Summary
Vi beskriva ett protokoll för att upptäcka samtidiga uttryck av leukemi stamceller markörer på primär akut myeloisk leukemiceller genom flödescytometri. Vi visar hur att kvantifiera tre stamceller populationer och en förmodad LSC befolkning med ökande grad av mognad. Vi bekräftat förekomsten av dessa populationer i motsvarande patient-härrör-xenograft.
Abstract
Akut myeloisk leukemi (AML) är en heterogen, och om den inte behandlas, dödlig sjukdom. Det är den vanligaste orsaken till leukemi-associerad dödlighet hos vuxna. Inledningsvis är AML en sjukdom av hematopoetiska stamceller (HSC) kännetecknas av gripandet av differentiering, efterföljande ackumulation av leukemiceller blast, och minskade produktionen av hematopoetiska funktionselement. Heterogenitet sträcker sig till förekomsten av leukemi stamceller (LSC), med denna dynamiska cell fack utvecklas för att övervinna olika selektionstryck som ålagts under leukemi progression och behandling. För att ytterligare definiera LSC befolkningen, tillåter tillsats av CD90 och CD45RA diskrimineringen av normala Förenta och multipotenta stamfäder inom CD34 + CD38-cell facket. Här, beskriva vi ett protokoll för att identifiera samtidig uttryck av flera förmodade LSC markörer (CD34 CD38, CD45RA, CD90) på primära blast celler av mänskligt AML av multiparametric flödescytometri. Dessutom visar vi hur man kvantifiera tre stamceller populationer och en förmodad LSC befolkning med ökande grad av mognad. Vi bekräftat förekomsten av dessa populationer i motsvarande patient-härrör-xenograft. Denna metod för detektion och kvantifiering av förmodad LSC får användas för klinisk uppföljning av kemoterapi svar (dvs., minimal residual sjukdom), eftersom kvarstående LSC kan orsaka AML återfall.
Introduction
Akut myeloisk leukemi (AML) är den vanligaste orsaken till leukemi-associerad dödlighet. Inledningsvis är AML en klonal sjukdom av hematopoetiska stamceller (HSC) kännetecknas av gripandet av differentiering, efterföljande ackumulation av blast celler, och minskade produktionen av hematopoetiska funktionselement. Klonal heterogenitet av blast cell befolkningen har nyligen fastställts i huvudsak genom att använda nästa generations sekvensering (NGS) strategier och visar förekomsten av Intra klonal evolution av tumör celler1.
Heterogenitet sträcker sig till förekomsten av leukemiska stamceller (LSC). Det antas som dynamiska cell kupén utvecklas för att övervinna olika selektionstryck som ålagts under leukemi progression och behandling. Därför LSC förväntas vara resistent mot nuvarande kemoterapiregimer och medla återfall, med djupgående kliniska konsekvenser2. Olika markörer har beskrivits för att karakterisera LSC som CD1233, KLL-14, CD975 eller TIM-36. CD34 + CD38-facket blast celler anses vara berikad för LSC7 men innehåller även normala HSC. CD90 och CD45RA uttryck tillämpas på den CD34 + CD38-(P6) fack (figur 1) tillåter för att segregera flera skeden av normala och maligna hematopoetisk prekursorer8. Specifikt, normala CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-Förenta, multipotenta stamfäder (MPP) som CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-celler och CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymfoida-primade multipotenta stamceller (LMPP) celler kan bestämmas i majoriteten av AML fall8 ,9. Genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) av CD38 är särskilt viktigt att betraktas inom CD34 + celler facket. Eftersom CD38 intensitet definierar tre nya cell fack därav: CD38 negativ (P6), CD38 dim (P7) och CD38 ljusa (P8) (figur 1). Den MFI av CD38 kan bestämmas med antingen hematogones eller plasmaceller som intern positiva kontroll som dessa celler uttrycker starkt CD38.
Nedsatt immunförsvar nicka/SCID/IL2Rγcnull (NSG) musmodell används ofta för engraftment av normala och maligna mänskliga hematopoetiska celler10,11. Seriell xenotransplantation analyser används för att validera experimentellt LSC eller HSC funktion. Dessa studier har analyserats utförligt genom storskalig sekvensering metoder. Dock är mindre känt om den LSC och HSC immunophenotype av AML blast befolkningen rekonstituerades till NSG möss jämfört med dess primära AML (figur 2).
Numrerar av LSC är till sin natur låg således, identifiering och kvantifiering av LSC är utmanande och den metod som beskrivs här kan användas som ett flöde flödescytometrisk analys vid diagnos och vid kliniska följa att utvärdera kemoterapi svar (som kvarstående LSC kan orsaka AML återfall). Förekomsten av LSC tyda positiva minimal residual sjukdom (MRD). Hittills, MRD övervakning i AML oftast lita på molekylära metoder (dvs, RT-PCR, NGS)10,12. Dock i detta protokoll upptäcka vi samtidiga proteinuttryck av flera HSC/LSC markörer (CD34 CD38, CD45RA, CD90) på primära blast celler av mänskligt AML av multiparametric flöde flödescytometri2,8,9. Denna kombination av antikroppar kan tillämpas i alla standard strömningslaboratorium flödescytometri och denna flöde MRD analys är särskilt intressant när MRD av realtid polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) inte är möjligt, dvsom leukemi specifika molekylära markörer är inte detekterbar i diagnostiska AML provet. Dessutom kompletterar detta protokoll, de mer känsliga molekylär MRD teknikerna, eftersom det syftar till att påvisa och kvantifiera de onormala hematopoetiska progenitorceller som representerar en funktionell cell egenskap (figur 3).
Vi visar hur att kvantifiera tre hematopoetiska stamceller befolkningen och det förmodade LSC facket med olika grad av mognad av flödescytometri med antikroppar tillgängliga i flesta kliniska laboratorier. Dessutom vi bekräftat förekomsten av dessa cell avdelningar i motsvarande patient-härrör-xenograft (PDX) och vid behandling uppföljning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi följer Europeiska standarder för användningen av djur för vetenskapliga ändamål. Studien var godkänd av den lokala etiska kommittén (#3097-2015120414583482v3).
1. provberedning
- Samla in benmärg (2 mL) från de novo AML i rör som innehåller antikoagulerande etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) vid en koncentration på 1,8 mg per mL benmärg.
- Utföra Ficoll-separering, en täthet lutning separation att isolera mononukleära celler från röda blodkroppar och granulocyter, som följde. Späd benmärg i 3 volymer fosfat buffert saltlösning (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Noggrant overlay 1 volymdel Ficoll med 1 volymdel utspädda benmärg. Spinn 30 minuter vid 300 x g utan broms. Över vit lättcellsskikt lagret av mononucleated celler till en ny sterilt rör.
- Tvätta cellerna två gånger i 10 mL PBS) och centrifugera vid 300 x g i 5 min, för att ta bort kontaminerande serum komponenter.
2. lys av röda blodkroppar (RBC)
- Tillsätt 2 mL lyseringsbuffert (ammoniumklorid 0,8%) till cellen pellet, vortex försiktigt och odla i rumstemperatur i 5 min. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
Obs: om det behövs, upprepa detta steg. - Tvätta cellerna i PBS som tidigare beskrivits (1.3.).
3. patienten härstammar xenograft.
- Få spränga celler från benmärg efter Ficoll-separering och efter lymfocyter utarmning med immunmagnetisk negativa urval (CD3 för T- och CD20 för B-lymfocyter). Följ tillverkarens instruktioner.
- Injicera 5 x 106 AML blast celler i svansen ven obetingade NSG möss. Använda en fasthållande anordning för att underlätta svans ven injektion. Hålla möss konventionella villkor och särskilt på specifika-patogenfria villkor på alla tider, med individuella ventilerade burar och genom manipulering enligt LAF. Varannan vecka, ta 60 µL blod genom metoden submandibular samling med en hematokrit kapillär. Plats kapillären till en 5 mL rund botten röret. Stoppa blödningen genom att tillämpa mild tryck med hjälp av en liten steril kompress. Expulse blod med en ren spruta.
- Tillsätt 1ml lyseringsbuffert och inkubera i 5min. Sedan Centrifugera 300 x g för 5min. Tvätta med PBS och centrifugre på 300 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten, Lägg till 100 µL PBS med 10% bovint serumalbumin (BSA) fläck med 3 µL anti-humant CD45-FITC och 1 µL mot murint CD45-APC och inkubera vid 4 ° C i 30 minuter.
- Tvätta cellpelleten två gånger i PBS (2 mL) med 10% BSA och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter.
- Alikvotens upp till 1 x 106 celler per 100 µL av PBS in flödet flödescytometri rören.
- Undersökning engraftment varannan vecka av chimärism analys av CD45 uttryck (mänskliga kontra murina) med hjälp av flödescytometri (figur 2A och B).
- På offer (perifera blast antal större än 70% eller allvarliga kliniska tecken på sjukdom), samla mononukleära blast celler från krossade mjälte och benmärg genom spolning skenbenet och lårbenet med PBS som tidigare beskrivits13. Euthanize möss av cervikal dislokation följer internationella riktlinjer.
- Om cellpelleten innehåller RBC, utföra lys av röda blodkroppar med lyseringsbuffert (steg 2.1).
- Tvätta cellerna pellet två gånger i PBS (2 mL) med 10% BSA och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Samla in celler och alikvotens upp till 1 x 106 celler per 100 µL av PBS i flödet flödescytometri rör.
4. färgning
- Lägga till konjugerade antikroppar (se steg 4.2) och vortex. Inkubera cellerna i 15 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Använd panelen följande humana primära eller PDX exempel bestående av 10 µL anti-CD36-FITC, 5 µL anti-CD19-ECD, 5 µL anti-CD33-PC5.5, 5 µL anti-CD90-APC, 5 µL anti-CD34-AA700, 5 µL anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL anti-CD38-Pacific blå, 5 µL anti-CD123-PC7 och 2,5 µL anti-CD45-ko.
- Avlägsna obunden antikroppar genom att tvätta cellerna i 2 mL PBS genom centrifugering vid 300 x g i 5 min.
- Resuspendera cellerna i 450 µL av PBS för slutliga flöde flödescytometrisk analys.
5. gating strategi för flödescytometri Flödesanalys
- Utföra datainsamling (minst 500.000 celler) på en flödescytometer utrustade med röd, blå och violett Laser. Kontrollera inställningarna för cytometer varje dag (1) optisk justering, 2) fluidic system, 3) optisk känslighet och 4) standardisering med hjälp av fluorospheres
- Följ den sekventiella Usenets strategin för att definiera CD38 uttryck (figur 1).
- Använda celler från normal benmärg prover för att definiera hematogones eller plasma celler som fungerar som positiv kontroll för CD38 uttryck.
Obs: denna grind är särskilt viktigt att bedöma eftersom efterföljande förmodad LSC populationer är beroende av dess definition. - Definiera fysiologiska prekursorer celler (normal blast celler) av CD45dim/SSC (side scatter) låg befolkningen kriterier (figur 1A). Inom detta blast befolkning, definiera hematogones, som visar en CD38 ++ CD19 + fenotyp (figur 1B) och slutligen använda CD36 och CD33 uttryck för att definiera myeloblasts, monoblasts och erytroblaster (figur 1 c). Fastställa CD34 uttryck på hematogones som visas i (figur 1E). Bedöma flera delpopulationer av prekursorer i blast cellerna definieras som P6-P10 (figur 1 d). Separata CD34 facket blast celler till P6, P7, P8 stamceller subpopulations baserat på förinställda CD38 grindar. Säkerställa att de P8 kupén Blaster som har samma CD38 intensitet som den hematogones, att P6 innehåller celler som CD38-baserade på CD38 fluorescensen minus en (FMO) kontroll och att P7 celler är mellan de två ytterligheterna när det gäller CD38 uttryck (figur 1 d).
- Använda celler från normal benmärg prover för att definiera hematogones eller plasma celler som fungerar som positiv kontroll för CD38 uttryck.
- Från CD34 + 38-(P6) separat gated celler, HSC från förmodade LSC med CD90 och CD45RA-uttryck (figur 1F).
Obs: den HSC-fenotypen är CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- och multipotenta föräldraparets (MPP) definieras som CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Den förmodade LSC fenotypen är CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + och mer omogna nedströms befolkningen är lymfoida-primade föräldraparets (LMPP) definieras som CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. MRD övervakning av RT-PCR
- Övervaka MRD nivåer av RT-PCR som tidigare beskrivits14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi en metod för att bestämma stamceller populationer i normala och maligna mänsklig benmärg prover. Vi samlat benmärg och mjälte från en framgångsrik PDX och utförde multiparametric flödescytometri som beskrivs ovan. Vi jämförde flera subpopulations av blast celler mellan diagnostiska patientprovet och den motsvarande PDX och särskilt CD34 + CD38-stamceller facket, särskilt berikad i förmodad LSC. Vi har funnit att andelen CD34 + CD38-blast var högre i PDX jämfört med det diagnostiska patientprovet (3,48% jämfört med 0,53%, figur 2 c, D). Intressant nog fann vi en högre andel av förmodad LSC (visar en CD34 + CD38-CD90-CD45RA + fenotyp) i den PDX jämfört med det primära patientprovet (2,76% vs. 0,48%, figur 2E, F), vilket tyder på en möjlig anrikning av maligna stamceller i hematologiska vävnader i denna musmodell. Frekvensen av normal progenitor cell fraktioner skilde sig inte mellan PDX och patientprovet.
Dessutom studerat vi de blast stamceller cellpopulationer baserat på uttrycket av CD34, CD38, CD90 och CD45A (som beskrivs i detta protokoll) i två olika patientprover, vid diagnos och behandling uppföljning att bestämma nivån på MRD. I den första patienten, den CD34 + CD38-(P6) fraktionen ökade från 0,06% vid diagnos till 3.33% vid första uppföljningen av behandling (figur 3A, B). I kontrast, den CD34 + CD38-(P6) andel minskade i andra patienten från 7,8% vid diagnos till 2,27% vid första uppföljningen av behandling (figur 3 C, D). Följaktligen den förmodade LSC-fraktionen ökade i den första patienten från 0% vid diagnos till 0,65% (figur 3A', B') och minskade inom andra patienten från 6,57% vid diagnos till 1,44% vid uppföljning av behandling (figur 3 c ', D'). Likaså MRD övervakning av molekylära markörer (dvs, NPM1-mutation [första patienten] och CBFB-MYH11 translokation [andra patienten]) visade att molekylär MRD minskar mindre i den första patienten (0,8%) jämfört med andra patienten (0,05%) behandling uppföljande punkt (figur 3E, G). Slutligen, för att validera att förmodad P6 LSC är maligna, uttryck av leukemi associerade antigener CD123 och CD33 uppskattades, visar onormal uttryck för CD33 för både patienter (figur 3F, G).
Figur 1 : Gating strategi används för fysiologiska prekursorer och AML Blaster. Densitet tomt med gating av fysiologiska prekursorer visas för en normal benmärg. (A) Gating blast celler utifrån CD45dimSSClow fenotyp på alla mononucleated celler. (B) Gating av hematogones (CD38 + CD19 +) för verifiering av CD38 positivitet. (C). Gating strategi av normal myeloblasts, monoblasts och erytroblaster baserat på CD33 och CD36. (D) Blast celler kan delas in i CD34 + stamceller subpopulationer och använder CD38 uttryck i P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) cell fack. (E) Gating av hematogones baserat på CD34 och CD38 uttryck, kontrollera CD38 positivitet. (G) bestämning av HSC, MPP, LMPP och förmodad LSC subpopulationer med uttryck av CD90 och CD45RA som tidigare beskrivs9. Notera, ingen detektion av LSC eftersom detta är en normal benmärgsprov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Blast stamceller cellpopulationer i en patient och i motsvarande patient-härrör-xenografts (PDX) av multiparametric flödescytometri. (A-B) Chimärism analys av PDX. (A) murina och mänskliga Blaster definieras först efter storlek och struktur (FSC, SSC). (B) därefter procentandelen av mänskliga kontra murina CD45 färgning är vägledande xenoengraftment och leukemi börda. Jämförelse av CD34 + CD38-blast celler andel mellan (C) primär diagnostik och (D) PDX AML provet. Jämförelse av förmodad LSC (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) mellan (E) primära AML och (F) PDX. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Blast cellpopulationer stamceller hos två patienter som vid diagnos och efter induktionsbehandling med eftergift för minimal residual sjukdom (MRD) upptäckt. Flöde flödescytometrisk analys av CD34 + CD38-blast cell subpopulationsna i två representativa patienter (A, C) vid diagnosen och (B, D) efter induktionsbehandling med eftergift. Siffror (A'-D') illustrerar respektive P6 grindar som innehåller förmodad LSC för två patienter vid diagnos och efter initial behandling. Visas i (E, G) är den minimal residual sjukdom (MRD)-analysen av molekylära markörer som används för dessa två patienter under en period på fem månader (NPM1-mutation och CBFß-MYH11 gen fusion, respektive). (F, G) Uttryck för leukemi associerade antigener CD123 och CD33 på förmodad P6 LSC, visar onormal uttryck för CD33 för både patienter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En exakt och reproducerbar bedömning av membran eller cytoplasmisk markörer av flödescytometri kräver att instrumentets inställningar kontrolleras varje dag för optisk justering, korrekt funktionssätt fluidic system, optisk känslighet och standardisering använda kalibrering pärlor.
Upptäckt av blast cellpopulationer i AML med CD90 och CD45RA genom flera parametriska Flödesanalys flödescytometri är en relativt enkel och pålitlig metod. Ett avgörande steg i denna analys är en korrekt bedömning av CD38 uttryck på blast celler, för att kunna utföra korrekta gating av CD34 + CD38-befolkningen. CD38 utvecklingsintensitet definieras med normala benmärgsceller specifikt på hematogones och/eller plasma celler (CD38 +). Intensiteten av andra markörer bestäms med hjälp av isotypen kontroller.
Tillägg av CD45RA och CD90 används för att skilja HSC från förmodade LSC. Den sistnämnda och inte HSC kanske orsaken till återfall, alltså detta protokoll är av intresse för minimal residual sjukdom övervakning med hjälp av flödet flödescytometri paneler. Övervakning av AML under behandling är nödvändigt att förbättra riskstratifiering och vägleda AML terapi. Lämpliga molekylära markörer är tyvärr inte tillgängliga för alla patienter. Därför kan det vara möjligt för samtliga AML-fall MRD övervakning av flödescytometri. Även om denna metod inte kan vara uttömmande som det focalizes på flesta AML-fall som har en CD34 + CD38-stamceller och en förmodad LSC befolkning. Notera är det möjligt att den förmodade LSC-facket kan innehålla normala progenitorceller, dvs LMPP). Dessutom kan vi utesluta att det finns sällsynta fall med funktionella LSC inte följer detta onormala uttryck mönster. Notera, även i NPM1-muterade AML som anses CD34 negativa, kan vi upptäcka förmodad LSC. Därför, trots den heterogenitet och komplexiteten i AML LSC facket, vår metod kan användas som en biomarkör för kemoterapi svar under uppföljning av AML.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av den franska föreningen Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (North Center), Fondation de France (leukemi-kommittén), SIRIC Oncolille och franska National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
