécanismes de résistance aux taxanes ont été proposées 9, 17. Ces mécanismes comprennent à la fois la multirésistance générale due à la surexpression de protéines et spécifiques de taxane de la résistance 5, 9, 18, 19 médicaments efflux. Par exemple, les cellules cancéreuses résistantes à un taxane peut avoir modifié l'expression et la fonction de certaines β-tubulin isotypes 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. En utilisant une méthode in vivo pour mesurer microtubules instabilité dynamique, on montre que, par rapport aux parents cellules MCF-7 non résistantes, CC 17, la dynamique des microtubules des cellules MCF-7 TXT docétaxel résistantes sont insensibles à un traitement par le docétaxel.
Pour mieux comprendre la fonction de MTAs et le mécanisme exact de taxane-résistance dans les cellules cancéreuses, il est essentiel de mesurer la dynamique des microtubules. Nous rapportons ici une méthode in vivo de le faire. En utilisant l' imagerie en direct en combinaison avec l'expression de la tubuline GFP-marqués dans les cellules, nous pouvons mesurer la dynamique des microtubules de MCF-7 TXT et MCF-7 cellules CC avec et wiThoout traitement par le docétaxel. Les résultats peuvent nous aider à concevoir des médicaments plus efficaces qui peuvent surmonter la résistance de taxane.
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Protocol
1. Préparation des cellules pour l'imagerie en direct
- La culture cellulaire et l' ensemencement
- Utiliser des cellules MCF-7 du cancer du sein sélectionnées pour la résistance au docétaxel (MCF-7 TXT) et leur lignée cellulaire parentale non résistante (MCF-7 CC). Le processus de sélection et la caractérisation détaillée de ces lignées cellulaires sélectionnées ont été décrites précédemment 24.
- Cultiver les cellules dans des boîtes de culture de 10 cm à 37 ° C dans un milieu composé de 90% de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et supplémenté avec des acides aminés non essentiels. Maintenir le support dans une atmosphère de CO2 à 5%. Maintenir les cellules MCF-7 TXT à 5 nM docétaxel.
- cellules de semences sur des lamelles pour l'imagerie en direct. 24 mm stériliser des lamelles en verre de poly-L-lysine en les rinçant à 70% d'alcool, puis en les exposant aux rayons ultraviolets pendant une nuit. Placez les lamelles dans un 6 puits plaque de culture de 35 mm. PLace une lamelle dans chaque puits.
- Retirez le support de la boîte de culture de 10 cm et laver les cellules avec du PBS. Ajouter 0,5 ml de trypsine-EDTA à l'antenne pour détacher les cellules du plat. Ajouter 5 ml de milieu de culture à l'antenne pour neutraliser la trypsine après le détachement des cellules.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules par unité de volume.
- Ajouter environ 10 5 cellules dans chaque puits en fonction du nombre de cellules par unité de volume. Après avoir secoué doucement, mettez la plaque arrière dans l'incubateur pour permettre aux cellules de se fixer aux lamelles.
- Expression de la GFP-tagged α-tubuline
- Pour doser la dynamique des microtubules, transduire les cellules avec GFP-étiqueté α-tubuline avec le contrôle de la transduction de la GFP commerciale (par exemple, BacMam) selon le protocole du fabricant.
- La culture des cellules dans le puits pendant 36 h dans un incubateur à 37 ° C de la culture cellulaire afin de permettre comadhérence complète et 60% de confluence.
- Calculer le volume approprié de GFP-étiqueté α-tubuline pour ajouter à chaque puits, en fonction de l'équation suivante:
Le nombre de cellules est le nombre total estimé de cellules dans le puits au moment de l'étiquetage et de la PPC souhaitée est le nombre de particules par cellule.
REMARQUE: Ensemencement des cellules MCF-7 devrait avoir doublé le nombre de cellules de 10 5 à 2 x 10 5 avec un CCP désiré de 20, le volume requis pour chaque lamelle couvre -objet est donc de 40 ul. Pour différentes cellules, le volume calculé sur la base de la formule ci-dessus peut ne pas être le meilleur. Le volume exact doit être ajustée en fonction du niveau d'expression réelle de la GFP-tubuline. - Mélanger l'a-tubuline plusieurs fois GFP étiqueté par inversion pour assurer une solution homogène. Ne pas vortex.
NOTE: Pour le contrôle, le Null (contrôle) réactif est dépourvu de toute génétique des mammifèreséléments et peuvent être utilisés pour aider à déterminer les effets de baculovirus médiée potentiels et la fluorescence de fond. Un contrôle de la transduction de la GFP non ciblée peut également être utilisé, ce qui allume la cellule entière. - Remplacez le milieu de culture avec du milieu frais. Ajouter 2 ml de nouveau milieu, et 40 pi de GFP-étiqueté α-tubuline dans chaque puits.
- Secouer doucement la plaque pour permettre un mélange complet de la GFP étiquetées α-tubuline avec le milieu de culture. Retourner la plaque dans l'incubateur de culture et mettre à incuber pendant 24 h pour permettre l'expression de la GFP-tubuline.
- Traiter les cellules avec le docétaxel
NOTE: Cette expérience est de tester l'effet du docétaxel sur microtubules instabilité dynamique. Ainsi, on traite les cellules avec la concentration souhaitée du docétaxel.- Préparer un milieu composé de 90% de DMEM et 10% de FBS et supplémenté avec des acides aminés non essentiels. Utilisez DMEM sans rouge de phénol, car le rouge de phénol peut interférer avec le fluorescence de GFP-tubuline. Ajouter la concentration souhaitée de docétaxel (allant de 10 nM à 10 uM). La solution mère de docétaxel est de 10 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Préchauffer le milieu contenant du docétaxel à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire.
- Remplacer le milieu de culture normal avec le milieu contenant docétaxel et laisser incuber pendant 30 minutes dans l'incubateur de culture tissulaire. Il devrait y avoir au moins 3 lamelles par puits pour chaque concentration de docetaxel.
2. Imagerie Live Examiner microtubules Instabilité dynamique
- Mise en place du système
- Réaliser des expériences dans une chambre maintenue à 37 ° C et 5% de CO 2. Acquérir des images de fluorescence par intervalle de temps avec un système microscopique équipé d'un 60X, 1,42 huile NA lentille d'objectif sur un microscope à fluorescence inversé et avec une caméra CCD.
- Mettre en place les cellules pour l'imagerie en direct. à la fois le porte-échantillon pré-chaud etle milieu à 37 ° C. Choisissez une lamelle à examiner. Monter la lamelle d'intérêt sur un porte-échantillon et incuber avec 1 ml du milieu contenant du docétaxel préparé à l'étape 1.3.1.
- Imagerie en temps réel d'instabilité dynamique des microtubules
- Identifier les cellules qui seront utilisées pour l'imagerie. Ils doivent être à plat, ont une intensité de fluorescence élevée exprimé GFP-tubuline, et ont des structures de microtubules claires.
- Choisissez une cellule dans le groupe des cellules identifiées à partir de l'étape 2.2.1 d'examiner d'abord. Focus sur la zone périphérique de la cellule identifiée. Mettre en place le programme pour le temps d'exposition et la fréquence d'acquisition d'image. Comme le temps d'exposition est généralement de 0,5 s, les images seront acquises tous les deux s.
- Permettre à un 20 minutes supplémentaires pour les étapes de 1,33 à 2.2.3. Ainsi, exactement 50 minutes après l'addition du docetaxel, tel que décrit à l'étape 1.3.3, commencer l'imagerie (ce qui est de la normalisation).
- Notez le microtubules dynamics pendant 2 min, en prenant toutes les 2 s une photo. Au total, l'acquisition de 60 images pour la cellule identifiée.
- Déplacer vers la cellule suivante identifiée et répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4. Répétez la procédure jusqu'à 5 cellules ont été imagées. Il est impératif de le faire avant le temps atteint 70 min après l'addition du docetaxel, tel que décrit à l'étape 1.3.3.
- Pour chaque condition de traitement, répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.5 pour 3 lamelles différentes. Au total, l'image 15 cellules, ce qui est assez de données pour mesurer l'instabilité dynamique des microtubules.
3. Traitement de l'image et de l'analyse des données
- Déconvolution d'images
- Déconvoluer les images acquises pour obtenir une haute qualité. Ouvrir le programme de déconvolution équipé du système de microscope.
- Cliquez sur "Process" et sélectionnez "Deconvolve." Faites glisser le fichier d'image à la fenêtre "d'entrée" et cliquez sur "Do." Le fichier image sera déconvoluée, etfichier déconvoluée sera enregistrée comme un nouveau fichier automatiquement.
- Génération de vidéos
- Cliquez sur le fichier d'image déconvoluée à ouvrir avec le logiciel équipé.
- Cliquez sur "Fichier" et sélectionner "Enregistrer sous film." Sélectionnez le format "film" comme "AV" et le "style d'animation" comme "Forward". Réglez la "qualité de compression" à "100%" et le "Frame rate" à "5 / seconde."
- Cochez la case "Animer à travers le temps" et cliquez sur "Faites-le." La vidéo sera générée.
- Mesure de microtubules shortening et taux de croissance
- Identifier les microtubules qui seront utilisés pour la mesure. Pour chaque cellule, seulement quelques microtubules pourront avoir leur raccourcissement ou la croissance suivie de manière claire et complète.
- Examinez chaque image de la vidéo pour identifier l'image qui montre la longueur de départ de l'microtubules unnd cadre avec le microtubules le plus étendu ou raccourci. Mesurer la variation de longueur entre les deux microtubules et le temps écoulé entre les deux cadres.
- Calculer le taux de croissance ou le raccourcissement en divisant le changement de longueur dans le temps (l'unité est um / s). Pour chaque condition de traitement, suivi d'au moins 10 cellules et mesurer au moins 20 microtubules.
- Calculer la moyenne et l'erreur standard pour chaque condition de traitement. Analyser la différence statistique entre les conditions à l'aide du test de Student. Signaler les données dans une table et / ou dans un tableau.
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Representative Results
En utilisant le protocole présenté ici, nous avons étudié les effets de docétaxel sur la dynamique des microtubules de la normale (MCF-7 CC) et le docétaxel résistant (MCF-7) TXT cellules de cancer du sein. Deux séries d'images montrent les effets de docétaxel (0,5 uM) sur la croissance et le raccourcissement des microtubules dans les cellules MCF-7 CC et MCF-7 TXT cellules (figure 1A).
Nous avons également calculé le taux de croissance des microtubules ou le raccourcissement dans ces conditions pour les deux lignées cellulaires et a montré que , à 0,5 uM, le docétaxel inhibe fortement la dynamique de la tubuline des cellules MCF-7 CC mais pas MCF-7 cellules TXT (Figure 1B).
Figure 1: Les effets du Docetaxel sur le microtubules dynamiques de MCF-7 TXT et MCF-7 CC cellules. L'imagerie en temps réel a été réalisée tel que décrit. (A) Les images sélectionnées à partir de l'imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules MCF-7 CC et les cellules MCF-7 TXT après un traitement avec 0,5 uM docetaxel pendant 1 h. La flèche indique les microtubules étendant. La flèche indique les microtubules de raccourcissement. Taille bar = 5 um. (B) Le taux d'extension et le taux le raccourcissement des microtubules ont été mesurés à partir des images enregistrées. Chaque donnée est la moyenne de 20 mesures à partir d'au moins 8 cellules différentes. La barre d'erreur est l'erreur standard. ** Indique que la différence est statistiquement significative, avec p <0,01. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il existe deux méthodes principales pour mesurer microtubules instabilité dynamique: in vitro et in vivo. Dans le procédé in vitro, la tubuline purifiée est utilisée pour mesurer l' instabilité microtubules dynamique avec time-lapse interférence différentielle-microscopie à contraste amélioré par ordinateur. Dans le procédé in vivo, microinjecté tubuline fluorescente ou exprimé GFP-tubuline en microtubules est incorporé. La dynamique (croissance et de raccourcissement) des microtubules est alors enregistrée par le temps écoulé en utilisant une caméra sensible dans la région périphérique de cellules en interphase 10, 20, 25. Bien que divers types de microscopes ont été utilisés à cet effet, le protocole que nous rapportons utilise un microscope à déconvolution.
In vivo, l' instabilité dynamique ne se produit qu'à microtubules , plus extrémités (les extrémités avec le β-tubuline vers l' extérieur), tandis queles extrémités négatives (les extrémités avec l'α-tubuline tournée vers l' extérieur) restent la même longueur 26. D'autre part, pour les microtubules assemblés in vitro, l' instabilité dynamique se produit au niveau des deux extrémités des microtubules, les extrémités étant plus robuste , plus que les extrémités 27 moins. Le principal avantage de l' analyse instabilité dynamique in vitro est qu'il fournit des informations mécaniste sur le rôle spécifique des différents agents sur la dynamique des microtubules en l'absence de MAPs cellulaires. Par ailleurs, dans des conditions in vitro, l' instabilité dynamique peut être étudié aux deux extrémités. Cela permet de mieux comprendre les mécanismes par lesquels des médicaments ou des protéines régulatrices affectent la stabilité des microtubules aux extrémités opposées. Historiquement, les extrémités négatives sont suivies beaucoup moins que les extrémités plus de 10. Une grande partie de notre compréhension du comportement des microtubules proviennent d'études sur les microtubules assemblés à partir de la tubuline purifiée in vitro. Cependant, alors que bon nombre des principes de base du comportement des microtubules tirés de ces études peuvent également être appliquées aux microtubules dans les cellules, il existe certaines différences dans la dynamique des microtubules entre in vitro et in vivo. Dans les cellules, les microtubules poussent souvent à une durée de cinq à dix fois plus rapidement, et les transitions entre la croissance et / ou le raccourcissement se produisent ~ 10 fois plus fréquemment que avec les microtubules assemblés à partir de tubuline purifiée in vitro. Il y a aussi des changements spectaculaires dans l'organisation des microtubules et la dynamique tout au long du cycle cellulaire, qui reflètent un degré élevé de réglementation spatiale et temporelle du comportement des microtubules cellulaires. Ce comportement ne peut pas être étudiée par la recherche in vitro. En outre, la régulation de la dynamique des microtubules est obtenue par modification post-traductionnelle tubuline, expression tubuline isotype, et un grand groupe de cartes et d'autres protéines de microtubules interagissant que soit stabiliser ou déstabiliser microtubules 28, 29. Par conséquent, l'étude de l'instabilité des microtubules dans les cellules vivantes est beaucoup plus physiologiquement applicable.
La méthode décrite ici est un protocole simple et très fiable pour étudier la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes. Les étapes qui nécessitent plus d'attention sont la sélection de la cellule pour l'observation et la détermination de la durée d'exposition. Il est essentiel de sélectionner des cellules qui sont plates et ont une grande intensité de fluorescence de la GFP-tubuline. Il est également souhaitable de réduire l'intensité d'excitation et le temps d'exposition afin d'éviter la disparition de la fluorescence de la GFP. Certes, comme tous les autres méthodes in vivo, ce protocole ne convient pas à étudier microtubules instabilité dynamique dans diverses conditions manipulées. Par exemple, différentes isoformes de α- et β-tubuline peuvent se comporter différemment en termes de la dynamique des microtubules. Seulement des procédés in vitro peuvent être utilisés pour ltudy les effets des différents isoformes de tubuline purifiées sur microtubules instabilité dynamique. En outre, par rapport à la micro-injection de la tubuline marqué par fluorescence l'expression de GFP-étiqueté tubuline par transfection ou transduction de plasmides peut présenter un rapport relativement faible rapport signal-bruit. Cependant, l'expression de la tubuline GFP-marqués dans les cellules par transfection ou transduction de plasmides permet une plus grande liberté de modifier expérimentalement les autres caractéristiques cellulaires.
Le protocole présenté ici peut être utilisé pour diverses études. D'une part, il peut fournir des aperçus nouveaux et importants en ce qui concerne la fonction des microtubules au cours des différentes phases du cycle cellulaire, en particulier dans la mitose. Il peut également être utilisé pour étudier les effets de divers processus cellulaires tels que la migration, sur la dynamique des microtubules. D'autre part, il peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs de microtubule (bon nombre d'entre eux sont des médicaments anticancéreux) sur la dynamique des microtubules dans des conditions normales etles cellules cancéreuses dans des conditions plus physiologiques. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier les effets de divers médicaments anticancéreux antimitotiques sur l'instabilité dynamique des microtubules dans les cellules résistantes et le cancer du sein résistant non docétaxel docétaxel.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
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