Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين

Published: February 20, 2017 doi: 10.3791/55027
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Introduction

السبب الرئيسي لوفيات سرطان الثدي هو ورم خبيث من خلال 1، 2. Taxanes، مثل DOCETAXEL وباكليتاكسيل، وتستخدم حاليا منصب نظم الخط الأول في علاج سرطان الثدي النقيلي 2، 3، 4، 5، 6. وهم جزء من مجموعة من العوامل التي تستهدف أنيبيب (الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف) التي تعطل ديناميات أنيبيب. ومع ذلك، واحدة من أكبر التحديات التي تواجه استخدام taxanes في العلاج العلاجية هو تطور مقاومة التاكسين في الخلايا السرطانية، الأمر الذي يؤدي إلى تكرار المرض 7. حسابات مقاومة العقاقير لأكثر من 90٪ من مجموع وفيات بين المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي النقيلي 7.

تتشكل الأنابيب الدقيقة عن طريق بلمرة heterodimers ألفا و-β تويولينالطبقة = "XREF"> 8 و 9. تنظيم دقيق للديناميات أنيبيب مهم للعديد من الوظائف الخلوية، بما في ذلك الاستقطاب الخلايا، تقدم دورة الخلية والنقل داخل الخلايا، وإشارات الخلية. سوف ديسريغولاتيون من الأنابيب الدقيقة وديناميتها تعطيل وظائف الخلايا ويؤدي إلى موت الخلايا 10 و 11. اعتمادا على الكيفية التي تسبب هذه التقلبات، والمخدرات MTA يمكن أن تصنف على أنها إما أنيبيب استقرار وكلاء (أي taxanes) أو وكلاء أنيبيب-destabalizing (أي قلويدات فينكا أو الموقع الكولشيسين وكلاء ملزمة) 20. وعلى الرغم من آثار عكسية على كتلة أنيبيب، في جرعة كافية، يمكن أن كلتا الفئتين تقتل الخلايا السرطانية عن طريق تأثيرها على ديناميات أنيبيب 21.

Taxanes تعمل في المقام الأول عن طريق تثبيت المغزل أنيبيب 12، مما أدى إلىاختلال الكروموسومات. تفعيل دائم لاحق من حاجز الجمعية المغزل (SAC) يعتقل خلية في الانقسام. ثم يسبب اعتقال الإنقسامية لفترات طويلة موت الخلايا المبرمج 13 و 14. التاكسين تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة من خلال موقع التاكسين ملزم على β تويولين 8 و 15، التي هي موجودة فقط في تويولين تجميعها 16.

وقد تم اقتراح آليات متعددة للمقاومة التاكسين 9، 17. وتشمل هذه الآليات على حد سواء المقاومة للأدوية المتعددة العامة بسبب overexpression من البروتينات هروب رأس المال من المخدرات والتاكسين محددة المقاومة 5، 9، 18، 19. على سبيل المثال، الخلايا السرطانية مقاومة للالتاكسين قد غيرت التعبير وظيفة الحوض β معينفي Ulin isotypes 5، 9، 19، 20، 21، 22، 23. باستخدام الأسلوب في الجسم الحي لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي، وتبين لنا أن، بالمقارنة مع غير مقاومة لل، الوالدين قدم مكعبة-7 خلايا CC 17، وديناميات أنيبيب من خلايا MCF-7 TXT مقاومة للDOCETAXEL لا تعير اهتماما للعلاج DOCETAXEL.

من أجل فهم أفضل وظيفة من الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف والآلية الدقيقة لالتاكسين المقاومة في الخلايا السرطانية، لا بد من قياس ديناميات أنيبيب. هنا، ونحن التقرير وسيلة في الجسم الحي للقيام بذلك. باستخدام التصوير الحي في تركيبة مع التعبير عن تويولين الموسومة GFP في الخلايا، يمكننا قياس ديناميات أنيبيب من قدم مكعبة-7 TXT وMCF-7 خلايا CC مع ووايthout العلاج DOCETAXEL. فإن النتائج يمكن أن تساعدنا في تصميم أدوية أكثر فعالية التي يمكن التغلب على مقاومة التاكسين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد خلايا للتصوير لايف

  1. زراعة الخلايا والبذر
    1. استخدام خلايا MCF-7 سرطان الثدي تم اختيارها لمقاومة DOCETAXEL (قدم مكعبة-7 TXT) وغير مقاومة للخلية خط الوالدين من (قدم مكعبة-7 CC). وقد وصفت عملية اختيار مفصلة وتوصيف هذه السطور الخلية المحددة سابقا 24.
    2. تنمو جميع الخلايا في أطباق ثقافة 10 سم عند 37 درجة مئوية في المتوسط ​​تتكون من 90٪ من متوسط ​​المعدل النسر Dulbecco وفي (DMEM) و 10٪ من مصل بقري جنيني (FBS) وتستكمل مع الأحماض الأمينية غير الأساسية. الحفاظ على المتوسط في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. الحفاظ على خلايا MCF-7 TXT في 5 نانومتر DOCETAXEL.
    3. خلايا البذور coverslips على التصوير الحي. تعقيم 24 ملم coverslips الزجاج المطلي بولي-L-يسين قبل الشطف لهم 70٪ من الكحول ومن ثم تعريضها للأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها. ضع لل coverslips إلى لوحة الثقافة 6 جيدا من 35 مم. ررالآس ساترة واحد في كل بئر.
    4. إزالة المتوسطة من الطبق ثقافة 10 سم، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 مل من التربسين-EDTA إلى الطبق لفصل الخلايا من الطبق. إضافة 5 مل من مستنبت على طبق لتحييد التربسين التالية مفرزة من الخلايا.
    5. عدد الخلايا مع عدادة الكريات لتحديد عدد من الخلايا لكل وحدة حجم.
    6. إضافة ما يقرب من 10 5 خلايا لكل الجيد اعتمادا على عدد الخلايا لكل وحدة حجم. بعد الهز برفق، ووضع لوحة العودة إلى الحاضنة للسماح للخلايا إرفاق لل coverslips.
  2. التعبير عن GFP الموسومة ألفا تويولين
    1. لفحص ديناميات أنيبيب، تنبيغ الخلايا مع GFP الموسومة ألفا تويولين مع سيطرة تنبيغ GFP التجاري (على سبيل المثال، BacMam) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. ثقافة الخلايا في البئر لمدة 36 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية الثقافة خلية للسماح كومأمراض لغة التكلم التصاق و 60٪ التقاء.
    3. حساب حجم مناسب من GFP الموسومة α تويولين إضافة إلى كل بئر، وفقا للمعادلة التالية:
      معادلة
      عدد الخلايا هو العدد الإجمالي المقدر للخلايا في البئر في وقت الوسم وقدرة شرائية المطلوب هو عدد الجزيئات في خلية.
      ملاحظة: بذر خلايا MCF-7 يجب أن تضاعف عدد خلايا من 5-2 أكتوبر × 10 5 مع قدرة شرائية المرجوة من 20، وحجم اللازمة لكل ساترة بالتالي هو 40 ميكرولتر. للخلايا المختلفة، وحجم تحسب على أساس الصيغة الموضحة أعلاه قد لا تكون الأفضل. ينبغي تعديل حجم المحدد وفقا لمستوى التعبير الفعلي للGFP تويولين.
    4. خلط الموسومة GFP-α تويولين عدة مرات من قبل انعكاس لضمان حل متجانسة. لا الدوامة.
      ملاحظة: للحصول على السيطرة، وفارغة (مراقبة) كاشف يفتقر إلى أي الوراثية الثديياتالعناصر، ويمكن استخدامها للمساعدة في تحديد الآثار بوساطة الفيروسة العصوية المحتملة ومضان الخلفية. يمكن أيضا استخدام عنصر تحكم التنبيغ غير المستهدفة GFP، والتي سوف تضيء الخلية بأكملها.
    5. استبدال مستنبت مع المتوسط ​​الطازجة. إضافة 2 مل من هذه الوسيلة الجديدة و 40 ميكرولتر من GFP الموسومة α تويولين إلى كل بئر.
    6. يهز لوحة بلطف للسماح للخلط كاملة من GFP الموسومة ألفا تويولين مع مستنبت. العودة إلى لوحة حاضنة الثقافة واحتضان لمدة 24 ساعة للسماح للتعبير عن GFP تويولين.
  3. خلايا تعامل مع DOCETAXEL
    ملاحظة: هذه التجربة لاختبار تأثير DOCETAXEL على أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي. وبالتالي، يتم التعامل مع الخلايا مع التركيز المطلوب من DOCETAXEL.
    1. إعداد المتوسطة يتكون من 90٪ من DMEM و 10٪ من FBS وتستكمل مع الأحماض الأمينية غير الأساسية. استخدام DMEM بدون أحمر الفينول لأن الفينول الأحمر قد تتداخل مع fluorescenم من GFP تويولين. إضافة تركيز المطلوب من DOCETAXEL (تتراوح بين 10 نانومتر إلى 10 ميكرومتر). محلول المخزون من DOCETAXEL هو 10 ملم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
    2. قبل تدفئة المتوسطة التي تحتوي على DOCETAXEL إلى 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة.
    3. استبدال مستنبت طبيعي مع المتوسطة التي تحتوي على DOCETAXEL واحتضان لمدة 30 دقيقة في نسيج الثقافة الحاضنة. ينبغي أن يكون هناك على الأقل 3 coverslips لكل بئر لكل تركيز DOCETAXEL.

2. تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي

  1. إعداد نظام
    1. إجراء تجارب في غرفة الحفاظ على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. الحصول على صور مضان من قبل الفاصل الزمني مع نظام المجهري مجهزة 60X، 1.42 NA النفط عدسة الهدف على مجهر مضان مقلوب مع وجود كاميرا CCD.
    2. إعداد خلايا للتصوير الحية. قبل دافئ كل من صاحب العينة والمتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية. اختيار ساترة لدراسة. جبل ساترة الفائدة على صاحب العينة واحتضان مع 1 مل من متوسطة تحتوي على DOCETAXEL أعدت في الخطوة 1.3.1.
  2. تصوير مباشر من أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي
    1. تحديد الخلايا التي سيتم استخدامها للتصوير. يجب أن تكون مسطحة، لديها كثافة مضان عالية من أعرب عن GFP تويولين، ولها هياكل أنيبيب واضحة.
    2. اختيار خلية واحدة من مجموعة من الخلايا التي تم تحديدها من الخطوة 2.2.1 لفحص أولا. التركيز على المنطقة الحدودية للخلية التي تم تحديدها. إعداد برنامج لمدة التعرض وتيرة الحصول على الصور. مع مرور الوقت تعرض عادة 0.5 ثانية، سيتم الحصول على الصور كل اثنين من ليالي.
    3. سماح 20 دقيقة إضافية للخطوات من 1.33 إلى 2.2.3. وهكذا، بالضبط 50 دقيقة بعد إضافة DOCETAXEL، كما هو موضح في الخطوة 1.3.3، بدء التصوير (هذا هو لتوحيد).
    4. تسجيل أنيبيب دynamics لمدة 2 دقيقة، مع صورة كل 2 ثانية. في المجموع، والحصول على 60 صورة للخلية التي تم تحديدها.
    5. انتقال إلى الخلية المحددة التالية وكرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.4. كرر الإجراء حتى يتم تصويرها 5 خلايا. لا بد من القيام بذلك قبل وقت يصل 70 دقيقة بعد إضافة DOCETAXEL، كما هو موضح في الخطوة 1.3.3.
    6. لكل حالة علاج، كرر الخطوات من 2.2.1 إلى 2.2.5 لمدة 3 coverslips مختلفة. في المجموع، صورة 15 الخلايا، وهو ما يكفي من البيانات لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي.

3. معالجة الصور وتحليل البيانات

  1. Deconvolution من الصور
    1. Deconvolve الصور المكتسبة لتحقيق جودة عالية. فتح برنامج deconvolution مزودة بنظام المجهر.
    2. انقر على "عملية" وحدد "Deconvolve." اسحب ملف صورة إلى إطار "الإدخال" ثم انقر على "دو" سيتم deconvolved ملف الصورة، وسيتم حفظ ملف deconvolved كملف جديد تلقائيا.
  2. جيل من أشرطة الفيديو
    1. انقر فوق ملف الصورة deconvolved لفتح مع برنامج التجهيز.
    2. انقر فوق "ملف" واختر "حفظ باسم الفيلم." حدد "شكل الفيلم" بأنه "AV" و "أسلوب الرسوم المتحركة" كما "إلى الأمام". تعيين "جودة ضغط" إلى "100٪" و "معدل الإطار" إلى "5 / ثانية."
    3. ضع علامة في المربع من "تحريك عبر الزمن" وانقر على "القيام بذلك." سيتم إنشاء الفيديو.
  3. قياس تقصير أنيبيب ومعدل النمو
    1. التعرف على الأنابيب الدقيقة التي سيتم استخدامها لقياس. لكل خلية، وفقط عدد قليل من الأنابيب الدقيقة تكون قادرة على تقصير أو النمو جاء بوضوح وبشكل كامل.
    2. فحص كل إطار من الفيديو لتحديد الإطار الذي يدل على طول الانطلاق من أنيبيب لالثاني الإطار مع أنيبيب أكثر تمديد أو تقصير. قياس التغير في الطول بين اثنين من الأنابيب الدقيقة والوقت المنقضي بين إطارين.
    3. حساب معدل النمو أو تقصير بقسمة التغير في طول من الوقت (الوحدة ميكرون / ثانية). لكل حالة علاج، اتبع لا يقل عن 10 الخلايا وقياس لا يقل عن 20 الأنابيب الدقيقة.
    4. حساب متوسط ​​والخطأ المعياري لكل حالة العلاج. تحليل الفرق الإحصائي بين الشروط باستخدام اختبار الطلاب. عن البيانات في جدول و / أو في الرسم البياني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول المقدمة هنا، قمنا بدراسة آثار DOCETAXEL على ديناميات أنيبيب من المعتاد (قدم مكعبة-7 CC) ومقاومة للDOCETAXEL (قدم مكعبة-7 TXT) خلايا سرطان الثدي. مجموعتين من الصور تظهر آثار DOCETAXEL (0.5 ميكرومتر) على النمو أنيبيب وتقصير في قدم مكعبة-7 CC وMCF-7 TXT الخلايا (الشكل 1A).

نحن أيضا حساب معدل النمو أنيبيب أو تقصير في ظل هذه الظروف للخطوط الخلايا اثنين وأظهرت أن عند 0.5 ميكرومتر، DOCETAXEL يمنع بقوة ديناميات تويولين من خلايا MCF-7 CC ولكن ليس MCF-7 خلايا TXT (الشكل 1B).

شكل 1
الشكل 1: آثار دوسيتاكسيل على أنيبيب الحيويالصورة من قدم مكعبة-7 TXT وMCF-7 الخلايا CC. تم إجراء تصوير العيش كما هو موضح. (A) صور مختارة من التصوير الحي للديناميات أنيبيب في قدم مكعبة-7 CC وخلايا MCF-7 TXT بعد العلاج مع 0.5 ميكرومتر DOCETAXEL لمدة 1 ساعة. السهم يشير إلى الأنابيب الدقيقة تمتد. رأس السهم يشير إلى الأنابيب الدقيقة تقصير. شريط حجم = 5 ميكرون. تم قياس (ب) معدل الإرشاد ومعدل تقصير من الأنابيب الدقيقة من الصور المسجلة. كل مسند هو متوسط ​​20 القياسات من لا يقل عن 8 خلايا مختلفة. شريط الخطأ هو الخطأ المعياري. ** يشير إلى أن الفرق هو ذات دلالة إحصائية، مع P <0.01. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك طريقتان الرئيسية لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي: في التجارب المختبرية والحية. في هذه الطريقة في المختبر، يتم استخدام تويولين تنقيته لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي مع مرور الزمن المجهر التفاضلية التدخل النقيض محسنة الكمبيوتر. في طريقة في الجسم الحي، microinjected تويولين الفلورسنت، أو التعبير GFP تويولين، وهو مدرج في الأنابيب الدقيقة. ثم يتم تسجيل ديناميات (النمو وتقصير) من الأنابيب الدقيقة من الوقت الفاصل باستخدام كاميرا حساسة في المنطقة الطرفية للخلايا الطور البيني 10، 20، 25. بينما أنواع مختلفة من المجاهر وقد استخدمت لهذا الغرض، وبروتوكول أبلغنا هنا يستخدم المجهر deconvolution.

في الجسم الحي، يحدث عدم الاستقرار الديناميكي فقط في أنيبيب بالإضافة إلى نهايات (نهايات مع β تويولين تواجه الخارج)، في حينتبقى نهايات ناقص (نهايات مع α تويولين التي تواجه الخارج) نفس طول 26. من ناحية أخرى، على الأنابيب الدقيقة تجميعها في المختبر، يحدث عدم الاستقرار الديناميكي في كلا طرفي الأنابيب الدقيقة، مع نهايات زائد كونها أكثر قوة من ناقص ينتهي 27. والميزة الرئيسية لتحليل عدم الاستقرار الديناميكي في المختبر هو أنه يوفر معلومات حول الآلية الدور المحدد وكلاء مختلفة على ديناميات أنيبيب في غياب خرائط الخلوية. وعلاوة على ذلك، في ظل ظروف في المختبر، وعدم الاستقرار الديناميكي يمكن دراستها في كلا الجانبين. وهذا يوفر نظرة ثاقبة الآليات التي المخدرات أو البروتينات التنظيمية تؤثر على الاستقرار أنيبيب في طرفي نقيض. تاريخيا، يتم تعقب نهايات ناقص أقل بكثير من زائد بنتيجة 10. كثيرا من فهمنا للسلوك أنيبيب يأتي من دراسات على الأنابيب الدقيقة تجميعها من تويولين تنقيتها في المختبر. ومع ذلك، في حين أن العديد من المبادئ الأساسية للسلوك أنيبيب المكتسبة من هذه الدراسات يمكن أن تطبق أيضا على الأنابيب الدقيقة في الخلايا، وهناك بعض الاختلافات في ديناميات أنيبيب بين في التجارب المختبرية والحية. في الخلايا، الأنابيب الدقيقة غالبا ما تنمو في خمسة إلى عشرة أضعاف معدل أسرع، والانتقال بين النمو و / أو تقصير يحدث ~ 10 مرات اكثر من الأنابيب الدقيقة مع تجميعها من تويولين تنقيتها في المختبر. هناك أيضا تغييرات جذرية في المؤسسة أنيبيب وديناميكية في جميع مراحل دورة الخلية، والتي تعكس درجة عالية من التنظيم المكاني والزماني للسلوك أنيبيب الخلوي. لا يمكن دراسة هذا السلوك عن طريق البحث في المختبر. وعلاوة على ذلك، ويتحقق تنظيم ديناميات أنيبيب من تعديل تويولين posttranslational والتعبير تويولين نمط إسوي، ومجموعة كبيرة من الخرائط وغيرها من البروتينات التفاعل أنيبيب إما أن استقرار أو زعزعة استقرار الصغيرالأنابيب 28، 29. لذلك، ودراسة حالة عدم الاستقرار أنيبيب في الخلايا الحية هي أكثر بكثير ينطبق من الناحية الفسيولوجية.

الطريقة الموصوفة هنا هو بروتوكول بسيطة وموثوق بها للغاية لدراسة ديناميات أنيبيب في الخلايا الحية. الخطوات التي تتطلب المزيد من الاهتمام لاختيار الخلية للمراقبة وتحديد مدة التعرض. فمن الأهمية بمكان لتحديد الخلايا التي هي ثابتة ولها كثافة مضان عالية من GFP تويولين. ومن المستحسن أيضا للحد من شدة الإثارة ووقت التعرض لتجنب يتلاشى من مضان GFP. بالتأكيد، مثل كل من الآخر في طرق الجسم الحي، وهذا البروتوكول هو غير مناسب لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في ظل ظروف مختلفة التلاعب. على سبيل المثال، الإسوية مختلفة من ألفا وβ تويولين قد تتصرف بشكل مختلف من حيث ديناميات أنيبيب. فقط في أساليب المختبر يمكن استخدامها لقtudy آثار الفردية الإسوية تويولين النقاء على أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع Microinjection من تويولين مضان المسمى، والتعبير عن تويولين GFP الموسومة من قبل ترنسفكأيشن أو تنبيغ البلازميدات قد يواجه أقل نسبيا نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ومع ذلك، تعبيرا عن تويولين الموسومة GFP في الخلايا عن طريق ترنسفكأيشن أو تنبيغ البلازميدات يسمح بمزيد من الحرية لتغير تجريبيا الخصائص الخلوية الأخرى.

بروتوكول ذكرت هنا يمكن أن تستخدم للدراسات مختلفة. من جهة، يمكن أن توفر رؤى جديدة وحاسمة بشأن وظيفة الأنابيب الدقيقة خلال مختلف مراحل دورة الخلية، خصوصا في الانقسام. ويمكن أن تستخدم أيضا لدراسة الآثار المترتبة على مختلف العمليات الخلوية، مثل الهجرة، على ديناميات أنيبيب. من ناحية أخرى، يمكن استخدامه لدراسة الآثار المترتبة على مختلف مثبطات أنيبيب (وكثير منهم عقاقير مضادة للسرطان) على ديناميات أنيبيب في الحالات العادية والخلايا السرطانية تحت أكثر الظروف الفسيولوجية. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لدراسة الآثار المترتبة على مختلف عقاقير مضادة للسرطان المضادة للالإنقسامية على عدم الاستقرار الديناميكي أنيبيب في كل من خلايا المقاومة، وعدم DOCETAXEL سرطان الثدي مقاومة DOCETAXEL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Non-essential amino acids Life Technologies, Invitrogen 11140-050
FBS Gibco, Invitrogen 12483
Anti-Anti (100x) Life Technologies, Invitrogen 15240-062
docetaxel Sigma-Aldrich 01885-5mg-F
DMEM phenol red-free Gibco, Invitrogen 21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin ThermoFisher Scientific C10613 Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP ThermoFisher Scientific B10383 Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich+B9:AA9 472301 for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip Fisher Scientifics 12-545-101
6-well culture plate Greiner Bio-One International 6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems GE Health This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific Hausser Scientific, Distributed by VWR Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 120، تويولين، أنيبيب، أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي، وسرطان الثدي، التاكسين المقاومة، دوسيتاكسيل، يعيش التصوير،
تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, R., Wang, H., Wang, Z. Live… More

Wang, R., Wang, H., Wang, Z. Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers. J. Vis. Exp. (120), e55027, doi:10.3791/55027 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter