Summary
Her vil vi præsentere en metode til at isolere binyrerne fra mus, lave væv, afsnit dem og udføre immunofluorescens farvning.
Abstract
Immunfluorescens er en veletableret teknik til påvisning af antigen i væv med beskæftigelse af fluorokrom-konjugerede antistoffer og har et bredt spektrum af programmer. Påvisning af antigener giver mulighed for karakterisering og identifikation af flere celletyper. Placeret over nyrerne og indkapslet af et lag af mesenchymale celler, er binyrerne en endokrine organ sammensat af to forskellige væv med forskellige embryologiske oprindelse, mesonephric mellemliggende mesoderm-afledte ydre cortex og de neurale Crest-afledte inderste medulla. Binyrebarken udskiller steroider (dvs., mineralkortikoider, glukokortikoider, kønshormoner), der henviser til, at adrenal medulla producerer katekolaminer (dvs., adrenalin, noradrenalin). Mens adrenal forsker, er det vigtigt at kunne skelne unikke celler med forskellige funktioner. Her giver vi en protokol udviklet i vores laboratorium, der beskriver en række sekventielle trin, der kræves for at opnå immunofluorescens farvning at karakterisere celletyper af binyrerne. Først fokuserer vi på dissektion af binyrerne mus mikroskopiske fjernelse af periadrenal fedt efterfulgt af fiksering, forarbejdning og paraffin indlejring af væv. Derefter beskriver vi, skæring af væv blokke med en Rotationsmikrotom. Endelig, vi detalje en protokol for immunfluorescent farvning af binyrerne, som vi har udviklet for at minimere både ikke-specifikke antistof bindende og autofluorescence for at opnå et optimalt signal.
Introduction
Immunhistokemi er en teknik til at påvise væv komponenter med brug af antistoffer specifikke cellulære molekyler og efterfølgende farvning teknikker til at opdage den konjugerede antistoffer1. Denne immunhistokemiske procedure kræver specifikke fiksering og forarbejdning af væv, der bestemmes ofte empirisk for den specifikke antigen, væv og antistof udnyttet2. Fiksering er afgørende for at bevare den "oprindelige" tilstand af vævet og dermed bevare intakt cellulære og subcellulært strukturer og udtryk mønstre. Yderligere er forarbejdning og indlejring procedurer forpligtet til at forberede væv til skæring i tynde skiver, der bruges til histologiske undersøgelser der involverer Immunhistokemi.
Immunfarvning kan udføres med enten kromogent eller fluorescerende detektion. Kromogent påvisning kræver udnyttelsen af et enzym til at konvertere et opløseligt substrat til en uopløselig farvet produkt. Mens dette enzym kan være konjugeret til antistof anerkende antigen (primære antistof), er det oftere konjugeret til antistof erkendelse af det primære antistof (dvs., de sekundær antistof). Denne teknik er meget følsomt; farvede produktet som følge af enzymatisk reaktion er photostable og kræver kun en brightfield mikroskop til billedbehandling. Dog kan kromogent immunfarvning ikke være egnet, når de forsøger at visualisere to proteiner, der co Lokaliser, da aflejring af én farve kan maskere deposition af den anden. For Co farvning, immunofluorescens har vist sig for at være mere fordelagtig. Fremkomsten af immunofluorescens tilskrives Albert Coons og kolleger, der har udviklet et system til at identificere væv antigener med antistoffer markeret med fluorescein og visualisere dem i sektioneret væv under ultraviolet lys3. Registrering af Fluorescens er baseret på et antistof konjugeret med et fluorophore, der udsender lys efter excitation. Fordi der er flere fluorophores med emissioner på forskellige bølgelængder (med ingen eller lille overlapning), er denne metode til påvisning ideelt for studier af flere proteiner.
Binyrerne er et parret organ placeret over nyrerne og karakteriseret ved to embryologically særskilte komponenter omgivet af en mesenchymale kapsel. Ydre binyrebarken, afledt af mesonephric mellemliggende mesoderm, udskiller steroidhormoner, mens den inderste medulla, afledt af neurale crest, producerer katekolaminer, herunder adrenalin, noradrenalin og dopamin. I binyrebarken er histologisk og funktionelt opdelt i tre koncentriske zoner, med hver zone secernerende forskellige klasser af steroid hormoner: ydre zona glomerulosa (zG) producerer mineralkortikoider, der regulerer elektrolytten homøostase og intravaskulær volumen; den midterste zona fasciculata (zF), udskiller direkte under zG, glukokortikoider, der mægle stressrespons gennem mobilisering af energi butikker at øge plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prækursorer (dvs., dehydroepiandrosterone (DHEAS))4.
Nogle variation i binyrebarkhormon zonation er til stede mellem arter: for eksempel, Mus musculus mangler zR. Den unikke postnatal X-zone af M. musculus er en rest af føtal cortex karakteriseret ved små lipid-fattige celler med acidophilic cytoplasms5. X-zone forsvinder i puberteten i mandlige mus og efter den første graviditet i hunmus eller degenererer gradvist i ikke-opdrættet hunner6,7. Desuden markeret tortuosity og tykkelse af zG udstiller variation mellem arter, som gør organisationen af perifere stamceller og stamfader celler i og støder op til zG. Rotte, i modsætning til andre gnavere, har en synlig udifferentierede zone (zU) mellem zG og zF der fungerer som en stamcelle zone og/eller en zone af forbigående forstærke stamfaderen. Om zU er unikke for rotter eller blot en mere prominently arrangeret klynge af celler er ukendt8,9.
Celler af binyrebarken indeholder lipid dråber, der gemmer kolesterol estere, der tjener som en forløber for alle steroidhormoner10,11. Udtrykket "steroidogenesis" definerer processen med produktion af steroidhormoner fra kolesterol via en serie af enzymatiske reaktioner, der involverer aktiviteten af steroidogene faktor 1 (SF1), hvis udtrykket er en markør for steroidogene potentiale. I binyrerne findes Sf1 udtryk kun i cellerne i cortex12. En interessant undersøgelse fundet udtryk af endogent biotin i binyrebarkhormon celler med steroidogene potentielle13. Mens dette kan være årsag til en højere baggrund i biotin/streptavidin-baserede farvnings-metoder, på grund af påvisning af endogent biotin af antistof konjugeret med streptavidin, kunne denne egenskab anvendes også til at skelne mellem den steroidogene celler fra andre befolkninger i binyrerne, dvs, endotel, kapsulær, og medulla celler.
Innerveres af sympatiske preganglionic neuroner, er binyremarven karakteriseret af baserig celler med en granuleret cytoplasma, der indeholder adrenalin og noradrenalin. Medulla celler er opkaldt "chromaffin" på grund af det høje indhold af katekolaminer, der danner en brun pigment efter oxidation14. Tyrosin hydroxylase (TH) er det enzym, der katalyserer den trafikhastighedsbegrænsning trin i syntesen af katekolaminer og i binyrerne, angives kun i medulla15.
Her præsenterer vi en protokol til isolering af musen binyrerne, deres forarbejdning til indlejring i paraffin og skæring, og en metode til at udføre immunofluorescens farvning på adrenal sektioner for at identificere de cellulære typer, der udgør den adrenal cortex og medulla. Denne protokol er en standard i vores laboratorium for immunfarvning med flere antistoffer rutinemæssigt anvendes i vores forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder blev udført i overensstemmelse med institutionelt godkendte protokoller under auspicier Universitet Udvalget om brug og pleje af dyr på University of Michigan.
1. forberedelse til operation
- På dagen forud for operationen, forberede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) / fosfatbufferet saltopløsning (PBS). I tilfælde af frosne delprøver, fortsætte med at optø en og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: 4% PFA er ikke stabil i mere end 48 timer.
Forsigtig: PFA er giftige, undgå kontakt med hud og øjne, og bortskaffes i en passende beholder. - På dagen for operationen, forberede de kirurgiske instrumenter af sterilisering saks og pincet med 70% ethanol (EtOH) og lad dem tørre på et stykke køkkenrulle.
- Sted en 24-godt tallerken fyldt med 1 x PBS (1 mL/hul er tilstrækkelig) i en isspand.
Bemærk: Binyrer vil blive holdt i denne multi godt kultur parabol efter operationen.
2. adrenal dissektion
- Aflive den mus efter standardprotokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). En sekundær metode af aktiv dødshjælp til sikre død (for eksempel halshugning) er påkrævet.
- For eutanasi af isofluran overdosis, placere musen i en sal fyldt med isofluran dampe indtil respiration ophører, så fjerne musen fra salen, lå det på en overflade og udføre cervikal dislokation.
Bemærk: De fleste eutanasi metoder påføre dyret lidelser og er ikke egnet til stress undersøgelser, fordi de kan tilføje variablen konfunderende aktivering af hypofyse-binyre akse og medullær catecholamin udgivelse. I dette tilfælde er halshugning den foreslåede teknik til at vedtage.
- For eutanasi af isofluran overdosis, placere musen i en sal fyldt med isofluran dampe indtil respiration ophører, så fjerne musen fra salen, lå det på en overflade og udføre cervikal dislokation.
- Lå musen liggende, sterilisere indsnit område på maven og flanker med 70% EtOH.
Bemærk: Mens barbering pels vil øge sterilitet, for dette program det er ikke nødvendigt. - Skære huden i midten af maven ved hjælp af saks, adskille huden fra bughinde, deskin musen ved at klemme huden omkring snittet og trække det i to modsatte retninger (caudale og rostralt). Derefter skæres bughinden indtil nå de bageste venstre og højre flanker.
- Fjerne murine binyrerne skære omkring den omkringliggende fedtvæv og placere den i 24-flerhuls tallerken fyldt med 1 x PBS og opbevares på is.
3. Peri-adrenal fedt fjernelse
- Under et dissekere mikroskop, placere adrenal på et glas base eller en petriskål på scenen plade, position lyskilden, Vælg forstørrelsen og justere fokus for at få et klart overblik over den hele binyre.
Bemærk: Forstørrelse bruges kan variere afhængigt af personlige præferencer. 30 X med en plan linse 1 X, samlede forstørrelse zoom 3 X, og okularet 10 X giver mulighed for at visualisere hele kirtlen med en god synsfelt. - Hurtigt at fjerne de tilstødende fedtvæv med to 25 G nåle, undgå dehydrering af adrenal. Hvis dette sker før alle fedt fjernes, flytte adrenal tilbage i brønden indeholdende 1 x PBS for 1-2 min, og derefter fortsætte med fedt fjernelse proces.
- Vask 2 x for 2 min i 1 x PBS.
4. væv forarbejdning og integrering
- Fix væv i 4% PFA/PBS ved 4 ° C på en vuggende platform for 2 h.
- Fjern 4% PFA og vask væv med 1 x PBS, 3 x i 15 min. ved 4 ° C.
Forsigtig: PFA er giftigt og farligt affald; Det bør håndteres med forsigtighed under en kemisk hætte og bortskaffes i en beholder, farligt affald. - Inkuber binyrer i 50% EtOH ved 4 ° C på en vuggende platform for 2 h.
- Inkuber binyrer i 70% EtOH ved 4 ° C på en vuggende platform for et minimum af 2 h.
Bemærk: Hvis ikke videre med væv behandling for indlejring, binyrer kan gemmes i 70% EtOH ved 4 ° C. Undgå langtidsopbevaring i 70% giver EtOH og fortsætter til væv behandling hurtigst muligt bedre kvalitet prøver. - Forberede adrenal for væv behandling af indpakning det i gaze og vedlægge det i et væv indlejring kassette. Placer kassetten i en krukke fyldt med 70% EtOH og opbevares ved 4 ° C indtil klar til at flytte til væv processor. Sæt kassetten i væv processoren programmeret som rapporteret i tabel 1 og køre programmet.
- Overføre kassetten i en indlejring station fyldt med smeltet paraffin på 65 ° C. Hvis der ikke findes en afkøling station, placere en kold afkøling bakke ved siden af det.
- Mærke en indlejring mug og åbne væv indlejring kassette. Brug et par pincet, udpakning af gaze og placere adrenal forsigtigt i den ønskede position på midten af bunden i formen indlejring. Hæld smeltet paraffin på adrenal. Hvis det er nødvendigt, skal du holde adrenal med pincet til at sikre dets position i formen ellers det kan bevæge sig rundt inde i formen.
- Forsigtigt flytte indlejring formen til afkøling bakken og vente til hærdning af paraffin. Efter dette, for at lette skæring, gemme indlejring forme i et køligt sted.
5. skæring med en Rotationsmikrotom
- Kontroller, at mikrotomen er ren før du starter, børste væk alle kasserede paraffin restkoncentrationer, sikrer, at kniven (eller blade) er skærpet, olie den interne mekanisme og oprulles fuldt blok indehaveren, hvis det er nødvendigt.
- Mærke en række objektglas (positivt opkrævet eller belagt for at forhindre tab af væv (Se Tabel af materialer)), læg dem på en varmere Diassæt ved 37 ° C, og give afkald på nogle autoklaveres type 1 ultrarent vand oven på hvert dias.
- Indstillet snittykkelse på 5 µm.
- Indsæt mikrotomen klinge i klingeholderen, styre vinkel af vingen, Sørg for, at klingen er sikkert på plads i holderen og kontrollér spillerummet af paraffin blok og blok indehaveren.
- Bringe blok indehaveren til sin højeste position og, hvis det er muligt, låse operativsystemet håndtaget, fjerne paraffin blok fra formen og placere det i blok indehaveren sikre det fast med klemmen. Vinklen på midterlinien af klingen med den modstående overfladen af blokken bør være omkring 20°. Hvis det er nødvendigt, justere paraffin blok.
Forsigtig: Klingen er skarp. - Hvis tidligere låst, låse hånd hjulet og sænke paraffin blokken indtil dens ansigt er niveau med kanten af mikrotomen blade. Rotere hånd hjul med en stabil rytme. Udføre indledende trimning fjerne paraffin og udsætte adrenal.
- Holde dreje hånd hjulet, og afsnit indtil udgangen af adrenal. Bruge en brightfield eller dissekere mikroskop for at undersøge for tilstedeværelsen af væv i afsnittene. Frigør båndet fra vingen og ved hjælp af et andet par pincet placere den på vandet lagde på glas dias. Det kan være nyttigt at placere båndet på en overflade, strække det omhyggeligt, og derefter montere den på diaset.
- Lad dias tørre på varmepladen. Så læg dem fladt på en slide plade og bages ved 37 ° C natten over eller længere hvis vand er stadig til stede. Når tør, gemme diasene i et dias boks ved stuetemperatur.
- Sætte væk alt det brugte udstyr og rense mikrotomen.
6. immunfluorescens
- Vælg dias for immunfarvning og placere dem i en diasholderen.
- På en varmeplade, bringe et bæger, fyldt med 0,01 M citrat ved pH 2.0 i kog. Mængden af bufferen afhænger bægerglas og skal være nok til at dække sektionerne på diasene under kogning (nogle fordampning behov skal tages i betragtning). Bægerglasset dækkes med alufolie.
Bemærk: Andre metoder til hentning af antigen er tilgængelige (Se diskussion). - Deparaffinize dias i 100% xylen 2 x til 5 min. Rehydrere dias ved hjælp af følgende serier: 100% EtOH 2 x i 5 min, 70% EtOH 2 x i 5 min, Skriv 1 ultrarent vand i 5 min.
Bemærk: Efter deparaffinization, er det vigtigt ikke at lade afsnittene tørre ud: væv sektioner skal altid være dækket med buffere eller opløsninger indtil slutningen af proceduren eller væv struktur kan blive beskadiget. - For antigen hentning, placere dias i en metal diasholderen og indsætte det i bægerglasset med kogende citrat uden aluminiumsfolie. Lad det koge i 10 min.
- Fjerne bægerglasset fra varmepladen, og lad det køle til 20 min. Sørg for, at de adrenal sektioner er stadig dækket med bufferen.
- Forberede den blokerende løsning. Hvis ved hjælp af kommercielt tilgængelige farvning kit ansat for Repræsentative resultater (Se Tabel af materialer), i en tube tilføje 1,25 mL 1 x PBS, 1 dråbe (svarende til ca. 45 µL) mus Ig blokering reagens, og 5% af normal ged serum. Gemme den blokerende løsning ved 4 ° C eller på is mens du arbejder.
Bemærk: Serum anvendes afhænger den sekundære antistof vært arter. Her har været brugt sekundær antistoffer rejst i ged. For andre antistoffer, kan forskellige serumkoncentrationer være nødvendigt. Empirisk bestemme den korrekte serumkoncentrationen af test flere koncentrationer. - Overføre dias i en Coplin krukke indeholdende 1 x PBS og vask 3 x 10 min. hver på en rocker med blid vuggende.
- Forberede et befugtet kammer til farvning.
- Ryst forsigtigt, off PBS fra ét dias; tør dias bunden med en fnugfri serviet til at fjerne den overskydende PBS.
- Ved hjælp af en speciel markør for dias med hydrofobe egenskaber, tegne en cirkel omkring hver adrenal sektion, og sørg for, at glasoverfladen er tørre for at undgå spredning af blæk løsning til afsnittet. Om nødvendigt omhyggeligt tør overflade. Sted diaset i befugtet salen.
- Hurtigt, tilsæt 50 µL (eller nok til at dække sektioner) for at blokere løsning på hver sektion. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Blokering løsning volumen behov kan variere; Det er vigtigt, at sektionerne er godt dækket med løsningen. - Forberede den fortyndende løsning fra kommercielt tilgængeligt kit med 7,5 mL af 1 x PBS, 600 µL af protein koncentrat stock løsning og 5% normalt ged serum (eller nogen andre serum og koncentration anvendt i den blokerende løsning). Gemme den fortyndende løsning ved 4 ° C eller på is mens du arbejder.
- Forberede de primære antistof løsninger fortynde de primære antistoffer ved de relevante koncentrationer i opløsningen fortyndingsmiddel. Co farvning, tilføje en delprøve af hver antistof i en ny tube, og bland forsigtigt. Sted antistoffer og antistof løsninger på is indtil klar til brug.
Bemærk: Her vi ansat anti-SF1 antistof rejst i kanin og en anti-TH antistof rejst i musen. For at forberede antistoffet følge arbejder løsninger som anvist.- For SF1 brugsopløsning, i ét rør, tilføje 1 µL af anti-SF1 antistof til 999 µL af fortyndingsmiddel løsning (endelig koncentration på 1,5 µg/mL). For TH brugsopløsning, i et rør, tilsæt 1 µL anti-TH antistof i 499 µL af fortyndingsmiddel løsning (anslået slutkoncentration på 2-6 µg/mL).
- For SF1 + TH antistof arbejder blanding, i en frisk rør, tilsæt 250 µL af SF1 brugsopløsning og 250 µL af TH brugsopløsning. Bland forsigtigt af pipettering. Opbevares på is.
- Overføre dias i en Coplin krukke indeholdende 1 x PBS og vask 3 x i 5 min på en rocker med blid vuggende.
- Dias tilbage ind i befugtet salen efter aftørring overskud af PBS, pipette af SF1 + TH antistof arbejder mix (eller andre primære antistof løsning) på hver sektion, lukke den befugtet kammer og lad det natten over ved 4 ° C.
- Den følgende dag, flytte glider ind i en Coplin krukke indeholdende 1 x PBS og vask 3 x for 15 min på en rocker med blid vuggende.
- Mens vaske dias, forberede sekundær antistof løsning i den fortyndende løsning ved hjælp af den passende koncentration. Hvis udførelse af co farvning, tilføje lig mængden af hver sekundær antistof løsning i en ny tube. Bland forsigtigt af pipettering. Opbevares på is. Beskytte rørene fra lys og opbevares på køl indtil klar til brug.
Bemærk: Her, de sekundære antistoffer bruges er 488 nm fluorescerende farvestof-mærket anti-mus rejst i ged og 549 fluorescerende farvestof-mærket anti-kanin rejst i ged. Sekundær antistof løsning blev udarbejdet ved at tilføje 0,5 µL af hver sekundær antistof i 799 µL af fortyndingsmiddel løsning (endelige koncentrationer af 1,2 µg/mL). - Objektglassene tilbage i salen, befugtet efter at fjerne overskud af PBS, hurtigt afpipetteres sekundær antistof løsning på de adrenal sektioner, lukke den befugtet kammer og beskytte mod lys. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaske dias i en Coplin krukke med 1 x PBS og vask 3 x for 15 min på en rocker med blid vuggende, og sørg for at beskytte dem mod lys.
- Forbered 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning for nukleare farvning: 1 µL af DAPI (20 mg/mL) i 1 mL af 1 x PBS.
Bemærk: Blå-fluorescerende nukleare kontrastfarve kan også opnås ved hjælp af Hoechst farvning. - Afpipetteres DAPI løsning på de adrenal sektioner, dække fra lys og inkuberes ved stuetemperatur i 7 min.
- Vaske dias i en Coplin krukke med 1 x PBS og vask 3 x i 5 min på en rocker med blid vuggende samtidig beskytte dias fra lys.
- I et område, afskærmet fra direkte lys, fastsætte et cover glas og afpipetteres 60 µL eller om 3 dråber af montering agent egnet til immunofluorescens langs overfladen af dækslet glas.
- Tør forsigtigt på bagsiden af et dias med en fnugfri serviet, holdning slide nedad mod cover glas og parallelt med det, så afsnittene væv ansigt cover glas med montering agent på det. Let tryk på diaset på cover glas og sørg for at ingen luft boblen er fanget mellem diasset og dækslet glas.
- Om nødvendigt anvende yderligere pres for at fjerne luftboblerne og overskud af montering agent.
- Fastsætte diaset i en mørk beholder og helbredelse ved rumtemperatur i mindst 24 timer (eller tiden angivet i informationsskema montering agent brugt) og derefter gå videre til billedbehandling.
7. billedbehandling
Bemærk: Et fluorescens mikroskop tilsluttet et kamera er nødvendig for afsløring og fange fluorescens udledes af væv efter excitation beslutsomme bølgelængder. Mens indlysende, er det vigtigt for at huske at vælge sekundært antistof konjugeret med fluorokromer hvis excitation og emission spectra er forenelige med det udstyr til rådighed. Imaging indstillinger varierer efter mikroskop og den software, der bruges til at indfange billeder. Der er nogle grundlæggende regler, der gælder for imaging adrenal sektioner, såsom at sikre, at eksponeringstiden, kamera få indstillinger og lyskilde intensitet holdes konstant.
- Drej på lyskilden og kameraet, lancere billedbehandlingsprogrammer følge producentens anvisninger.
Bemærk: Rækkefølgen af disse handlinger kan variere afhængigt af det anvendte udstyr. - Sikre diasset på scenen, åbne lukkeren, og ser i mikroskopet okularerne bruger nukleare farvning (DAPI) kanal og lav forstørrelse (4 X) for at identificere væv på diaset: adrenal sektioner er små, og deres visualisering kan kræve nogen tid.
- Skift til en højere forstørrelse (10 X), fokus, og lukke lukkeren.
Bemærk: Det er vigtigt at undgå unødigt lange redegørelse under det lys, der kan forårsage photobleaching, hvilket resulterer i tab af signal. - Brug kommandoerne software, vælge mål (10 X) og kanalen i brug (DAPI), justere eksponeringstiden (1 s, kan justeres, hvis signalet er for stærk eller svag). Hvis tilgængelige, skal du angive binning for live imaging (ikke erhvervelse) til '2 X 2', konvertering få til 'mid', udlæsning hastighed til ' 20 MHz'. Hvis den anvendte software ikke viser skalalinjen i slutningen af imaging, Vælg indstillingen skalering bar fra menuen og Placer baren hvor det ønskes.
- Åbn lukkeren, re-justere fokus om nødvendigt, og Skift kanaler (FITC, TRITC, DAPI). Hvis mikroskop ikke er automatiseret, tage et billede af adrenal i hver kanal uden at flytte scenen og sørg for at justere markeringen af kanalen i brug. Tæt på udløseren når færdig.
Bemærk: Notér indstillingerne ansat i tilfælde af softwaren ikke automatisk gemme dem. - Gemme billederne.
Bemærk: Flettede billeder kan ofte oprettes ved hjælp af mikroskop software eller andre grafik editor softwarepakker. - Gentag imaging for andre områder af afsnittet og/eller med en højere forstørrelse.
Bemærk: En 20 X forstørrelse ofte kræver en kortere eksponeringstid (dvs. 800 ms). - For enden af imaging slukke alt udstyr i den rigtige rækkefølge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 repræsenterer en skematisk af hele protokollen beskrevet ovenfor. Binyrerne er høstet fra mus, tilstødende fedtvæv fjernes under et dissekere mikroskop og adrenal er så fast i 4% PFA. Efter dette trin, er binyrer behandlet og indlejret i paraffin, og snit med en mikrotom at skære orglet i tynde skiver, der er deponeret på objektglas. Efter tørring af sektionerne, immunofluorescens udføres, og sektionerne er afbildet på mikroskopet.
Fjernelse af halsvener (fig. 2A) er vigtigt for at lette yderligere forarbejdning og skæring af binyrerne. Vellykket fjernelse af omkringliggende fedtvæv er vist i figur 2B, hvor adrenal er let kan påvises og ingen ekstra fedt er synlige. Under dette trin er det kritisk, men du kan ikke lade det tørre ud binyrerne eller dette kunne skade væv struktur. Tørhed er genkendelige, når adrenal påtager sig et rynket udseende (figur 2C). Problemet kan løses nemt ved rehydrating adrenal i 1 x PBS før du fortsætter med fedt fjernelse.
De endelige resultater opnået følgende denne protokol er præsenteret i figur 3. Immunfluorescens billeder illustrerer immunfarvning af en binyrerne i to forskellige forstørrelser. Rød nukleare SF1 farvning etiketter binyrebarkhormon celler, hvorimod cytoplasmatisk grønne farvning etiketter celler af medulla. Den ydre kapsel er mærket af nukleare farvning i blå (DAPI) da det ikke er steroidogene (SF1-negative).
Figur 1 : Skematisk fremstilling af protokollen. Efter høst binyrerne og fjerne den tilstødende fedtvæv, væv er fast i 4% PFA, forarbejdes til paraffin indlejring, og snit. Afsnittene er derefter immunostained og afbildet med et fluorescens mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Fjernelse af peri-adrenal fedt. (A) fedtet omkring binyrerne er fjernet under et mikroskop for dissektion. (B) binyrerne efter oprydningen. (C) eksempel på væv udtørring og der kræver hydrering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunfluorescens billeddannelse af binyrerne. Eksempel på immunofluorescens billeddannelse (ved forskellige forstørrelser) af en binyrerne farves med markører af binyrebarken (SF1, nukleare farvning) og i binyremarven (TH, cytoplasmatisk grøn). Kerner (DAPI) er mærket med blåt. C: kapsel; CO: cortex; m: medulla. Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Station | Temperatur | Varighed |
| 70% EtOH | 1 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 2 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 3 | RT | 1 h |
| Absolut EtOH | 4 | RT | 1 h |
| Absolut EtOH | 5 | RT | 1 h |
| Absolut EtOH | 6 | RT | 1 h |
| Absolut EtOH | 7 | RT | 1 h |
| Xylen | 8 | RT | 1 h |
| Xylen | 9 | RT | 1 h |
| Xylen | 10 | RT | 1 h |
| Paraffinvoks | 11 | 62 ° C | 1 h |
| Paraffinvoks | 12 | 62 ° C | 1 h |
| Paraffinvoks | 13 | 62 ° C | 1 h |
Tabel 1: Væv processor program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til isolering af musen binyrerne sammen med udarbejdelsen og farvning af sektioneret paraffin-embedded mus binyrer.
I forhold til andre protokoller, vi testede, bevist protokollens immunofluorescens egnet til fleste af antistoffer bruges i vores laboratorium. Det kan dog i visse tilfælde kræve nogle justeringer til at forbedre farvning resultaterne. En variabel, der kan nemt redigeres og testet er længden af fiksering. I vores laboratorium, inkubation i 4% PFA kan variere fra 1 time til 4 h, mens i andre laboratorier fiksering tid forlænges til 12-24 h16. I vores hænder, men længere fiksering tid førte til øget baggrundsstøj og var ikke optimal for flere antistoffer rutinemæssigt anvendes i vores forskning.
PH af antigen hentning kan også spille en rolle for succesen af farvning. Varme-induceret epitop hentning (HIER) kan foretages ved hjælp af kommercielt tilgængelige løsninger med pH spænder fra sur til alkalisk, samt andre in-house lavet buffere som citrat (pH 6), ethylendiamintetra syre (EDTA, pH 8), Tris-EDTA (pH 9), Tris (pH 10). Enzymatisk behandling kan også være en mulighed for antigen demaskering. Inkubere deparaffinized dias i en begrænset periode med en oploesning indeholdende en ordentlig koncentration af et enzym (for eksempel proteinase K) kan være en alternativ metode til HIER. Det er dog vigtigt at titreres enzym koncentration og til at bestemme den ideelle inkubationstiden, da over fordøjelsen kan have en negativ effekt på væv17.
Valget af blokerende buffer er også en anden variabel til fejlfinding. Udover brugen af normale ged serum og de kommercielt tilgængelige blokerende buffer nævnt i denne protokol (praktisk i dette tilfælde, når du bruger primær museantistoffer på musen væv forhindre høj baggrund på grund af endogene mus IgG), er der yderligere muligheder såsom protein løsninger (bovint serumalbumin (BSA) eller tør mælk) eller andre kommercielt tilgængelige buffere. Det er afgørende for at sikre, at bufferen ikke indeholder stoffer, der kan forstyrre farvning, såsom biotin når ved hjælp af et biotin-streptavidin baseret metode.
Binyrerne er en endokrine orgel karakteriseret ved høj lipid indhold, der kan ofte gøre immunfarvning udfordrende på grund af høj autofluorescence af lipid. Derudover er adrenal cortex fra mus og rotter rig på autofluorescent intracytoplasmatisk lipofuscin, en pigmenteret kornede og amorfe materiale, der varierer i farve fra gul til brun. For at løse dette problem, kan stoffer såsom Sudan Black B (SBB) slukke fluorescens genereret af lipofuscins18. En anden faktor, der bringer resultaterne af en god farvning er tilstedeværelsen af blodlegemer. Hæmoglobin i erytrocytter absorberer lys bølgelængder < 600 nm og kan forstyrre fluorokromer, der strækker sig over denne bølgelængde19,20. Mens perfusion teknikker kan bruges til at rydde blod celler fra vævet fartøjer, kan anvendelse af 10 mM kobber sulfat ved pH 5 før udførelse af nukleare counterstaining også hjælpe med undertrykke de uønskede fluorescens21.
Et afgørende skridt i denne protokol er den adrenal dissektion. Binyrerne er et organ, hvis placering kan være svært at finde i situ: mus, kirtler er små og deres holdning er noget variabel. Især hos ældre dyr, er binyrer også omgivet af fedtvæv, der kan interferere med påvisning af kirtler og deres deraf følgende isolation, derfor er det afgørende at have et klart overblik over området under dette trin i protokollen. Fjernelse af peri-adrenal fedt fjernelse er en delikat skridt. Særlig opmærksomhed bør betales til binyrer samtidig afmonterer fedt at briste kapslen. Kirtel skal også holdes fugtige med PBS under procedure at undgå vævsskader.
Ved skæring, afsløre tilstedeværelsen af den lille del af adrenal væv i afsnittene kan være en udfordring på grund af væv hypopigmentering efter behandlingstrin. Et mikroskop er meget nyttigt ved skæring for kræsne væv fra voks.
Immunfarvning på paraffin-embedded sektioner er en værdifuld teknik til immunolabeling proteiner af interesse samtidig bevare morfologi af væv. Metoden præsenteres her er baseret på registrering af fluorescens, og det er især funktionelle for undersøgelser beskæftiger flere primære antistoffer, fluorescens signal er lysfølsomt og kan nemt tabt eller svækkes hvis diasene ikke håndteres korrekt (dvs. langvarig eksponering for mikroskopet lys eller unødvendig eksponering for omgivende lys). Derudover kan vi mærke en nedgang i kvaliteten af fluorescens signalet, selv over tid. Dette problem kan undgås ved hjælp af kromogent påvisning, som er photostable og kan visualiseres i mange år. Denne metode, dog mangler fordelene ved fluorescens afsløring, såsom højere mærkning præcision og samtidige mærkning af flere proteiner i en undersøgelse.
Paraffin indlejring er en praktisk metode til at behandle og lagre flere vævsprøver. Vævet behandling for paraffin indlejring selv er imidlertid ikke egnet til billeddannelse af fluorescerende reportere endogent udtrykt i nogle transgene dyr uden brug af et specifikt antistof rettet mod reporter. Kryopræservering er en metode til at undgå nedbrydning af de fluorescerende proteiner og tillade sine direkte visualisering under et mikroskop. Undgå brug af en ekstra antistof kan repræsentere en fordel. På den anden side kan kryopræservering også være begrænsende, da det påvirker væv morfologi; Det kræver også forskelligt udstyr til skæring, og opbevaring af dias og væv blokke er muligt i frysere kun.
En stor begrænsning af imaging en sektioneret væv er evnen til at få billeder af strukturelle komponenter med høj fysisk opløsninger. Vævssammensætning, er i virkeligheden en vigtig variabel i bestemmelse af kvaliteten af imaging, da det påvirker lysgennemtrængning og kan føre til dårlig opløsning. Binyrerne er et væv, der er rig på lipider, der forårsager lys spredning22. I hjernen, som også har et højt fedtindhold, er væv-clearing teknikker såsom klarhed, BABB, iDISCO og 3DISCO blevet udviklet for at forbedre væv visualisering, giver mulighed for bedre billedbehandling og 3D væv genopbygning23. Disse teknikker er at give forskerne høj kvalitet imaging data, og er tilpasset til en forskellige vifte af væv, og vi håber i fremtiden at anvende disse metoder for adrenal imaging samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mohamad Zubair for hans nyttige forslag og teknisk bistand ved oprettelsen af denne protokol. Dette arbejde blev støttet af nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyresygdomme, nationale institutter for sundhed Research Grant 2R01-DK062027 (til G.D.H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
