Introduction
A principal causa de mortalidade por câncer de mama é através de metástases 1, 2. Os taxanos, como o docetaxel e o paclitaxel, são actualmente utilizados como esquemas de primeira linha para o tratamento de cancro da mama metastático 2, 3, 4, 5, 6. Eles fazem parte de um grupo de agentes de metas de microtúbulos (MTA) que interrompem a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, um dos maiores desafios para a utilização em terapia curativa taxanos é o desenvolvimento de resistência taxano em células de cancro, o que leva à recorrência da doença sete. A resistência às drogas é responsável por mais de 90% de todas as mortes entre os pacientes com câncer de mama metastático 7.
Os microtúbulos são formados pela polimerização de heterodímeros a- e p-tubulinaclass = "xref"> 8, 9. A regulação exacta da dinâmica dos microtúbulos é importante para muitas funções celulares, incluindo a célula de polarização, progressão do ciclo celular, o transporte intracelular e a sinalização celular. Desregulação dos microtúbulos e sua dinâmica irá interromper a função das células e resultar em morte celular 10, 11. Dependendo de como eles causam esta desregulação, drogas MTA pode ser classificada quer como agentes de estabilização de microtúbulos (isto é, taxanos) ou agentes de microtúbulos-destabalizing (isto é, alcalóides vinca, colchicina ou local agentes de ligação) 20. Apesar dos seus efeitos opostos sobre a massa de microtúbulos, numa dosagem suficiente, ambas as classes podem matar as células cancerosas através dos seus efeitos sobre a dinâmica dos microtúbulos 21.
Os taxanos funcionar primariamente por estabilização de microtúbulos do fuso 12, levando adesalinhamento cromossómico. A subsequente activação perpétua do checkpoint de montagem do fuso (SAC) prende a célula na mitose. Paragem da mitose prolongado, em seguida, faz com que a apoptose 13, 14. Taxano interage com os microtúbulos através do sítio de ligação taxano em β-tubulina 8, 15, que só está presente no tubulina montados 16.
Vários mecanismos de resistência de taxano têm sido propostos 9, 17. Estes mecanismos incluem tanto a resistência a múltiplas drogas em geral, devido à sobre-expressão de proteínas e de resistência 5, 9, 18, 19 específicos de taxano de droga-efluxo. Por exemplo, as células cancerosas resistentes a taxano podem ter alterado a expressão e função de certos β-banheiraUlin isotipos 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Ao usar um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos, mostra-se que, quando comparado com a não-resistentes, parentais células MCF-7 CC 17, a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 resistente ao TXT docetaxel são insensíveis ao tratamento com docetaxel.
Para entender melhor a função de MTAs e o mecanismo exacto de taxano-resistência em células cancerosas, que é essencial para medir a dinâmica dos microtúbulos. Aqui, nós relatamos um método in vivo de fazê-lo. Utilizando imagens ao vivo em associação com a expressão de tubulina GFP em células, pode-se medir a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 TXT e células MCF-7 com CC e without tratamento com docetaxel. Os resultados podem nos ajudar a projetar drogas mais eficazes que podem superar a resistência taxano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparar as células for Imaging ao vivo
- Cultura de células e sementeira
- Utilização de células MCF-7 de cancro da mama seleccionados para resistência ao docetaxel (MCF-7 TXT) e sua linha celular parental não resistente (MCF-7 CC). O processo de selecção detalhada e a caracterização destas linhas celulares seleccionadas foram descritos anteriormente 24.
- Cresça todas as células em placas de cultura de 10 cm a 37 ° C num meio composto de 90% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 10% de soro fetal de bovino (FBS) e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Manter o meio numa atmosfera de 5% de CO 2. Manter as células MCF-7 em TXT 5 nM de docetaxel.
- Semear as células em lamelas para geração de imagens ao vivo. Esterilizar 24 mm lamelas de vidro com poli-L-lisina-revestidas, enxaguando-as com álcool a 70% e, em seguida, expondo-os a radiação UV durante a noite. Coloque as lamelas numa placa de cultura de 6 poços de 35 mm. Place uma lamela em cada poço.
- Remover o meio a partir da placa de cultura de 10 cm e lavar as células com PBS. Adicionar 0,5 ml de tripsina-EDTA para o prato para separar as células do prato. Adicionar 5 ml de meio de cultura para o prato para neutralizar a tripsina seguindo o descolamento das células.
- Contar as células com um hemocitómetro para determinar o número de células por unidade de volume.
- Adicionar cerca de 5 a 10 células em cada poço com base no número de células por unidade de volume. Depois de sacudi-la gentilmente, pôs o prato de volta para a incubadora para permitir que as células para anexar as lamelas.
- Expressão de GFP α-tubulina
- Para ensaiar dinâmica dos microtúbulos, transduzir as células com GFP α-tubulina com controlo a transdução de GFP comercial (por exemplo, BacMam) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Cultura das células nos poços durante 36 h numa incubadora de cultura de células de 37 ° C para permitir COMpleta adesão e 60% de confluência.
- Calcular o volume apropriado de GFP α-tubulina para adicionar a cada poço, de acordo com a seguinte equação:
O número de células é o número estimado de células no poço no momento da marcação e o PPC desejado é o número de partículas por célula.
NOTA: Semear as células MCF-7 deveria ter o dobro da contagem de células a partir de 10 5 a 2 x 10 5 com um PPC desejada de 20, o volume necessário para cada lamela é, por conseguinte, 40 ul. Para diferentes células, o volume calculado com base na fórmula acima pode ser o melhor. O volume exato deve ser ajustada de acordo com o nível de expressão real da GFP-tubulina. - Misture a a-tubulina várias vezes GFP por inversão para assegurar uma solução homogénea. não vortex.
NOTA: Para o controle, o (controle) reagente nulo carece de qualquer genética de mamíferoselementos e pode ser usado para ajudar a determinar os potenciais efeitos mediada por baculovírus e fluorescência de fundo. Um controle de transdução não-alvo GFP podem também ser utilizados, o que irá acender-se toda a célula. - Substituir o meio de cultura com meio fresco. Adicionar 2 ml do novo meio e 40 uL de GFP α-tubulina a cada poço.
- Agitar a placa suavemente para permitir uma mistura completa de GFP α-tubulina com o meio de cultura. Retornar a placa na incubadora e incubar a cultura durante 24 horas para permitir a expressão de GFP-tubulina.
- Células Tratar com docetaxel
NOTA: Esta experiência é testar o efeito do docetaxel na instabilidade dinâmica dos microtúbulos. Assim, as células são tratadas com a concentração desejada de docetaxel.- Prepara-se uma forma composta de 90% de DMEM e 10% de FBS e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Use DMEM sem vermelho de fenol vermelho de fenol porque pode interferir com o fluorescence de GFP-tubulina. Adicionar a concentração desejada de docetaxel (variando de 10 nM a 10 uM). A solução estoque de docetaxel é 10 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Pré-aquecer o meio contendo docetaxel a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos.
- Substituir o meio normal de cultura com o meio contendo docetaxel e incubar durante 30 min no incubador de cultura de tecido. Deve haver pelo menos 3 lamelas por poço para cada concentração de docetaxel.
2. Imagens ao vivo para examinar microtúbulos instabilidade dinâmica
- Configurando o sistema
- Realizar experiências numa câmara mantida a 37 ° C e 5% de CO 2. Adquirir imagens de fluorescência por lapso de tempo com um sistema microscópico equipado com um 60X, lente objetiva 1,42 NA óleo em um microscópio de fluorescência invertido e com uma câmera CCD.
- Configurar as células para geração de imagens ao vivo. tanto o titular pré-aquecer a amostra eo meio para 37 ° C. Escolha uma lamela para examinar. Colocar a tampa de interesse num suporte de amostra e incuba-se com 1 ml de meio contendo docetaxel preparado no passo 1.3.1.
- Imagens ao vivo de microtúbulos instabilidade dinâmica
- Identificar as células que serão utilizadas para imagiologia. Eles devem ser plana, tem uma elevada intensidade de fluorescência de GFP expressa-tubulina, e tem estruturas de microtúbulos claras.
- Escolha uma célula do grupo de células identificadas a partir da etapa 2.2.1 examinar em primeiro lugar. Concentre-se na área periférica da célula identificada. Configurar o programa para o tempo de exposição e a frequência de aquisição de imagem. Como o tempo de exposição é geralmente 0,5 s, as imagens serão adquiridas a cada dois s.
- Permitir que um 20 min adicional para os passos de 1,33 para 2.2.3. Assim, exactamente 50 min após a adição de docetaxel, tal como descrito no passo 1.3.3, iniciar imagem (isto é para a normalização).
- Grave a microtúbulos dynamics por 2 min, tirar uma foto a cada 2 s. No total, 60 adquirir imagens para a célula identificado.
- Mover para a próxima célula identificada e repita os passos 2.2.2 a 2.2.4. Repita o procedimento até 5 células foram fotografadas. É imperativo que fazer isso antes do tempo atinge 70 min após a adição de docetaxel, tal como descrito no passo 1.3.3.
- Para cada condição de tratamento, repita os passos 2.2.1 a 2.2.5 para 3 lamelas diferentes. No total, as células de imagem 15, que há dados suficientes para medir microtúbulos instabilidade dinâmica.
3. Processamento de Imagem e Análise de Dados
- Deconvolution de imagens
- Deconvoluir as imagens adquiridas para alcançar uma alta qualidade. Abra o programa de desconvolução equipado com o sistema de microscópio.
- Clique em "Processos" e selecione "deconvoluir." Arraste o arquivo de imagem para a janela "Input" e clique em "Do." O arquivo de imagem será deconvolved, eoarquivo deconvolved será salvo como um novo arquivo automaticamente.
- Geração de vídeos
- Clique no arquivo de imagem deconvolved de abrir com software equipado.
- Clique em "Arquivo" e selecione "Salvar como filme." Selecione a opção "formato de Filme" como "AV" e o "estilo de Animação", como "Forward". Defina a "qualidade de compressão" para "100%" e "Taxa de quadros" para "5 / segundo."
- Marque a caixa de "Animar através do tempo" e clique em "Faça isso." O vídeo será gerado.
- Medição de encurtamento dos microtúbulos ea taxa de crescimento
- Identificar os microtúbulos que serão usados para a medição. Para cada célula, a poucos microtúbulos será capaz de ter o seu encurtamento ou crescimento seguido clara e completamente.
- Analisar cada quadro de vídeo para identificar o quadro que mostra o comprimento de partida da um microtúbulond do quadro com a microtúbulos mais prorrogado ou reduzido. Medir a variação de comprimento entre as duas microtúbulos e o tempo decorrido entre as duas armações.
- Calcula-se a taxa de crescimento ou encurtamento dividindo a mudança no comprimento de tempo (a unidade é um / s). Para cada condição de tratamento, siga pelo menos 10 células e medir pelo menos 20 microtúbulos.
- Calcule a média eo desvio-padrão para cada condição de tratamento. Analisar a diferença estatística entre as condições utilizando o teste de Student. Reportam os dados em uma tabela e / ou em um gráfico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando o protocolo aqui apresentado, foram estudados os efeitos do docetaxel sobre a dinâmica dos microtúbulos de (MCF-7) TXT células cancerosas de mama normal (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente. Dois conjuntos de imagens mostram os efeitos do docetaxel (0,5 ^ M) sobre o crescimento e encurtamento dos microtúbulos em células MCF-7 CC e MCF-7 TXT células (Figura 1A).
Também foi calculado a taxa de crescimento dos microtúbulos ou encurtando sob estas condições para as duas linhas celulares e mostraram que a 0,5 ^ M, docetaxel inibe fortemente a dinâmica de tubulina de células MCF-7 CC, mas não células MCF-7 TXT (Figura 1B).
Figura 1: Os efeitos do Docetaxel no microtúbulos Dinâmicos de MCF-7 TXT e MCF-7 Células CC. A imagem ao vivo foi realizada como descrito. (A) As imagens seleccionadas a partir da imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células MCF-7 CC e células MCF-7 TXT após o tratamento com 0,5 uM de docetaxel durante 1 h. A seta indica os microtúbulos se estendem. A seta indica os microtúbulos encurtamento. bar size = 5 mm. (B) A taxa de extensão ea taxa de encurtamento dos microtúbulos foram medidos a partir das imagens gravadas. Cada dado representa a média de 20 medições de, pelo menos, 8 células diferentes. A barra de erro representa o erro-padrão. ** Indica que a diferença é estatisticamente significativa, com p <0,01. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Existem dois métodos principais para medir instabilidade dinâmica dos microtúbulos: in vitro e in vivo. No método in vitro, tubulina purificada é usada para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos com microscopia de contraste de interferência diferencial-lapso de tempo melhorado-computador. No método in vivo, microinjectados tubulina fluorescente, ou expressaram a GFP-tubulina, é incorporado em microtúbulos. A dinâmica (crescimento e encurtamento) dos microtúbulos é então gravado pelo lapso de tempo utilizando uma câmara sensível na região periférica de células da interfase 10, 20, 25. Embora vários tipos de microscópios têm sido utilizados para este fim, que o protocolo relatado aqui utiliza um microscópio de desconvolução.
In vivo, a instabilidade dinâmica ocorre apenas no microtúbulos além de extremidades (as extremidades com a β-tubulina voltado para fora), enquantoas extremidades de menos (as extremidades com as α-tubulina voltado para fora) permanecem o mesmo comprimento 26. Por outro lado, para os microtúbulos montados in vitro, a instabilidade dinâmica ocorre em ambas as extremidades dos microtúbulos, com as extremidades mais sendo mais robusto do que o menos 27 termina. A principal vantagem de se analisar a instabilidade dinâmica in vitro é que fornece informações sobre mecanicista para o papel específico de diferentes agentes na dinâmica dos microtúbulos em ausência de MAPs celulares. Além disso, sob condições in vitro, a instabilidade dinâmica pode ser estudada em ambas as extremidades. Isto proporciona uma visão sobre os mecanismos pelos quais os fármacos ou proteínas reguladoras afectam a estabilidade dos microtúbulos nas extremidades opostas. Historicamente, as extremidades são rastreados menos muito menos do que o sinal de adição termina a 10. Grande parte da nossa compreensão do comportamento dos microtúbulos vem de estudos sobre os microtúbulos montados a partir de tubulina purificada in vitro. No entanto, enquanto muitos dos princípios básicos do comportamento de microtúbulos obtidos a partir destes estudos pode também ser aplicada aos microtúbulos em células, existem certas diferenças em dinâmica dos microtúbulos entre in vitro e in vivo. Em células, os microtúbulos crescem frequentemente em um de cinco a dez vezes mais rapidamente, e as transições entre o crescimento e / ou encurtamento ocorrer ~ 10 vezes mais frequentemente do que com os microtúbulos montados a partir de tubulina purificada in vitro. Existem também alterações dramáticas na organização de microtúbulos e dinâmica em todo o ciclo celular, as quais reflectem um grau elevado de regulação espacial e temporal do comportamento dos microtúbulos celulares. Este comportamento não pode ser estudado pela pesquisa in vitro. Além disso, a regulação da dinâmica dos microtúbulos é conseguido através da modificação tubulina pós-tradução, expressão tubulina isotipo, e um grande grupo de mapas e outras proteínas que interagem com microtúbulos que quer estabilizar ou desestabilizar microtúbulos 28, 29. Portanto, estudar a instabilidade dos microtúbulos em células vivas é muito mais fisiologicamente aplicável.
O método descrito aqui é um protocolo simples e muito fiável para estudar a dinâmica dos microtúbulos em células vivas. Os passos que exigem mais atenção são a selecção da célula para a observação e a determinação do tempo de exposição. É crítico para seleccionar as células que são planas e têm elevada intensidade de fluorescência de GFP-tubulina. É também desejável reduzir a intensidade de excitação e o tempo de exposição para evitar o desbotamento da fluorescência da GFP. Certamente, como todos os outros métodos in vivo, este protocolo não é adequado para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica sob várias condições manipulado. Por exemplo, diferentes isoformas de α- e β-tubulina podem se comportar de forma diferente em termos de dinâmica dos microtúbulos. Apenas em métodos in vitro podem ser usadas para study os efeitos de isoformas de tubulina purificadas individuais sobre microtúbulos instabilidade dinâmica. Além disso, em comparação com a microinjecção de tubulina marcada com fluorescência, a expressão da tubulina marcada com GFP por transfecção ou transdução de plasmídeos pode apresentar uma proporção relativamente inferior de sinal-para-ruído. No entanto, a expressão da tubulina marcada com GFP em células por transfecção ou transdução de plasmídeos permite mais liberdade para alterar experimentalmente outras características celulares.
O protocolo relatado aqui pode ser utilizado para vários estudos. Por um lado, ele pode fornecer informações novas e importantes sobre a função de microtúbulos durante as várias fases do ciclo celular, especialmente na mitose. Ele também pode ser usado para estudar os efeitos de vários processos celulares, tais como migração, na dinâmica dos microtúbulos. Por outro lado, ele pode ser usado para estudar os efeitos de vários inibidores de microtúbulos (muitos deles são medicamentos contra o cancro) na dinâmica dos microtúbulos em normal ecélulas cancerosas em condições mais fisiológicas. Nós temos usado este método para estudar os efeitos de várias drogas anti-cancerígenas mitóticas em instabilidade dinâmica dos microtúbulos em ambas as células resistentes e de cancro da mama não resistente ao docetaxel docetaxel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
