Summary
Neste artigo, um protocolo simples, econômico e otimizado é descrito que usa o método de corante azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN que pode ser adaptada para uso em outras cepas, espécies e outros órgãos ou tecidos.
Abstract
Vazamento vascular ou extravasamento de plasma, tem um número de causas e pode ser uma grave consequência ou sintoma de uma resposta inflamatória. Neste estudo, finalmente, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. É importante que os pesquisadores tenham as ferramentas apropriadas, incluindo os melhores métodos disponíveis, para estudar o extravasamento de plasma. Neste artigo, descrevemos um protocolo, usando o método do corante azul de Evans, para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN. Este protocolo é intencionalmente simples, para tão grande um grau possível, mas fornece dados de alta qualidade. Corante de azul de Evans foi escolhido principalmente porque é fácil para o laboratório de médio a usar. Usamos este protocolo para fornecer provas e suporte para a hipótese de que a enzima neprilysin que proteja a vasculatura contra extravasamento de plasma. No entanto, este protocolo pode ser usado experimentalmente e facilmente adaptado para uso em outras cepas de ratos ou em outras espécies, em muitos diferentes órgãos ou tecidos, para estudos, que pode envolver outros fatores que são importantes para a compreensão, prevenção ou tratamento de extravasamento de plasma. Este protocolo foi extensivamente otimizado e modificado de protocolos existentes e combina confiabilidade, facilidade de uso, economia e disponibilidade geral de materiais e equipamentos, fazendo com que este protocolo superior pelo laboratório média para uso em quantificando o extravasamento de plasma de órgãos.
Introduction
Vazamento vascular nos órgãos refere-se ao extravasamento, ou vazamento de plasma sanguíneo através de aberturas produzido no endotélio de pós capilares vênulas nos órgãos. Este extravasamento de plasma ou aumento da permeabilidade vascular, que pode decorrer de algum tipo de reacção inflamatória, pode ter graves consequências. Assim, é importante que este fenômeno, suas causas, moduladores e consequências, são estudadas e entendidas, e da mesma forma, que os investigadores têm boas ferramentas e protocolos com os quais a estudá-los. As lacunas endoteliais podem ser produzidas através de uma série de estímulos, mas geralmente são produzidas pela ação de neurotransmissores do peptide e/ou taquininas sobre o endothelia. Um dos principais mediadores naturais deste processo, o que resulta em extravasamento de plasma aumentado, é o undecapeptide tachykinin neuropeptide, substância P1.
Métodos para investigar e medir a permeabilidade vascular ou extravasamento de plasma, que usam a propriedade de ligação de albumina de corante azul de Evans, foram desenvolvidos e são geralmente conhecidos pela sua precisão, simplicidade, economia, segurança e capacidade de permitir que o determinação de extravasamento de plasma de vários tecidos ao mesmo tempo, se assim desejado2,3,4,5,6,7,,89 . Este protocolo de azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN usa todas essas, mas adiciona algumas importantes modificações que tornam geralmente útil e adaptável para futuros estudos, envolvendo o laboratório de médio que conduz ou será realizar estudos importantes de fatores associados com extravasamento de plasma ou a permeabilidade vascular. Neste protocolo, a substância P é introduzido aos ratos 1 nmol/kg, o que aumenta o extravasamento de plasma por 1.5-fold. Isto aumenta a sensibilidade do protocolo, resultando em resultados mais facilmente observáveis e alcançável. Outros fatores que afetam a permeabilidade, como vários outros peptídeos, substâncias químicas ou algumas formas de lesão tóxica, podem ser usados ou estudados por outros laboratórios, como desejado. Veia jugular injeções são utilizadas neste protocolo apresentar azul de Evans e substância P sistemicamente, que requer cirurgia terminal. No entanto, veia jugular injeções5,7,10, mesmo após a consideração das necessárias técnicas cirúrgicas terminais, são mais fáceis de dominar e levam à produção de resultados mais consistentes do que outro injeções venosas, incluindo a cauda veia injeções4,9. Embora seja possível para Evans azul ser entregue por injeções de seio venoso orbital retrô, não há referências na literatura foram encontradas que usam este método de entrega de azul de Evans. No entanto, quanto a injeções de veia da cauda, o alto grau de especialização e prática reproducibly dominar esta técnica extremamente limita seu uso para injeções bem sucedidas de azul de Evans. Em contraste, o método de injeção alternativa veia jugular, conforme descrito em nosso protocolo, oferece uma solução tecnicamente obtenível. Um procedimento crucial para perfusão das veias do rato, realizado logo após o sacrifício do rato azul-perfundidos Evans, remove o excesso corante azul de Evans e tem sido padronizado neste protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusão foram cuidadosamente examinados e modificados para obter o presente procedimento. Outras modificações aqui descritas são todos otimizada, simples e barato.
Existem algumas limitações importantes de método de corante azul de Evans. Por exemplo, baixa sensibilidade, às vezes associada com este método pode impedir alguns adicional bruta exame patológico e histológica de tecidos de animais injetado azul de Evans. No entanto, estas e outras limitações conduziram ao desenvolvimento de métodos alternativos e modelos que, não obstante, ainda usam azul de Evans. A medição de azul de Evans por fluorescência (em vez de alcance visual) espectroscopia pode aumentar a sensibilidade do método. Além disso, a microscopia de fluorescência dos tecidos manchadas de azul de Evans foi desenvolvida para permitir a observação de vazamento vascular nas mais distintas localidades11. Também, todo o corpo de imagem e digitalização de um animal vivo previamente injetaram com Evans azul12 permite a investigação das concentrações de azul de Evans de forma contínua, em vez de em um específico escolhido tempo momento do experimento. No entanto, este método requer a disponibilidade de instalações adequadas de imagem e pode ser muito caro. Modificações envolvendo Evans azul e executados em um tipo in vitro do modelo, como em uma célula de cultura ou garota corioalantoicas modelo13 (CAM) também foram descritos. Estes modelos são monitorados por fluorescência e microscopia intravital14 e permitam a quantificação de alterações de permeabilidade vascular ao longo do tempo, mas podem levantar questões sobre modelagem exata das condições na vivo e também podem ser caro.
Há outros métodos desenvolvidos para determinar e quantificar vazamento vascular ou permeabilidade, que não envolvem a administração de azul de Evans. Esses métodos podem empregar uma molécula fluorescente apropriada (como albumina ou fluoresceína), ou uma molécula etiquetada desvendar etiquetada ou não, de animais vivos (ou a célula cultura ou corioalantoicas (CAM) modelos13, seguido por não-invasiva Imaging (digitalização de PET, MRI, microscopia intravital, varredura de corpo inteiro) ou por invasivas de imagens (microscopia fluorescente)3,12,15. Embora essas técnicas podem oferecer um número de vantagens sobre outros Evans métodos azuis, eles também têm desvantagens, que podem incluir seus consideráveis complexidades, necessária experiência, recursos e elevados custos monetários.
Neprilysin16 (peptidase enzima NEP, também conhecido como CD10, MME ou Enkephalinase) foi sugerido para ser envolvido na inibição de extravasamento de plasma, pelo menos em parte, através do metabolismo enzimático e inactivação de p. de substância endógena Assim, nos tecidos em que ocorre o peptidase de superfície celular NEP, pode haver uma atenuação do efeito da substância P, presumivelmente pela atividade peptidase de NEP.
Inicialmente, nós testamos para extravasamento de plasma induzido por substância P, utilizando este protocolo modificado de azul de Evans, com FVBN selvagem tipo (WT) e ratos de NEP nocaute (KO). Envolvimento do NEP no extravasamento de plasma aumentada de substância P suspeitou-se destes estudos iniciais, e nós descrever estas experiências ainda mais o papel do NEP envolvendo em extravasamento de plasma. No entanto, não é o foco deste manuscrito NEP ou seu papel no extravasamento de plasma, mas prefiro o extravasamento de plasma experimentos próprios. Os resultados do NEP são representativos do tipo de resultados que podem ser obtidos através do uso do presente protocolo modificado. O método de azul de Evans para medir o extravasamento de plasma foi otimizado e modificado, conforme descrito em detalhe abaixo para os ratos FVBN.
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Protocol
Todas as orientações aplicáveis internacionais, nacionais e/ou institucionais para o cuidado e o uso de animais (ratos) foram seguidas nos experimentos descritos neste manuscrito.
Esse método usa ratos adultos FVBN, com idades entre 16-20 semanas, encontrado para ser o ideal para os fins deste estudo. Dia 1 inclui as etapas 1 a 5 e dia 2 inclui as etapas de 6-7 (Figura 1).
1. preparação do material
- Assegurar um fornecimento adequado de seringas descartáveis, esterilizadas e agulhas, se xilazina/cetamina é usada como anestésico (como recomendado). Se isoflurano é usado como anestésico, verifique se o tanque de oxigênio e o nível do líquido de isoflurano para certificar-se de que há um fornecimento adequado para o experimento antes de começar. Também, montar o cone do nariz respirando circuitos e anexá-los à caixa de indução; Anexe novos cilindros de carvão para os circuitos de respiração. Prepare a caixa de indução ligando o oxigênio e verificar que a segunda fase lê aproximadamente 50 psi.
- Ligue o aquecimento pad a 37 ° C.
- Prepare a sonda de temperatura retal para a cirurgia.
2. Mouse preparação
Esta etapa inclui anestesia, depilação e posicionamento (FVBN ratos-idade adulta 16-20 semanas).
- Pesar os ratos e registar os pesos.
- Anestesia os ratos.
- Administrar IP ketamina e xilazina (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, respectivamente). No entanto, recomenda-se começar com doses menores de ketamina e xilazina (sobre 30 mg/kg e 6 mg/kg, respectivamente).
- Manter a anestesia com cerca de 0,1 - 0,25 vezes inicial doses de cetamina/xilazina durante a cirurgia. Ketamina e xilazina foram o agente anestésico (s) de escolha neste estudo específico, como observaram-se mais a reprodutibilidade e a capacidade de sobrevivência. O agente anestésico (s) de escolha em outros estudos pode ser encontradas para ser diferente. Se o isoflurano é usado, coloque o mouse em uma câmara de indução e ligue isoflurano para 5% até o mouse perde a consciência plena. Em seguida, use um cone de nariz nasal de isoflurano 1,5-2,5% no restante do processo.
- Monitore os ratos cada 2-3 min pitada de dedo do pé para verificar se há profundidade apropriada da anestesia.
- Raspe a região do pescoço ventral do mouse.
- Posicione o mouse na posição supina sobre a almofada pré-aquecido. Prenda as patas e pés do mouse à superfície com fita cirúrgica.
- Coloque a pomada de lágrima artificial para os olhos para evitar que sequem durante a cirurgia.
3. detalhes cirúrgicas
- Faça uma incisão de 1 cm no pescoço bem ventral sobre a veia jugular.
- Aplica uma ou duas gotas de lidocaína (1-2%) para a área de incisão para tratamento da dor e promover a vasodilatação. Espere 2 min. para a lidocaína seja efetivada.
- Expor e isolar a veia jugular interna direita através de dissecção romba. Amarrar a veia com sutura de 4-0 e gentilmente retrair extremidade rostral do navio com uma pinça hemostática. Corte um buraco, usando a tesoura bem, cerca de 3 mm abaixo ou caudal para a gravata, aproximadamente na metade do diâmetro da veia.
- Marcar um cateter de polivinil PV-1 1,5 cm da extremidade e inseri-lo na veia jugular no orifício, usando um dilatador de vaso e passe o cateter no caudal final do navio, cerca de 1,5 cm.
- Amarre o cateter firmemente dentro da parte caudal do navio (abaixo do corte), com seda 4-0. Amarre a parte rostral do navio à parte externa do cateter, com as pontas soltas da sutura que foi usado para amarrar a veia jugular rostral, na etapa 3.3.
- Aderência a pele frouxamente de volta ao redor do cateter com seda 4-0 para ajudar a prevenir a perda de calor do corpo e desidratação dos tecidos.
- Conectar o cateter a uma seringa contendo soro fisiológico heparinizado (10 U/mL) e irrigue o cateter.
4. injeções
- Injete a solução de azul de Evans (50 μL de solução 30 mg/mL em soro fisiológico a 0,9% normal, unheparinized, ou aproximadamente 50 mg/kg) o cateter da veia jugular, seguido por um pequeno volume de solução salina heparinizada para liberar a linha.
- 2 min depois, injetar substância P (100 μL de solução 0,3 mm em soro fisiológico a 0,9% normal, unheparinized, ou 1 nmol/kg), seguido por um pequeno volume de solução salina heparinizada para liberar a linha. Substância P aumenta o extravasamento de proteínas do plasma através da camada endotelial; neste protocolo, rotineiramente induz um aumento dos valores de extravasamento de plasma de aproximadamente 1.5-fold, facilitando a plasma valores de extravasamento medir.
- Espere 18 min depois que a substância P é injetado. Durante este tempo, o corante azul de Evans vai equilibrar e fazer circular.
- Encerrar o experimento 18 min após a injeção da substância P (20 min após a injeção de azul de Evans), sacrificando o mouse com deslocamento cervical. É provável que o mouse pode ser diretamente cervically deslocado, sem primeiro dar uma overdose de anestésico, como o mouse é provavelmente ainda bem anestesiado da cirurgia. No entanto, se for necessário, uma overdose de anestésico cetamina/xilazina, isoflurano, o pentobarbital pode ser dadas, seguido por deslocamento cervical.
5. isolamento dos órgãos
- Abrir a cavidade do peito do rato e gravidade-perfundir (de uma altura de cerca de 51 cm ou 20") o coração e os vasos sanguíneos com 50 mL de citrato de sódio de 50 mM, pH 3,5. pH 3.5 presumivelmente preserva a ligação azul de Evans a albumina.
- 1-5 órgãos pertinentes (tecidos) com um bisturi de dissecação (por exemplo, a bexiga urinária, rim, estômago, fígado, pâncreas, proximal ou distal do cólon, íleo, duodeno, flanco pele, orelhas, cauda, coração, e/ou pulmões) impostos especiais de consumo e remover qualquer conteúdo residual, se presente.
- Lave os órgãos em temperatura ambiente (RT) fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8,0 g de NaCl e 0,20 g de KCl em 1 L, pH 7,4).
- Blot-os órgãos com tecido, corte cada órgão ao meio, e pesar cada metade (molhado pesos, em g).
- Secar uma metade do tecido em um forno de secagem a 150 ° C, na folha, por 48 h.
- Coloque o metade em um volume consistente (até 200 µ l) de formamida em uma microcentrífuga tubo para 48 h (e até 72 h) outros tecidos para extrair o azul de Evans.
6. medição de tecido OD
- Retire 50 µ l de Evans azul-infundido formamida (após incubação de 48-72 h RT) do tubo de microcentrífuga e lugar para um poço de uma placa de poliestireno de 96 poços. Tenha cuidado para não transferir partes de tecido junto com o formamide.
- Colocar 50 µ l de formamida nova, pura, em cada um dos dois poços vazios da placa de 96 poços para os espaços em branco.
- Medir e registrar o OD620 de cada poço da placa de 96 poços em um leitor de placa de absorvância. 620 nm é a absorbância máxima de azul de Evans.
7. cálculo de extravasamento de Plasma
- Pesar o tecido seco metade que foi ao forno por 48 h.
- Calcule a relação de peso de peso molhado/seco para o órgão específico de interesse de cada mouse individual, começando com o peso molhado deste tecido metade (obtidos no passo 5.4), dividido pelo peso seco do tecido mesmo metade (obtidos no passo 7.1).
- Calcular o peso seco do tecido (em g) metade em formamida, dividindo o peso úmido do tecido metade antes que ele foi colocado em formamida (obtida na etapa 5.4) pelo molhado: relação de peso seco para o órgão específico de juros (calculados na etapa 7.2).
- Calcule os valores corrigidos de620 OD. Começando com o OD620 o valor de cada poço experimental da placa de 96 poços (contendo Evans azul-infundido formamide de cada tecido, obtido na etapa 6.3), subtrair o valor em branco bem OD620 (o OD620 valor médio de os dois poços que contêm o formamide puro, preparado na etapa 6.2, OD620 valores obtidos na etapa 6.3) de cada valor experimental.
- Calcule o valor de extravasamento de plasma dividindo o OD corrigido620 (calculado na etapa 7,4) por peso seco do tecido metade em formamida (calculado no passo 7.3). As unidades de extravasamento de plasma será o peso seco da OD620/g.
- Analisar dados e expresso como a média ± SEM. estatisticamente comparar grupos pelo teste t ou unidirecional análise de variância e teste de comparação múltipla de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), conforme o caso.
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Representative Results
Na Figura 1, um esquema do procedimento é mostrado, que foi encontrado para resultar nos valores de extravasamento plasma induzido por substância P mais confiável e consistente de órgãos de ratos FVBN. Este procedimento geralmente leva dois dias de trabalho, separados pelo menos 48 h de tempo de espera. É possível para espalhá-lo ainda mais, se isso for feito consistentemente para todos os experimentos a serem comparadas. Por exemplo, depois que os órgãos são isolados no dia 1, os órgãos podem ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C; após descongelar cuidadosamente os órgãos (dentro de alguns dias a 1 semana), podem ser lavados em PBS e apagados antes do resto do protocolo. Também, embora a secagem dos tecidos deve ser feita como indicado (a 150 ° C durante 48 h), a extração de Evans, azul do tecido metade em formamida pode ser prorrogado de 48-72 h, enquanto o tempo em formamida é consistente para todos os experimentos.
Mostrado na Figura 2 e tabela 1 dados demonstra extravasamento de plasma induzido por substância P da bexiga urinário de tipo selvagem FVBN (WT) e NEP de camundongos nocaute (KO)17, que estavam disponíveis, principalmente devido a deste laboratório interesses de longa data em NEP e o regulamento e ações de neuropeptídeos selecionado18,19. Camundongos KO NEP não expressam NEP em qualquer tecido. No entanto, NEP é expresso dentro da bexiga urinária de ratos WT, embora a níveis baixos de21,20,22. Figura 2 e tabela 1 sugerem que há uma diferença de extravasamento de plasma induzido por substância P da bexiga urinário destes dois grupos de ratos. Isto implica um papel para o NEP em extravasamento de plasma induzido por substância P da bexiga urinária, uma vez que a expressão do NEP é, potencialmente, a principal diferença na bexiga urinário de camundongos WT e NEP KO.
Porque os dados originais sugeriam um possível papel para NEP em extravasamento de plasma induzido por substância P na bexiga urinária (Figura 2 e tabela 1), decidimos investigar mais plenamente o envolvimento do NEP no extravasamento de plasma em outro órgão. Primeiro, criamos um mouse duplamente transgênico para overexpress NEP quase universalmente23. Este rato engenharia permitiu uma comparação de dados de três tipos de ratos FVBN: WT ratos16, que naturalmente expressam uma quantidade limitada de NEP em muitos tecidos; NEP KO ratos17, que expressam não NEP em qualquer tecido; e nosso duplamente transgénicos NEP overexpressor ratos23, qual NEP overexpress em quase todos os tecidos após a administração de doxiciclina. Os ratos são permitidos acesso gratuito a doxiciclina, contendo comida para 1 semana antes da cirurgia (Figura 1); dose de doxiciclina é de 1 mg/kg de chow, undyed. A construção destes ratos transgénicos duplamente que overexpress NEP foram detalhada, com descrição dos ensaios do NEP, faroestes e NEP mRNA qPCR23.
Com estes 3 tipos de ratos, este protocolo mostra um papel de NEP em extravasamento de plasma nos tecidos, incluindo o duodeno23 (Figura 3 e tabela 2). Nesses experimentos, a superexpressão de NEP nos ratos transgénicos duplamente NEP overexpressor foi ativado por alimentação, por 1 semana antes do dia 1, chow contendo doxiciclina (undyed; rango de doxiciclina/mg mg 1, Figura 3um). Como um controle, alguns ratos WT e NEP KO também foram alimentados com o chow undyed doxiciclina durante a semana anterior a dia 1 (Figura 3b e 3 c).
Para confirmar o papel do NEP no extravasamento de plasma no duodeno de ratos FVBN, a expressão do NEP no duodeno de FVBN WT e NEP (duplamente transgénico) ratos de overexpressor alimentaram o chow doxiciclina foi confirmado pela análise ocidental com um anticorpo policlonal contra NEP humana (que cross-reacts com mouse NEP)23. Esta análise confirmou que duodenums WT expressam quantidades moderadas de proteína a NEP, mas os duodenums de overexpressor do NEP expressam x 2-3, os montantes de NEP expressos por duodenums o WT. Os camundongos KO NEP, por definição, não expressam qualquer NEP no duodeno.
Figura 1: esquema geral de protocolo para medir o extravasamento de plasma induzido por substância P. Esquema do protocolo para medir o extravasamento de plasma induzido por substância P de órgãos de ratos FVBN (16-20 semanas de idade). Este protocolo envolve a medição de extravasamento de plasma do tecido pelo método de corante azul de Evans, através de injeção na veia jugular e incorpora exogenamente administrada substância P, para obter o extravasamento de plasma aumentada e facilmente medido valores, em unidades de OD620/g peso seco. O protocolo descrito foi encontrado para resultar em valores de extravasamento de plasma induzido por substância P consistente de vários órgãos de ratos FVBN e leva no mínimo dois dias de trabalho. Dia 1 e dia 2 são separados pelo menos 48 h de tempo de espera para os tecidos secar e extrair. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Extravasamento de plasma induzido por substância P da bexiga urinária de ratos NEP KO e WT. Extravasamento de plasma bexiga urinária de ratos FVBN (sem prévia doxiciclina) aumentada pela administração de substância P e expressa em OD620 nm/g peso seco. Bexigas urinário foram isoladas de tipo selvagem FVBN (WT; barra branca, n = 12) ou nocaute FVBN NEP (KO; barra preta, n = 7) ratos e submetido ao protocolo de extravasamento de plasma como detalhado acima. Os valores individuais são descritos na tabela 1. Linhas acima das barras representam o erro padrão da média (SEM). Os valores WT e NEP KO direcionados em direção a uma diferença significativa de p = 0,051 pelo teste t. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Extravasamento de plasma induzido por substância P do duodeno de ratos de overexpressor WT, NEP KO e NEP. (A-C) Extravasamento de plasma duodenal aumentada pela administração de substância P e expressa em OD620/g peso seco. (A) Duodenums foram isoladas de ratos FVBN WT sem prévia doxiciclina (-; branco bar, n = 5), camundongos KO NEP sem prévia doxiciclina (-; luz barra cinzenta, n = 5), NEP ovexpressor duplamente transgénica dos ratos sem prévia doxiciclina (DT-; barra cinza escura, n = 5) ou NEP ovexpressor ratos transgénicos duplamente com doxiciclina prévia (DT +; preto bar, n = 4) e submetidos ao protocolo de extravasamento de plasma como detalhado acima. Linhas acima das barras representam o SEM. Embora os NEP KO (-) valores direcionados mais alto que o WT (-) ou o DT (-) valores, esta diferença não foi estatisticamente significativa. Valores de extravasamento de plasma duodenal foram diminuiu significativamente apenas com o grupo de doxiciclina alimentado, ratos transgénicos duplamente ovexpressor NEP (DT +), em comparação com todos os outros (* p < 0.05, análise de variância). (B, C) Valores de extravasamento de plasma duodenal de ratos WT e NEP KO não foram significativamente afetados pela administração de doxiciclina (p < 0,05). (B) WT ratos sem doxiciclina (WT-; barra branca, n = 5) e camundongos WT com doxiciclina (WT +; médio barra cinzenta, n = 7). (C) NEP KO ratos sem doxiciclina (KO-; barra cinzenta-clara, n = 5) e NEP KO com doxiciclina (KO +; médio barra cinzenta, n = 2). Valores individuais, mostrados como uma composição em A, B e C, são descritos na tabela 2. Reproduzido com pequena modificação de Springer jornal artigo23 com permissão da Springer Science + Business Media. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Genótipo | sexo | relação de peso seco/molhado da bexiga urinária | molhar metade o peso da bexiga urinária (g; em 85 formamide μL) | calculado o peso seco da bexiga urinária metade (g) | OD 620 nm - em branco | OD 620 nm/g de peso seco (bexiga urinária) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0,0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0,0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0,0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5,500 | 0,0095 | 0,0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0,0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 4.798 + /-0,105 | 0.0088 + 0.0014 | 0,0018 + /-0.0003 | 0.0336 + 0.0056 | 19.228 + /-2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4,600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0,0025 | 0,0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0,0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 4.503 + /-0,062 | 0.0144 + 0,0032 | 0,0032 + 0,0007 | 0.1020 + 0.0233 | 33.061 + /-4.065 |
Tabela 1: extravasamento de plasma induzido por substância P da bexiga urinária de ratos individuais de WT e NEP KO. Valores de extravasamento de plasma de ratos FVBN (sem prévia doxiciclina) manifestaram-se individualmente como OD620 nm/g de peso seco, de FVBN WT (n = 12) ou NEP KO (n = 7) ratos e submetido ao protocolo de extravasamento de plasma como detalhado acima. Não há diferenças de gênero eram evidentes nos valores de extravasamento de plasma. Bexiga urinária foram isolada; os valores individuais são dadas para a relação do peso de molhado/seco calculado da bexiga urinária, a massa húmida da bexiga urinária metade em formamida, o calculado peso seco da bexiga urinária metade em formamida (em g), a nm OD620 corrigida (amostra OD620 nm menos o nmof meanOD620 os espaços em branco (formamida puro) e o valor de extravasamento de plasma calculados em OD620 nm/g peso (o corrigido OD620 nm, dividido pelo peso seco calculado) seco. Os valores de extravasamento de plasma resultante foram usados para construir a Figura 2.
| Genótipo e doxiciclina chow, sem (-) ou com (+) | sexo | relação de peso seco/molhado do duodeno | molhar metade o peso do duodeno (g; em 85 formamide μL) | calculado o peso seco do duodeno metade (g) | OD 620 nm - em branco | OD620 nm/g de peso seco (duodeno) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0,0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0,0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 5.157 + /-0,105 | 0.0284 + 0,0033 | 0.0055 + 0,0006 | 0.0700 + /-0.0122 | 12.805 + /-1,798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0,0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9,304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 5.527 + /-0,075 | 0.0422 + 0.0049 | 0,0076 + 0.0009 | 0.0943 + /-0.0175 | 11.797 + /-1.142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0,0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0,0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0,0640 | 18.739 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 5.133 + /-0,282 | 0,0228 + 0.0035 | 0,0044 + 0,0005 | 0.0764 + /-0.0078 | 18.362 + /-2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| Quer dizer + /-intervalo (de entradas na coluna acima) | 5.079 + 0.049 | 0.0326 + 0.0133 | 0.0065 + 0,0027 | 0.1290 + 0.0690 | 18.819 + /-2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0,0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5,500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 5.038 + 0.229 | 0.0288 + /-0.0028 | 0,0059 + 0,0008 | 0.0780 + 0.0198 | 13.003 + /-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Quer dizer + /-SEM (das entradas na coluna acima) | 5.121 + 0,159 | 0.0621 + 0.0034 | 0.0122 + 0.0010 | 0.0413 + 0.0147 | 3.729 + /-1.478 |
Tabela 2: extravasamento de plasma induzido por substância P dos duodenums de ratos de overexpressor WT, NEP KO e NEP individuais. Valores de extravasamento de plasma de ratos FVBN (com ou sem prévia doxiciclina) manifestaram-se individualmente como OD620 nm/g de peso seco, de ratos FVBN WT (n = 5, sem e n = 7 com, doxiciclina), NEP KO ratos (n = 5, sem e n = 2, com doxiciclina) e NEP os ratos transgénicos duplamente overexpressor (n = 5, sem e n = 4, com doxiciclina). Os ratos foram submetidos a protocolo de extravasamento de plasma como detalhado acima. Não há diferenças de gênero eram evidentes nos valores de extravasamento de plasma. Duodenums foram isolados; individuais valores usados no cálculo de extravasamento de plasma foram descritos para a tabela 1. Os valores de extravasamento de plasma resultante foram usados para construir a Figura 3A C.
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Discussion
Como discutido acima, o estudo de extravasamento de plasma em última análise, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. O uso bem sucedido do protocolo de extravasamento de plasma (acima), usando o corante azul de Evans, foi demonstrado no manuscrito atual. Embora os dados mostrados volta a hipótese que a NEP pode proteger a vasculatura contra extravasamento de plasma, este é um objetivo secundário atualmente, com o objetivo primário de apresentar um protocolo otimizado que pode ser facilmente utilizado em laboratório de média para o estudos futuros de extravasamento de plasma. O protocolo aqui indicado é focado na adaptabilidade para estudos futuros com objetivos diferentes, animais, órgãos e outras condições e é especialmente útil porque este protocolo é simples de usar, confiável e econômica e leva em conta o general disponibilidade de pessoal competente, reagentes e materiais comuns. É de notar, no entanto, que este protocolo exigirá uma quantidade razoável de repetições por grupo de animais (8-12 repetições sugeridos) para obter os resultados estatisticamente válidos.
Há inúmeros estudos e relatórios detalhando as tentativas de medir a permeabilidade vascular e extravasamento de plasma. De longe, a maioria destes relatórios detalha permutações dos métodos utilizados juntamente com o método de corante azul de Evans, para investigar o extravasamento de plasma e permeabilidade vascular2,3,6,11, 12,13. Há poucos relatos de métodos de permeabilidade vascular que não incorporam Evans azul em todos os3,13,15,24; esses outros métodos são em geral menos acessível para o laboratório de médio, exigindo métodos complicados, equipamento especializado e pessoal e são geralmente caros.
O desenvolvimento do protocolo Evans azul acima envolveu o teste de muitas permutações diferentes e modificações. Primeiros experimentos concentraram-se nas tentativas de injetar Evans azul através da veia da cauda do rato. No entanto, cauda veia injeções provadas tecnicamente desafiador e resultou em resultados inconsistentes, necessitando a inclusão das injeções veia jugular e terminais técnicas cirúrgicas descritas acima. Muitos experimentos preliminares foram também feito tentando encontrar concentrações adequadas de Evans, azul e substância p. A quantidade exata de azul de Evans não foi encontrada para ser imperativa, enquanto era inferior a cerca de 200 mg/kg (em comparação com 50 mg/kg usado atualmente), mas a quantidade de substância P usado nesses experimentos foi importante. Depois de muita experimentação, 1kg/nmole foi encontrado para ser a concentração ideal de forma exógena adicionado substância P, resultando em um aumento 1.5-fold da de (e, portanto, mais facilmente mensurável) valores de extravasamento de plasma. Além disso, verificou-se que tempo adequado deve ser permitido para o azul de Evans equilibrar (> 10 min). Perfusão dos vasos sanguíneos para remover o excesso Evans azul, após o sacrifício do mouse mas antes isolamento do órgão, foi encontrado para ser um componente essencial do presente protocolo, ao contrário de outros protocolos que não incluem esta etapa de perfusão4. O perfusato (entregado por um gradiente de gravidade suave) é de 50 mL de uma solução de pH 3,5 (que incentiva a vinculação de azul de Evans e albumina); paraformaldeído, predominante em muitas outras Evans protocolos azul6,10,25, é omitido no presente protocolo. Outro fator que tem sido resolvido neste protocolo é que o corante usado em chow doxiciclina interfere com a medição de nm OD620 de azul de Evans em tecidos da trilha alimentar. Assim, foi necessário usar chow undyed doxiciclina nas experiências acima. Também, um achado importante e útil é que praticamente qualquer órgão do rato é satisfatoriamente isolado e examinado através do presente protocolo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer a Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski pela valiosa ajuda e edições para este manuscrito. Apoiado por subvenções recebidas do coração nacional, pulmão e sangue Institute (NHLBI RO1 HL078929, HL014985 de PPG e RO3 HL095439) e assuntos do departamento de veteranos (revisão de mérito).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
