Summary
Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.
Abstract
La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.
Introduction
Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.
L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale principalmente dipende dallo sviluppo di rilevazione della fluorescenza e sonde fluorescenti. Per uno studio di singola molecola, è importante etichettare la proteina di interesse con una sonda fluorescente adatta poiché sistemi di rilevazione di fluorescenza per la maggior parte sono commercialmente disponibili.
Le proteine fluorescenti sono comunemente usate in biologia molecolare. Tuttavia, la bassa luminosità fluorescente e la stabilità contro photobleaching limitarne l'applicazione in molti saggi di singola molecola. Punti quantici (QDot) sono piccoli emettitori di luce nanoparticelle4. A causa di loro proprietà ottiche uniche, QDot sono 10 - 20 volte più luminoso e diverse migliaia di volte più stabile di ampiamente usato organici coloranti5. Inoltre, QDot hanno un grande Stokes shift (la differenza tra la posizione dei picchi di eccitazione e di emissione)5. Così, QDot può essere utilizzato per l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini con alti rapporti segnale-rumore, mentre essi non possono essere utilizzati in analisi quantitative.
Ad oggi, ci sono due approcci per etichettare una proteina bersaglio con QDot site-specifically: etichettatura con l'ausilio di anticorpi primari o secondari coniugati Qdot6,7,8; o etichettatura la proteina bersaglio con QDot direttamente, che si basa sull'interazione forte tra biotina e streptavidina9,10,11,12,13. Rivestite con streptavidina QDot sono disponibili in commercio. Nel nostro recente studio, site-specifically proteine biotinilate in lievito ad alta efficienza sono stati purificati dal co-sovraespressione di BirA e proteine etichettate Avi in vivo10. Segue e ottimizzando le analisi di singola molecola14,15,16,17, abbiamo osservato le interazioni tra DNA e proteine identificate Qdot a utilizzando il livello di singola molecola TIRFM10.
Qui, abbiamo scelto la gemmazione lievito origine riconoscimento complesso (ORC), che possa in particolare riconoscono e si legano alla sequenza autonomamente replica (ARS), come la proteina di interesse. Il seguente protocollo presenta una procedura dettagliata di visualizzare l'interazione di Qdot-labeled ORC con ARS utilizzando TIRFM. La preparazione del substrato DNA site-specifically modificato, la biotinilazione di DNA, la pulizia del vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, l'Assemblea di cella di flusso e l'imaging di singola molecola sono descritti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317
- Imballaggio e la costruzione di DNA substrato
- Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omologa e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
- Per assemblare il DNA di λ di ricombinazione, aggiungere 25 µ l di lambda imballaggio estratti nel prodotto ricombinazione e incubi la reazione a 30 ° C per 90 min. Quindi, aggiungere un ulteriore 25 µ l di lambda imballaggio estratti nella provetta di reazione. Continuare a incubare la reazione a 30 ° C per 90 min.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di diluizione sterile (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl2) nel sistema di reazione e mescolare delicatamente ruotando il tubo capovolto più volte. Aggiungere 25 µ l di cloroformio, mescolare delicatamente e conservare a 4 ° C.
- Aggiungere 100 µ l del fago confezionato e 100 µ l di batteri LE392MP (coltivate a 0.8 - 1.0 usando LB medium aggiunta con 10mm MgSO4) in una nuova provetta. Incubare a 37 ° C per 15 minuti.
- Aggiungere 200 µ l di miscela dei fagi-batterio in 4 mL di agar Ditop (LB medium + 0,7% agar + 10mm MgSO4, raffreddata a 48 ° C). Mescolare immediatamente ruotando il tubo capovolto più volte e versarla su un piatto pre-riscaldata (37 ° C) LB.
- Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte e la placca di λ-ARS317 mediante PCR e sequenziamento a schermo.
- Purificazione di DNA substrato da lisati liquido11,18
- Raccogliere una placca in 200 µ l di ddH sterile2O con 10 mM MgCl2 e 10 nM CaCl2. Mescolare con 200 µ l di batteri LE392MP (coltivata pernottamento in mezzo LB) e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Aggiungere la miscela dei fagi-batterio in 100 mL di NZCYM (10 g/L NZ-ammina, 5g/L lievito estratto, 5g/L NaCl, 1 g/L Casamino idrolizzato e MgSO4·7H2O 2 g/L) media e cultura per 7 h a 37 ° C. Aggiungere 250 µ l di cloroformio nella cultura ed agitare per altri 10 min.
- Diffondere la cultura in una beuta da 200 mL. Aggiungere 5,8 g di NaCl (concentrazione finale di 1 M), mescolare per sciogliere a mano e incubare in ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante in una beuta da 200 mL e aggiungere 10% PEG8000 (m/V). Mescolare per sciogliere col mescolatore magnetico e incubare in ghiaccio per 30 minuti o più.
- Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per far precipitare il batteriofago. Eliminare il surnatante.
- Risospendere il precipitato in 2 mL di tampone di diluizione dei fagi. Trasferirlo in una provetta da 15 mL e aggiungere 10 µ l di RNAsi (concentrazione finale è 20 µ g/mL) e 40 µ l di dnasi (concentrazione finale è 5 µ g/mL). Incubare a 37 ° C per 30 min.
- Aggiungere 2 mL di 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, proteinasi di 15 µ l K (concentrazione finale è di 10 µ g/mL). Incubare a 65 ° C per 10 min.
- Aggiungere 2 mL di acetato di potassio pre-raffreddata (3M, pH 4.8) e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile.
- Aggiungere 0,7 x volume di isopropanolo nel surnatante. Mescolare ruotando il tubo capovolto più volte e incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA).
- Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a RT per precipitare il DNA. Eliminare il surnatante.
- Lavare il DNA una volta con 70% etanolo mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min. eliminare il surnatante.
- Eluire il DNA utilizzando delicatamente il tampone di 500 µ l TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) e trasferire il DNA in provetta da 1,5 mL.
- Estrarre il DNA due volte con il fenolo: cloroformio mediante centrifugazione a 8.000 g per 10 min.
- Precipitare con 0,7 x volume di isopropanolo. Mescolare girando il tubo testa in giù delicatamente e centrifugare a 8.000 x g per 10 min.
- Lavare una volta con etanolo al 70%, risospendere in 200 µ l di TE. Misurare la concentrazione di DNA e conservare a-20 ° C in 12,5 µ g aliquote.
2. λ-ARS317 DNA biotinilazione
- Fosforilare oligonucleotidi biotinilati (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementari all'estremità sinistra del nativo di λ DNA, aggiungere 1 µ l (100 µM) di oligonucleotidi, 7,5 µ l di ddH2O, 1 µ l di tampone di ligasi 10x e 0,5 µ l di T4 PNK. Incubare la reazione a 37 ° C per 3 h.
- Per fosforilare λ-ARS317, aggiungere 12,5 µ g di λ-ARS317, 3 µ l di tampone di ligasi 10x, 1 µ l di T4 PNK e ddH2O al volume totale di 30 µ l. incubi la reazione a 37 ° C per 3 h.
- Per temprare oligonucleotidi con λ-ARS317, aggiungere 0,5 µ l di oligonucleotidi fosforilati, 195 µ l di ddH2O, 25 µ l di tampone di ligasi × 10 nel tubo fosforilato λ-ARS317. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a 65 ° C per 5 min turno spento il riscaldatore blocco e lasciare raffreddare il campione a inferiore a 33 ° C nel blocco.
- Per lega i oligonucleotides con λ-ARS317, aggiungere 1 µ l di T4 DNA ligasi e 0,63 µ l del trifosfato di adenosina (200 mM). Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 2 h o a 4 ° C durante la notte. Conservare a 4 ° C per 1 mese.
Nota: Per evitare di rompere il DNA, tutte le fasi di miscelazione devono essere eseguite capovolgendo delicatamente il tubo, invece di mescolare utilizzando pipette.
3. vetrino coprioggetto pulizia e funzionalizzazione
- Vetrino coprioggetti pulizia
- Posto 20 vetrini coprioggetti in 4 vaschette per colorazione (5 vetrini coprioggetti/vasetto), Sonicare per 30 minuti in etanolo e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte.
- Sonicare per 30 minuti con 1 M di idrossido di potassio (KOH) e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte. Ripetere l'etanolo e KOH sonicazione una volta.
- Sonicare con acetone per 30 minuti e poi sciacquare abbondantemente con ultrapura H2O (almeno 3 volte).
Nota: Acetone deve essere rimosso completamente risciacquando con ultrapura H2O, perché può causare un'esplosione quando solvente organico (ad esempio acetone) mescolato con la soluzione piranha erroneamente14. - Inserire i vetrini coprioggetto soluzione piranha (miscela 3:1 di H2SO4 e 30% H2O2) e incubare a 95 ° C per 1 h.
Nota: La soluzione Piranha è altamente energico e corrosiva, quindi usare con cautela. Quando si prepara la soluzione piranha, aggiungere 50 mL di H2O2 prima in un becher di vetro 500 mL e quindi aggiungere 150 mL di H2così4 lentamente nel bicchiere graduato. - Sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 5 volte. Quindi lavare ogni vetrino coprioggetti con ultrapura H2O accuratamente con 3 bicchieri riempiti con ultrapura H2O ed asciugare il vetrino coprioggetto utilizzando carta dal bordo del coverslip. Inserire la vaschetta di colorazione del vetrino coprioggetto e asciugare il vetrino coprioggetto accuratamente in forno a 110 ° C per 30 minuti.
- Sciacquare il vetrino coprioggetto con metanolo e mettere la vaschetta di colorazione in forno 110 ° C per asciugare il vetrino coprioggetti.
Nota: Asciugare accuratamente il vetrino coprioggetto è molto importante, perché APTES avrà un sacco di possibili strutture superficiali, una volta che si è in presenza di acqua19.
- Sciacquare il vetrino coprioggetto con metanolo e mettere la vaschetta di colorazione in forno 110 ° C per asciugare il vetrino coprioggetti.
- Vetrino coprioggetti funzionalizzazione
- Aggiungere 70 mL di soluzione di silano (93% metanolo, 5% acetico e 2% APTES) in ogni vaso, avvitare il tappo e lasciare il vaso a temperatura ambiente durante la notte.
- Lavare e asciugare i vetrini coprioggetti, come descritto al punto 3.1.5, tranne per il fatto asciugare i vetrini coprioggetti accuratamente con gas azoto invece di metterli in forno.
- Sciogliere 150 mg di mPEG (metossi-polietilene glicole) e 6 mg di biotina-PEG (biotina-polietilenglicole) in 1 mL di 0.1 M fresca fatta NaHCO3 (pH 8.2) accuratamente. Poi Centrifugare a 17, 000 x g per 1 min a togliere pioli insolubile.
Nota: Appena fatte NaHCO3 è pronto; non c'è nessuna necessità di regolare il suo pH. - Posizionare i vetrini coprioggetti silanizzata nelle caselle e mettere due vetrini coprioggetti piccoli sulla parte superiore due estremità delle lamelle silanizzato. Pipettare 100 µ l di soluzione di PEG sul centro del coprivetrino silanizzata e inserire un altro vetrino coprioggetti silanizzata in alto a sinistra.
- Aggiungere alcuni ultrapura H2O nella finestra per mantenerlo umido e incubare i vetrini coprioggetti con soluzione PEG per almeno 3 ore al buio. Un'incubazione overnight può lavorare bene.
- Separare le coppie di coprioggetto e continuate il volto di superficie funzionalizzato, sciacquare i coprioggetti usando ultrapura H2O ampiamente e asciugarle con gas azoto.
- Contrassegnare il lato funzionalizzato di lamelle su uno degli angoli utilizzando un pennarello, tenere il lato funzionalizzato affrontare, metterli in scatole e archiviazione le caselle in un essiccatore sotto vuoto per 1 mese.
- Per memorizzare i coprioggetti per un tempo più lungo, porre un coprivetrino in una provetta da 50 mL forata con un buco sul suo tappo, poi mettere il tubo in un sacchetto di plastica e sigillare il sacchetto usando una macchina per il sottovuoto. In questo modo, lamelle possono essere immagazzinate a-20 ° C circa 3 mesi.
4. flusso Cell Assembly
- Tagliare un canale 15 × 2 mm al centro di un pezzo di nastro biadesivo (30 mm × 12 mm) utilizzando un perforatore.
- Staccare il lato della carta del nastro biadesivo e incollarlo sul vetrino con due fori. Premere per rimuovere le bolle d'aria. Basandoci sulla nostra esperienza, è più facile rimuovere le bolle d'aria di pelatura fuori il lato della carta rispetto al lato di plastica del nastro biadesivo.
- Tagliare un vetrino coprioggetti funzionalizzato (60 mm × 24 mm) in quattro pezzi (30 mm × 12 mm) utilizzando un punta di diamante di vetro scribe e rimuovere i detriti utilizzando gas azoto. Ricordarsi di tenere il funzionalizzati lato faccia in su.
- Staccare la plastica laterale del nastro biadesivo e incollare la diapositiva il coprivetrino funzionalizzato. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria tra il nastro e il vetrino coprioggetti. Rimozione di bolle d'aria accuratamente può proteggere la cella di flusso da perdite mentre buffer sono stati pompati in esso.
- Inserire aspirazione e tubo di uscita nei fori piccoli e grandi, rispettivamente. Fissare il tubo con resina epossidica.
- Pompa 20 µ l di streptavidina (0,2 mg/mL) nella cella di flusso utilizzando una siringa manualmente e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Quindi pompa blocco buffer10 nella cella di flusso per sostituire streptavidina e tenerlo a temperatura ambiente.
5. singola molecola Visualization
- Ottenere l'allineamento focale del rosso e da' con A5 sulla prova di microscopio di fluorescenza #1 eccitazione simultanea utilizzando un laser a 532 nm e laser 640 nm. Produrre immagini di doppia lunghezza d'onda con la scissione ottica (Vedi Tabella materiali).
- Posizionare la cella di flusso sul microscopio e collegare il tubo di uscita per un più lungo collegamento tubazione con una molla di 10ml installata su una pompa di infusione/ritiro automatici programmabili.
Nota: Pompaggio buffer nella cella di flusso indicato di seguito significa ritirare buffer dal tubo di ingresso della cella di flusso alla siringa. - Pompa tampone bloccante a 500 µ l/min nella cella di flusso per rimuovere rapidamente l'aria e garantire che il buffer nella cella di flusso è sbloccato. Pompare il tampone bloccante a 200 µ l/min nella cella di flusso, quindi capovolgere il tubo di uscita per rimuovere le bolle d'aria dal tubo di aspirazione e la cella di flusso accuratamente.
Nota: Tutti i buffer pompati nella cella di flusso dovrebbero essere degassificati in un essiccatore sotto vuoto per almeno 15 minuti prima dell'uso. - Aggiungere 0,5 µ l di DNA λ-ARS317 biotinilati in 80 µ l di tampone bloccante e pompa in cella di flusso a 25 µ l/min per 2 min. Quindi sciacquare λ-ARS317 DNA utilizzando 200 µ l di tampone bloccante ad un tasso di 50 µ l/min.
- 200 µ l di binding buffer10 ad un tasso di 50 µ l/min per rimuovere il tampone bloccante nella cella di flusso della pompa.
- Aggiungere 0,2 µ l di rivestite con streptavidina Qdot705 (1 µM) e 0,2 µ l di biotinylated ORC (1,2 µM) in una provetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 20 µ l di binding buffer nel tubo, quindi posizionarlo sul ghiaccio. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di circa 10 nM.
- Aggiungere 2 µ l di ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µ l di DTT (100 mM), 1 µ l di ATP (200 mM) in 96 µ l di tampone di associazione. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di 0,2 nM.
- Nella cella di flusso della pompa 20 µ l di 0,2 nM ORC-Qdot705 al tasso di 10 µ l/min. Scovare di eccessiva ORC-Qdot705 utilizzando 200 µ l di tampone di associazione al ritmo di 100 µ l/min. Quindi pompa buffer obbligatorio con 30 nM SYTOX arancio nella cella di flusso a macchiare substrati DNA ad un tasso di 100 µ l/min.
- Eccitare il segnale di705 ORC-Qdot e SYTOX arancio macchiato segnale di DNA utilizzando un laser di 405 nm e 532 nm laser, rispettivamente. Osservare i segnali simultaneamente con 100 µ l/min flusso utilizzando un filtro passabanda Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) e registrare le immagini di EM-CCD con 100 ms per ogni frame. Raccogliere 20 serie di immagini provenienti da diversi campi.
6. analisi dei dati
- Ritaglia le immagini usando il software di Fiji con un nuovo plugin, che viene modificato da noi stessi basate sul plugin Image (OI_cut_RGBmerge) sviluppato da laboratorio di Dr. Ron Vale presso University of California, San Francisco.
- Ritagliare una pila di immagini (512 × 512 pixel) in due pile di immagini (256 × 256 pixel). Uno è un 532 nm laser risultato entusiasmante, e l'altro è un 405 nanometro laser risultato entusiasmante.
- Processo di 61 immagini sequenziali utilizzando Fiji-immagine-pile-Z project (intensità media).
- Misura la lunghezza del DNA (LDNA) e la distanza dal sito di ORC-Qdot705 (LORC) associazione il DNA al DNA legato fine manualmente.
- Calcolare il risultato della LORC/lDNA utilizzando excel, analizzare i dati utilizzando il metodo bootstrap di R, quindi creare l'istogramma e distribuzioni gaussiane in forma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiva dei fagi è stata presentata dalla PCR e confermata ordinando (Figura 1). Λ-ARS317 DNA è stato purificato dai lisati liquidi (Figura 1).
Singola molecola imaging analisi sono state effettuate sull'assetto TIRFM obiettivo-tipo (Figura 2). Identificando il biotinilati ORC con un rapporto molare di quasi 1:1 rivestite con streptavidina QDot rapidamente, con etichetta Qdot ORC è stato pompato nella cella di flusso tethered λ-ARS317. DNA è stato macchiato usando SYTOX Orange. I segnali di Qdot-labeled ORC e SYTOX-arancione-macchiato del DNA erano imaged contemporaneamente utilizzando TIRFM (Figura 3A-3 C). Per determinare la distribuzione di ORC il λ-ARS317, lo stack di imaging è stato separato in due pile: una pila di segnale del DNA e altri stack di segnale ORC come descritto al punto 6.1 (Figura 3B). Basato sulla formula, posizione (kb) = (L/lORCDNA) × 50 kb (Figura 3D), 273 associazione posizioni di ORC-Qdot705 molecole su 168 substrati DNA erano quantità analizzati. I dati hanno mostrato che ORC-Qdot705 lega appositamente sul sito ARS317 inserito con un'abbondanza ovviamente alta (Figura 3E) . Nel frattempo, ORC-Qdot705 si lega anche sulle zone ricche in AT situate nella centrale e l'estremità libera del DNA λ, che è coerenza con i risultati del precedente studio10.
L'acquisizione di immagini di alta qualità dipende dal rapporto molare di proteina e di QDOT nell'analisi d'etichettatura. QDot eccessiva può essere buono per la proteina di etichettatura di efficienza, ma possono creare rumore di fondo. Come mostrato in Figura 4, mentre etichettatura biotinilati ORC con streptavidina-rivestito QDot al rapporto molare 1:3, è aumentato il rumore di fondo. Pertanto, è fondamentale per scegliere l'appropriato rapporto molare di proteine biotinilate QDot rivestite con streptavidina.
Figura 1: preparazione del substrato di DNA λ-ARS317. (A) illustrazione di λ-ARS317 costruzione. Un frammento di DNA ARS317 del cuscinetto è stato integrato nel DNA λ di ricombinazione omologa. (B) le piastre sul mezzo solido LB. Tre di loro sono stati contrassegnati con frecce nere. (C) una targa di λ-ARS317 è stata identificata usando la PCR. (sinistra) Marcatore, DNA λ nativo (al centro), (a destra) una targa di λ-ARS317. (D) depurata λ-ARS317 DNA è stato rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,6%. (sinistra) Marcatore, (middle) nativo λ (a destra) di DNA purificato λ-ARS317. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica schematica del obiettivo-tipo TIRF e flusso cell. Singola molecola imaging analisi sono state effettuate basata su TIRFM combinando con sistema di cella di flusso. Il nostro TIRFM è stato effettuato su un microscopio invertito con un 60 X obiettivo di olio (apertura numerica = 1,49). DNA (linea grigia) era legato il coprivetrino nella cella di flusso attraverso il legame biotina-streptavidina e allungato da un flusso da sinistra verso destra. Un legame con le proteine del DNA legato è stato indicato da un puntino rosso-ovale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Qdot705-etichettato ORC (rapporto molare 1:1) vincolanti per λ-ARS317. (A) DNA ORC e λ-ARS317 sono state osservate simultaneamente. (in alto) SYTOX arancio macchiato DNA era eccitato utilizzando un laser a 532 nm e osservato utilizzando la banda di trasmissione 550-613 nm del filtro passa-banda quad-band. (in basso) QDot705-ORC con etichetta era eccitato utilizzando un laser di 405 nm e osservato utilizzando la banda di trasmissione 663-743 nm del filtro passa-banda quad-band. (B) due 256 × 256 Sub-pile sono state tagliate dallo stack originale 512 × 512. (C) le immagini acquisite utilizzando 61 fotogrammi sequenziali degli stack corrispondente. (sinistra) SYTOX arancio macchiato del DNA, (middle) Qdot705-etichettato ORC, immagine unita (a destra); tre Qdot705-etichettati ORC associazione al sito di ARS317 su substrati DNA λ-ARS317 sono stati contrassegnati con frecce nere. (D) illustrazione del calcolo dell'ORC vincolante posizione sul DNA. LDNA significa che la lunghezza del DNA, LORC si intende la distanza da ORC associazione sito sul DNA a fine legata del DNA. (E) distribuzione di associazione di istogramma di ORC sul DNA λ-ARS317. Gaussiana adattano ai dati è stata indicata tramite la riga di tinta rossa. Barre di errore indicano un intervallo di confidenza del 95% sulla base di 1000 campioni bootstrap. N indica il numero di molecole ORC. Sito ARS317 inserito è stato indicato mediante una freccia nera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: associazione con etichetta Qdot ORC (rapporto molare di 3:1) il λ-ARS317. DNA ORC e λ-ARS317 sono stati osservati nello stesso modo come in Figura 3A. (sinistra) SYTOX arancio macchiato DNA era eccitato utilizzando un laser a 532 nm. (medio) Con etichetta QDot ORC è stato eccitato utilizzando un laser di 405 nm. immagini unite (a destra). Due associazione Qdot-labeled ORC al sito ARS317 su substrati DNA λ-ARS317 sono stati contrassegnati con frecce nere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre eventuali danni, ad esempio, evitare di mischiare pipettando su e giù ripetutamente. In secondo luogo, è molto importante garantire che il vetrino coprioggetto è abbastanza pulito per ridurre al minimo il rumore di fondo. Durante il processo di pulizia e funzionalizzazione del vetrino coprioggetto, acqua dovrebbe raggiungere il livello ultrapura, e l'aria dovrebbe essere privo di polvere. È meglio svolgere la funzionalizzazione del vetrino coprioggetto e l'assemblaggio di cella di flusso su un banco pulito.
Nell'analisi della singola molecola per lo studio delle interazioni proteina-DNA, DNA λ è un substrato appropriato con diversi vantaggi20. DNA di λ è abbastanza a lungo per essere facilmente osservato e permettere la registrazione movimento proteina su di esso in un esperimento di singola molecola. Inoltre, gli strapiombi di ssDNA permettono molti disegni per il tethering λ DNA su un vetrino coprioggetti. In questo studio, presentiamo un metodo per inserire un frammento di DNA esogeno in un sito specifico del DNA λ. Così, vari frammenti di DNA definibili dall'utente possono essere integrati nel DNA di λ. Il DNA modificato λ può essere convenientemente purificato da lisati liquidi in grandi quantità per studio di singola molecola.
È difficile valutare l'efficienza d'etichettatura con precisione nel Qdot rivestite con streptavidina etichettatura analisi perché ci sono circa 5-10 streptavidins a Qdot nanocristallo. Di conseguenza, il rapporto molare appropriato di QDOT rivestite con streptavidina e proteine biotinilate dovrebbe essere ottimizzato negli esperimenti. Un rapporto molare 1:1 può essere un riferimento.
Dovrebbe essere notato che Qdot non può essere utilizzato nelle analisi quantitative accurate poiché sua elevata fotostabilità è inadatto per il dosaggio di foto-candeggio. Sebbene l'elevata stabilità di QDOT limita la sua applicazione nelle analisi quantitative, consente di facile osservazione e monitoraggio da lungo tempo5. Con l'aumento di applicazioni di microscopia di fluorescenza di singola molecola in biologia, il protocollo descritto in questo documento contribuirà notevolmente a dipanare i meccanismi del metabolismo del DNA in futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
