Introduction
Основной причиной смертности от рака молочной железы через метастазирования 1, 2. Таксаны , такие как доцетаксел и паклитаксел, в настоящее время используются в качестве лекарства первой линии в лечении метастатического рака молочной железы 2, 3, 4, 5, 6. Они являются частью группы микротрубочек таргетирования агентов (MTA), которые нарушают динамику микротрубочек. Тем не менее, одна из самых больших проблем в использовании таксанов в лечебной терапии является развитие резистентности таксана в раковых клетках, что приводит к рецидиву болезни 7. Устойчивость к лекарственным средствам приходится более 90% всех случаев смерти среди больных с метастатическим раком молочной железы 7.
Микротрубочки формируются путем полимеризации альфа- и бета-тубулина гетеродимеровкласс = "Xref"> 8, 9. Точное регулирование динамики микротрубочек имеет важное значение для многих клеточных функций, в том числе поляризации клеток, клеточного цикла, внутриклеточного транспорта и клеточной сигнализации. Дисрегуляция микротрубочек и их динамика будет нарушать функцию клеток и приводит к гибели клеток 10, 11. В зависимости от того, как они вызывают этот дисрегуляцию, MTA препараты могут быть классифицированы как микротрубочек стабилизирующих агентов (то есть, таксаны) или микротрубочек destabalizing агентов (т.е. алкалоиды барвинка или колхицина-сайта связывающие агенты) 20. Несмотря на их противоположные эффекты на микротрубочки массы, при достаточной дозировке, оба класса могут убивать раковые клетки через их влияние на динамику микротрубочек 21.
Таксаны функционировать в первую очередь за счет стабилизации микротрубочек веретена 12, что приводит кхромосомная перекосы. Последующее бессрочного активация сборки веретена контрольной точки (SAC) задерживает клетки в митоз. Продолжительное митоза затем вызывает апоптоз 13, 14. Таксан взаимодействует с микротрубочками через сайт связывания таксана на бета-тубулина 8, 15, который присутствует только в собранном виде тубулина 16.
Множественные механизмы сопротивления таксана были предложены 9, 17. Эти механизмы включают в себя как общую устойчивость ко многим лекарственным средствам в связи с гиперэкспрессией лекарственно-Отток белков и таксанов удельным сопротивлением 5, 9, 18, 19. Например, таксана устойчивые раковые клетки, возможно, измененную экспрессию и функцию определенного бета-ваннеУлин изотипы 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. При использовании метода в естественных условиях для измерения динамической нестабильности микротрубочек, мы покажем , что, по сравнению с неустойчивого, родительских MCF-7 CC 17 клеток, динамика микротрубочек доцетаксела устойчивостью MCF-7 TXT клетки нечувствительны к лечению доцетакселом.
Чтобы лучше понять функцию АПС и точный механизм таксана устойчивости в раковых клетках, важно для измерения динамики микротрубочек. Здесь мы сообщаем метод в естественных условиях сделать это. При использовании живого изображения в сочетании с выражением GFP-меченый тубулина в клетках, мы можем измерить динамику микротрубочек из MCF-7 TXT и MCF-7 CC клеток с и Wiдоцетаксел лечение без промежуточного. Полученные результаты могут помочь нам разработать более эффективные препараты, которые могут преодолеть сопротивление таксана.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клетки для живых изображений
- Клеточные культуры и высева
- Использование MCF-7 рака молочной железы клетки , выбранные для устойчивости к доцетаксела (MCF-7 TXT) и их неустойчивого родительской линии клеток (MCF-7 CC). Подробный процесс отбора и характеристика этих отобранных клеточных линий были описаны ранее 24.
- Grow все клетки в 10 см чашки для культивирования при 37 ° С в среде, состоящей на 90% из среды Игла в модификации Игла (DMEM), и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и дополненной несущественных аминокислот. Поддерживать среду в атмосфере 5% CO 2. Поддерживать клетки MCF-7 TXT при 5 нМ доцетаксела.
- Семенной клетки на покровных для живого изображения. Стерилизовать 24 мм поли-L-лизин-покрытием покровные стекла, промыв их с 70% -ным спиртом, а затем подвергая их УФ в течение ночи. Поместите покровные в 6-луночный планшет для культивирования 35 мм. Plтуз один покровное в каждую лунку.
- Удалить среду из культуральной чашки 10 см и промыть клетки с PBS. Добавить 0,5 мл трипсин-ЭДТА на блюдо, чтобы отделить клетки от тарелки. Добавляют 5 мл культуральной среды в чашке для нейтрализации трипсина после открепления клеток.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить число ячейки на единицу объема.
- Добавить приблизительно 10 5 клеток в каждую лунку на основе количества клеток на единицу объема. После встряхивания осторожно, положите пластину обратно в инкубатор, чтобы позволить клеткам прикрепляться к покровные.
- Экспрессия GFP-меченый альфа-тубулина
- Для анализа динамики микротрубочек, трансдукции клеток с GFP-меченый альфа-тубулина с контролем трансдукции коммерческим GFP (например, BacMam) в соответствии с протоколом производителя.
- Культуры клеток в лунку в течение 36 часов в 37 ° C для культивирования клеток в инкубаторе, чтобы комохватившую адгезия и 60% слияния.
- Рассчитывают соответствующий объем GFP-меченый альфа-тубулина, чтобы добавить в каждую лунку, в соответствии со следующим уравнением:
Число клеток, общее предполагаемое количество клеток в лунке в момент маркировки и желаемого КПП представляет число частиц на клетку.
Примечание: Посев клеток MCF-7 должен был в два раза число клеток от 10 5 до 2 × 10 5 с требуемым КПП 20, объем необходим для каждого покровного поэтому 40 мкл. Для различных ячеек, объем рассчитывается на основе приведенной выше формулы не может быть лучшим. Точный объем должен быть отрегулирован в соответствии с фактическим уровнем экспрессии GFP-тубулина. - Смешайте GFP-меченый несколько раз альфа-тубулина путем инверсии для обеспечения однородного раствора. Не вихрь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля, (контроль) реагента Null не хватает какой-либо генетической млекопитающихэлементы и могут быть использованы, чтобы помочь определить потенциальные бакуловирусом опосредованные эффекты и фоновую флуоресценцию. Нецелевой GFP управления трансдукции может также использоваться, который будет гореть всю клетку. - Заменить культуральную среду со свежей средой. Добавьте 2 мл новой среды и 40 мкл GFP-меченый альфа-тубулина в каждую лунку.
- Встряхните пластину осторожно, чтобы обеспечить полное перемешивание GFP-меченый альфа-тубулина с культуральной средой. Возвратить пластину в культуральную инкубатор и инкубируют в течение 24 ч, чтобы обеспечить экспрессию GFP-тубулина.
- Лечить клетки с доцетакселом
Примечание: Этот эксперимент, чтобы проверить эффект доцетаксела на микротрубочки динамической неустойчивости. Таким образом, клетки обрабатывают с желаемой концентрацией доцетаксела.- Подготовьте носитель, состоящий на 90% DMEM и 10% FBS и с добавлением несущественных аминокислот. Используйте DMEM без фенола красного, так как фенол красный может мешать fluorescenв.п. из GFP-тубулина. Добавить требуемую концентрацию доцетаксела (в пределах от 10 нМ до 10 мкМ). Исходный раствор доцетаксела составляет 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).
- Предварительно нагреть доцетаксел среде, содержащей до 37 ° С в инкубаторе тканевых культур.
- Заменить обычную культуральную среду со доцетаксела среде, содержащей и инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе тканевых культур. Там должно быть по крайней мере 3 покровные на лунку для каждой концентрации доцетаксела.
2. Живая съемка по анализу микротрубочек динамической неустойчивости
- Настройка системы
- Выполнение экспериментов в камере , поддерживаемой при температуре 37 ° С и 5% CO 2. Приобретать флуоресцентных изображений по прошествии времени с микроскопической системой, оснащенной 60X, 1,42 NA нефти объектива на перевернутой флуоресцентного микроскопа и с ПЗС-камерой.
- Настройка ячейки для живого изображения. Предварительно теплый и держатель образца исреда до 37 ° С. Выберите покровное для изучения. Установить покровное интереса на держателе образца и инкубировать его с 1 мл доцетаксела среде, содержащей, приготовленным на стадии 1.3.1.
- Живая съемка микротрубочек динамической неустойчивости
- Определить клетки, которые будут использоваться для работы с изображениями. Они должны быть плоскими, имеют высокую интенсивность флуоресценции, выраженной GFP-тубулина, и имеют четкие структуры микротрубочек.
- Выберите одну ячейку из группы определенных клеток из этапа 2.2.1 изучить в первую очередь. Фокус на периферийной области идентифицированной соте. Установите программу для времени экспозиции и частоту получения изображения. Поскольку время экспозиции, как правило, 0,5 с, изображения будут приобретены через каждые два с.
- Разрешить дополнительные 20 мин для шагов от 1,33 до 2.2.3. Таким образом, именно через 50 мин после добавления доцетаксела, как описано в шаге 1.3.3, начинают томографию (это по стандартизации).
- Запись микротрубочек дynamics в течение 2 мин, принимая фото каждые 2 сек. В общей сложности, приобрести 60 изображений для идентифицированного ячейки.
- Переход к следующему идентифицированной ячейке и повторите шаги 2.2.2 2.2.4. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока 5 клеток были отображены. Крайне важно, чтобы сделать это до того, как время достигает 70 мин после добавления доцетаксела, как описано в пункте 1.3.3.
- Для каждого условия лечения, повторите шаги 2.2.1 2.2.5 для 3 различных покровные. В целом, изображение 15 ячеек, которые достаточно данных для измерения динамической нестабильности микротрубочек.
3. Обработка изображений и анализ данных
- Деконволюция изображений
- Деконволюции Полученные изображения для достижения высокого качества. Откройте программу деконволюции, оснащенный системой микроскопа.
- Нажмите кнопку "Process" и выберите "деконволюции." Перетащите файл изображения в окне "Input" и нажмите кнопку "Do." Файл изображения будет деконволюции идеконволюции файл будет сохранен как новый файл автоматически.
- Генерация видео
- Нажмите деконволюции файл изображения, чтобы открыть с оборудованной программным обеспечением.
- Нажмите кнопку "Файл" и выберите "Сохранить как фильм." Выберите "Формат фильма" как "AV" и "стиль анимации", как "вперед". Установите "Качество сжатия" до "100%" и "Скорость передачи кадров" до "5 / сек."
- Установите флажок "анимировать во времени" и нажмите "Сделай это." Видео будет сгенерирован.
- Измерение микротрубочек укорачивания и скорости роста
- Определить микротрубочки, которые будут использоваться для измерения. Для каждой ячейки, только несколько микротрубочки будет иметь возможность их укорочение или рост следуют четко и полностью.
- Проверьте каждый кадр видео, чтобы идентифицировать кадр, который показывает начальную длину микротрубочек ай кадр с самым пролонгировать или укороченной микротрубочек. Измерьте изменение длины между двумя микротрубочек и время, прошедшее между двумя кадрами.
- Вычислить скорость роста или укорочения путем деления изменения длины по времени (единица мкм / с). Для каждого условия лечения, следуют по крайней мере, 10 клеток и измеряют по меньшей мере 20 микротрубочки.
- Вычислить среднее значение и стандартное отклонение для каждого условия лечения. Анализ статистической разницы между условиями с использованием критерия Стьюдента. Сообщить данные в таблице и / или в графике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол , представленный здесь, мы изучали влияние доцетаксела на динамику микротрубочек нормальных (MCF-7 CC) и доцетаксела устойчивостью (MCF-7 TXT) клетки рака молочной железы. Два набора изображений показывают эффекты доцетаксела (0,5 мкМ) на рост микротрубочек и усадка в MCF-7 , CC и MCF-7 TXT клеток (Рис . 1А)
Мы также рассчитывали скорость роста микротрубочек или укорочения при этих условиях в течение двух клеточных линий , и показали , что при 0,5 мкМ, доцетаксел сильно тормозит динамику тубулина из MCF-7 CC клеток , но не MCF-7 клеток TXT (рис 1б).
Рисунок 1: Влияние доцетаксела на микротрубочки Dynamicе годы MCF-7 TXT и MCF-7 CC клеток. Живая съемка была выполнена, как это описано. (А) Выбранные снимки из живого изображения динамики микротрубочек в MCF-7 , CC и клеток линии MCF-7 TXT после обработки 0,5 мкМ доцетакселом в течение 1 ч. Стрелка указывает на простирающиеся микротрубочки. Стрелолист указывает укорочение микротрубочек. Размер бар = 5 мкм. (B) Скорость расширения и сокращения скорости микротрубочек были измерены с записанными изображениями. Каждый элемент данных представляет собой среднее из 20 измерений, по меньшей мере 8 различных клеток. Строка ошибки стандартная ошибка. ** Указывает на то, что различие является статистически значимым, с p <0,01. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть два основных метода для измерения динамической нестабильности микротрубочек: в пробирке и в естественных условиях. В способе в пробирке, очищенный тубулин используется для измерения динамической нестабильности микротрубочек с компьютерной повышенной покадровой дифференциального интерференционного-контрастной микроскопии. В способе в естественных условиях, микроинъекции флуоресцентной тубулина, или выраженный GFP-тубулина, встроен в микротрубочки. Динамика (рост и усадка) микротрубочек затем регистрируется покадровой с использованием чувствительного камеры в периферийной области интерфазных клеток 10, 20, 25. В то время как различные типы микроскопов были использованы для этой цели, протокол мы сообщали здесь используется деконволюции микроскоп.
В естественных условиях, динамическая неустойчивость возникает только при микротрубочки плюс концах (концы с β-тубулина наружу), в то время какминус концы (Концы с альфа-тубулина , обращенной наружу) остаются теми же длина 26. С другой стороны, для микротрубочек , собранных в пробирке, динамическая неустойчивость имеет место на обоих концах микротрубочек, с плюс - концы быть более устойчивыми , чем минус концы 27. Главное преимущество анализа динамической нестабильности в пробирке является то , что она обеспечивает механистической информации о конкретной роли различных агентов на динамику микротрубочек в отсутствие клеточных Картах. Кроме того, в условиях , в пробирке, динамическая неустойчивость может быть изучена на обоих концах. Это дает представление о механизмах, с помощью которых лекарственные средства или регуляторные белки влияют на стабильность микротрубочек на противоположных концах. Исторически сложилось так , что концы минус отслеживаются гораздо меньше , чем плюс - концы 10. Большая часть нашего понимания микротрубочек поведения происходит от исследований на микротрубочки , собранных из очищенного тубулина в пробирке. Тем не менее, в то время как многие из основных принципов поведения микротрубочек , полученных от этих исследований также могут быть применены к микротрубочек в клетках, существуют определенные различия в динамике микротрубочек между в пробирке и в естественных условиях. В клетках микротрубочки часто растут в пяти- до десяти раз более высокую скорость, а также переходы между ростом и / или сокращения происходят в 10 раз ~ чаще , чем с микротрубочками , собранных из очищенного тубулина в пробирке. Есть также кардинальные изменения в организации микротрубочек и динамика в течение всего клеточного цикла, которые отражают высокую степень пространственной и временной регуляции клеточного поведения микротрубочек. Такое поведение не может быть изучены исследования в лабораторных условиях . Кроме того, регулирование динамики микротрубочек достигается за счет тубулина посттрансляционной модификации, экспрессии тубулина изотипа, и большая группа Картах и в других микротрубочек взаимодействующих белков, которые либо стабилизировать или дестабилизировать микротрубочки 28, 29. Поэтому, изучая нестабильность микротрубочек в живых клетках гораздо более физиологически это применимо.
Описанный здесь метод является простым и очень надежным протоколом для изучения динамики микротрубочек в живых клетках. Шаги, которые требуют большего внимания, выбор камеры для наблюдения и определения времени экспозиции. Крайне важно, чтобы выбрать клетки, которые являются плоскими и имеют высокую интенсивность флуоресценции GFP-тубулина. Кроме того, желательно, чтобы уменьшить интенсивность возбуждения и время экспозиции, чтобы избежать угасания флуоресценции GFP. Конечно же , как и все другие в естественных условиях методов, этот протокол не подходит для изучения динамической нестабильности микротрубочек при различных условиях манипулировали. Например, различные изоформы альфа- и бета-тубулина, могут вести себя по-разному с точки зрения динамики микротрубочек. Только в пробирке методы могут быть использованы для STudy эффекты отдельных очищенных тубулина микротрубочек изоформ на динамической неустойчивости. Кроме того, по сравнению с микроинъекции флуоресцентно-меченного тубулина, экспрессия GFP-меченный тубулин путем трансфекции или трансдукции плазмид могут демонстрировать относительно более низкое отношение сигнал-шум. Тем не менее, экспрессия GFP-меченый тубулина в клетках путем трансфекции или трансдукции плазмид позволяет больше свободы экспериментально изменять другие клеточные характеристики.
Протокол сообщил здесь может быть использован для различных исследований. С одной стороны, он может предложить новые и важные идеи в отношении функции микротрубочек во время различных фаз клеточного цикла, особенно в митозе. Он также может быть использован для изучения влияния различных клеточных процессов, таких как миграция, на динамику микротрубочек. С другой стороны, он может быть использован для изучения влияния различных ингибиторов микротрубочек (многие из них являются противораковые препараты) на динамику микротрубочек в нормальных иРаковые клетки при более физиологических условиях. Мы использовали этот метод для изучения влияния различных анти-митотических лекарства от рака на микротрубочки динамической неустойчивости в обоих доцетаксела, устойчивых и не доцетаксел раковых клеток молочной железы устойчивы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
