Summary
O presente protocolo descreve um método de célula única para análises epigenômicas iterativas usando uma única célula reutilizável. A célula única reutilizável permite a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula e a validação estatística dos resultados.
Abstract
As análises atuais do epigenoma de célula única são projetadas para uso único. A célula é descartada após um único uso, impedindo a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma única célula e exigindo dados de outras células para distinguir o sinal do ruído de fundo experimental em uma única célula. Este artigo descreve um método para reutilizar a mesma célula única para análises epigenômicas iterativas.
Neste método experimental, as proteínas celulares são primeiramente ancoradas a um polímero de poliacrilamida em vez de reticulá-las à proteína e ao DNA, aliviando o viés estrutural. Esta etapa crítica permite experimentos repetidos com a mesma célula única. Em seguida, um primer aleatório com uma sequência de andaime para ligadura de proximidade é recozido ao DNA genômico, e a sequência genômica é adicionada ao primer por extensão usando uma DNA polimerase. Posteriormente, um anticorpo contra um marcador epigenético e IgG de controle, cada um marcado com diferentes sondas de DNA, são ligados aos respectivos alvos na mesma célula.
A ligadura de proximidade é induzida entre o primer randômico e o anticorpo pela adição de um conector de DNA com sequências complementares à sequência de scaffold do primer randômico e à sonda anticorpo-DNA. Esta abordagem integra informações de anticorpos e sequências de genoma próximas em um único produto de DNA de ligadura de proximidade. Ao permitir experimentos repetidos com a mesma célula única, este método permite um aumento na densidade de dados de uma célula rara e análise estatística usando apenas dados de IgG e anticorpos da mesma célula. As células individuais reutilizáveis preparadas por este método podem ser armazenadas por pelo menos alguns meses e reutilizadas posteriormente para ampliar a caracterização epigenética e aumentar a densidade dos dados. Esse método proporciona flexibilidade aos pesquisadores e seus projetos.
Introduction
A tecnologia de célula única está entrando na era da multiômica de célula única, que integra tecnologias ômicas individuais de célula única1. Recentemente, a transcriptômica de célula única tem sido combinada com métodos para detectar acessibilidade da cromatina (scNMT-seq2 e SHARE-seq3) ou modificações de histonas (Paired-seq4 e Paired-Tag5). Mais recentemente, transcriptômica e proteômica de célula única foram integradas com acessibilidade à cromatina (DOGMA-seq6). Esses métodos usam marcação baseada em transposase para detectar acessibilidade da cromatina ou modificações de histonas.
Abordagens baseadas em transposase clivam o DNA genômico e adicionam um código de barras de DNA no final do fragmento de DNA genômico. Cada fragmento genômico clivado só pode aceitar até dois códigos de barras de DNA (= uma marca epigenética por sítio de clivagem), e o DNA genômico no local de clivagem é perdido. Portanto, abordagens baseadas em clivagem têm um trade-off entre o número de marcas epigenéticas testadas e a densidade do sinal. Isso dificulta a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula. Um método epigenômico unicelular que não cliva o DNA genômico foi desenvolvido para superar essa questão 7,8.
Além da questão derivada da clivagem mencionada acima, as abordagens baseadas em transposase têm outras limitações. Na análise do epigenoma de célula única, é fundamental conhecer a localização de histonas e proteínas associadas ao DNA no genoma. Nas abordagens atuais, isso é realizado usando células únicas não fixas e retenção de interações proteína-DNA e proteína-proteína. No entanto, isso gera forte viés para regiões acessíveis da cromatina, mesmo na análise de modificações de histonas 9. A localização de histonas e proteínas associadas ao genoma no genoma pode ser preservada sem reticulação proteína-DNA e proteína-proteína, utilizando-se um arcabouço de poliacrilamida 7,8. Essa abordagem reduz o viés estrutural observado nas abordagens atuais que dependem das interações proteína-DNA e proteína-proteína.
Abordagens baseadas em transposase podem adquirir sinais apenas uma vez de uma única célula. Portanto, é difícil delinear o epigenoma completo de uma única célula devido à queda dos sinais. Células individuais reutilizáveis foram desenvolvidas para superar as limitações atuais, permitindo a análise epigenômica iterativa na mesma célula única.
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Protocol
Observação : uma representação esquemática do método é mostrada na Figura 1.
Figura 1: Representação esquemática do fluxo de trabalho do protocolo. Os passos 7.2-13 são explicados através de representações esquemáticas. Cada linha indica uma etapa no protocolo. Uma proteína celular colorida em verde é um nucleossomo humano gerado a partir de uma estrutura cristalina (PDB: 6M4G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Equilíbrio das colunas de dessalinização
Observação : colunas de rotação de dessalinização são equilibradas conforme descrito nas etapas a seguir. As colunas de dessalinização equilibradas são utilizadas nas etapas 2.1, 3.4 e 4.6.
- Remova o fecho inferior de uma coluna de dessalinização (corte de 7 kDa, volume de esferas de resina de 0,5 ml, ver Tabela de Materiais) e solte a tampa na parte superior da coluna de dessalinização.
- Colocar a coluna num tubo de baixa ligação de proteínas de 1,5 ml (um tubo de recolha, ver Tabela de Materiais) e centrifugar a 1.500 × g durante 1 min à temperatura ambiente para remover a solução de armazenamento na coluna.
NOTA: Use uma centrífuga de rotor oscilante para achatar a parte superior do leito de contas. - Remover o fluxo no tubo de 1,5 ml e adicionar 300 μL de tampão fosfato NaCl/100 mM, pH 8,0 (ver Tabela 1), sobre o leito de resina.
- Centrifugar a 1.500 × g por 1 min à temperatura ambiente e remover o fluxo no tubo de coleta.
- Repita as etapas 1.3-1.4 três vezes adicionais.
- Descarte o buffer do tubo de coleta e coloque a coluna em um novo tubo de coleta.
- Use a coluna de dessalinização equilibrada nas etapas 2.1, 3.4 e 4.4.
2. Troca tampão de anticorpos
NOTA: Remova o glicerol, a arginina e a azida sódica dos anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 e anti-Pol II10 (ver composição do tampão mostrada na Tabela 1). Todos os procedimentos a seguir são realizados sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 1 h
- Aplicar a solução de anticorpos (100 μL, ver quadro 2) numa coluna de dessalinização equilibrada preparada após o passo 1.
- Centrifugar a 1.500 × g por 2 min a 4 °C e transferir o fluxo do tubo de coleta para um tubo de baixa ligação de proteína de 1,5 mL.
- Medir a concentração de IgG usando absorbância a 280 nm12 (use um espectrofotômetro de microvolume).
- Transfira a solução de anticorpos para um de ultrafiltração (corte de peso molecular de 100 kDa, 0,5 mL, consulte a Tabela de Materiais) e centrifugar a 12.000 × g por 5 min a 4 °C.
- Medir a concentração de IgG usando a absorbância a 280 nm.
- Repetir os passos 2,4-2,5 até que a concentração de IgG atinja 1 mg/mL.
3. Ativação de anticorpos
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 2.5 h
- Dissolver 1 mg de acetona hidrazona succinimidil 6-hidrazinonicotinato (S-HyNic, ver Tabela de Materiais) com 100 μL de N,N-dimetilformamida anidra (DMF, ver Tabela de Materiais).
NOTA: DMF é um solvente orgânico inflamável e uma potente toxina hepática absorvida através da pele. Use luvas, óculos de segurança e jaleco. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais. - Adicionar 0,6 μL de S-HyNic/DMF a 100 μL da solução de anticorpos (1 mg/mL em NaCl 150 mM/fosfato de sódio 100 mM, pH8,0. Veja na Tabela 2 os anticorpos utilizados e IgG de controle.
- Incubar à temperatura ambiente durante 2 h (protegendo da luz).
- Aplicar 100 μL de anticorpo reagido por S-HyNic no topo da coluna de dessalinização equilibrada (ver passo 1) e centrifugar a 1.500 × g durante 2 minutos a 4 °C para recolher a amostra.
- Descarte a coluna de dessalinização após o uso.
NOTA: A estabilidade dos grupos HyNic em proteínas e outras biomoléculas varia. Recomenda-se conjugar biomoléculas modificadas por HyNic imediatamente.
4. Ativação da sonda de DNA
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 2.5 h
- Dissolver uma pastilha de uma sonda de DNA modificada com amina para anticorpos ou IgG de controle (Antibody Probe, Tabela 3) com 20 μL de tampão NaCl/100 mM de fosfato de sódio, pH 8,0.
NOTA: Procure um pellet/filme fino e transparente na parte inferior do tubo. Aplique o tampão diretamente no pellet. Se o pellet não estiver visível, o pellet pode ter se desprendido e aderido à parede ou à tampa. Neste caso, centrifugar o tubo e procurar um pellet no fundo do tubo. - Dissolver 1 mg de 4-formilbenzoato de succinimidil (S-4FB, ver Tabela de Materiais) com 50 μL de DMF anidro e adicionar 10 μL de DMF à sonda de anticorpos dissolvidos.
- Adicionar 4 μL de S-4FB/DMF preparado no passo 4.2, misturar e incubar à temperatura ambiente durante 2 h (protegendo da luz).
- Aplicar 34 μL da sonda de anticorpos reagida a S-4FB na parte superior da coluna de dessalinização equilibrada (ver passo 1).
- Aplicar 15 μL de tampão fosfato de sódio 150 mM/100 mM, pH 8,0, na parte superior do leito de gel após a amostra ter sido totalmente absorvida, e centrifugar a 1.500 × g por 2 min a 4 °C para coletar a sonda de anticorpos modificada por S-4FB.
- Use o flowthrough para a conjugação subsequente; medir a absorbância a 260 nm; e calcular a taxa de recuperação da Sonda de Anticorpos.
5. Conjugação do anticorpo modificado por S-HyNic e da sonda de anticorpos modificada por S-4FB
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 2 h
- Misture o anticorpo modificado por S-HyNic e a sonda de anticorpos modificada por S-4FB e pipete a solução para cima e para baixo para misturar.
- Incubar durante 2 h à temperatura ambiente (protegendo da luz).
- Para extinguir a reação, adicione 478,8 μL de solução de Têmpera e Armazenamento (ver Tabela 1).
- Transferir a solução de anticorpos conjugados com sonda de anticorpos para um de ultrafiltração (corte de peso molecular de 100 kDa).
- Centrifugar por 5 min a 12.000 × g, 4 °C.
- Verifique o volume da solução no interior do por pipetagem.
- Repetir os passos 5.5-5.6 até que o volume atinja 100 μL e conservar a -20 °C.
OBS: A concentração de IgG é medida por ELISAsanduíche 13,14,15 utilizando um padrão de IgG.
6. Preparação de esferas magnéticas de núcleo
Observação : neste método, uma única célula é incorporada em um grânulo de acrilamida bicamadas (consulte a Figura 2). O núcleo é um grânulo magnético de poliacrilamida. A camada externa é somente de poliacrilamida. As esferas magnéticas principais são geradas nesta seção. Esta seção não é essencial para o experimento. Tempo: 3 h
Figura 2: Estrutura de um grânulo bicamada de poliacrilamida para visibilidade e fácil manuseio em experimentos REpi-seq . (A) Nanopartículas magnéticas da etapa 6.6 após centrifugação. As nanopartículas magnéticas são modificadas com acrilamida monomérica e integradas ao cordão magnético de poliacrilamida mostrado em B. (B) Representação esquemática de uma única célula reutilizável com um cordão magnético de poliacrilamida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Misturar 50 μL de tampão bicarbonato de sódio 1 M, pH 8,5, e 450 μL de solução de acrilamida a 40%.
NOTA: A acrilamida é uma neurotoxina. Use luvas, protetor ocular e jaleco. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais. - Suspender 1 g de 30 nm de pó de óxido de ferro funcionalizado com éster NHS (ver Tabela de Materiais) no tampão acrilamida/bicarbonato de sódio e incubar a 4 °C durante a noite.
NOTA: Como as contas de acrilamida são transparentes, pode ser difícil ver e manipular a posição das contas. A inclusão de um talão de núcleo feito de óxido de ferro melhora a visibilidade e facilita a manipulação, pois a posição das contas pode ser controlada usando um ímã. No entanto, se os usuários estiverem familiarizados com os experimentos REpi-seq, o uso das esferas de poliacrilamida magnética do núcleo pode ser ignorado. - Transfira a suspensão de nanoesferas para 2 tubos (1,5 mL), centrifugue a 21.300 × g por 1 h (use um rotor angulado) a 4 °C e remova o sobrenadante.
- Suspender a pasta de fundo com 1 mL de Acrilamida/Bis-acrilamida a 40% (19:1, ver Tabela de Materiais).
NOTA: A bis-acrilamida é uma neurotoxina. Use luvas e jaleco. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais. - Centrifugar a 21.300 × g por 1 h (usar um rotor angulado) a 4 °C.
- Centrifugar a 5.000 × g por 30 min (use um rotor oscilante sem freio) a 4 °C.
- Remova o sobrenadante usando uma pipeta P1000 com aspiração de baixa velocidade.
- Ajustar o volume para 400 μL de Acrilamida/Bis-acrilamida a 40% (19:1, ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 25 μL de solução de persulfato de amónio a 10% (ver Tabela 1).
NOTA: O persulfato de amônio é um forte agente oxidante. A poeira transportada pelo ar contendo persulfato de amônio pode irritar o olho, o nariz, a garganta, o pulmão e a pele ao entrar em contato. Use luvas, óculos de segurança e jaleco. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais. - Para gerar esferas de poliacrilamida magnéticas centrais, transfira 0,5 μL da suspensão de óxido de ferro modificada com acrilamida para um tubo de PCR.
- Adicionar 50 μL de 4% de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina/óleo mineral (TEMED, ver Tabela 1) e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
NOTA: TEMED é um solvente inflamável. Trabalhe debaixo de um capô. Não inale. Manter longe de chamas abertas, superfícies quentes e fontes de ignição. Use luvas, óculos de segurança e jaleco. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais.
7. Modificação do grupo amino das proteínas celulares com o monômero acrilamida
NOTA: REpi-seq foi projetado para analisar o epigenoma de células de camundongos e humanos em nível de célula única. Cada etapa deve ser otimizada ao usar esse método em células de outras espécies que não camundongos ou humanos.
- Colheita das células
NOTA: Tempo: 30 min- Meça a concentração e a viabilidade das células usando um contador de células (consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: A viabilidade das células nesta etapa afeta quantas células são células vivas na análise de dados. - Ajustar a concentração celular para 1 × 105 células/mL com meio de cultura (*) contendo 10% de soro fetal bovino.
NOTA: *O meio de cultura é um meio de cultura ideal para as células de interesse. - Transferir 1 mL da suspensão celular para um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a suspensão celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), misturar as células por pipetagem suave e centrifugar a suspensão celular a 240 × g durante 5 minutos a 4 °C.
- Remova o sobrenadante.
OBS: Todas as etapas acima devem ser realizadas em uma capela de limpeza de fluxo laminar para evitar contaminação.
- Meça a concentração e a viabilidade das células usando um contador de células (consulte a Tabela de Materiais).
- Modificação do grupo amino de proteínas celulares com acrilamida monomérica
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 1.5 h- Adicionar 1 ml de solução de modificação do grupo amino (ver Tabela 1) ao pellet de células e suspender o pellet de células por pipetagem suave.
- Incubar o tubo sobre gelo durante 1 h e centrifugar a suspensão celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 100 mL de acrilamida a 4%/1 mM EDTA/PBS contendo um corante intercalador para DNA (ver Tabela 1, 1 célula/μL).
8. Preparação de células individuais reutilizáveis
- Preparação de células individuais reutilizáveis (versão manual)
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 9 h/96 células- Misturar 1 ml da suspensão celular (1 célula/μL) e 199 ml de EDTA/PBS 1 mM contendo um corante intercalador para ADN (ver Tabela 1).
- Transferir 200 μL da suspensão celular para cada poço de placas de fundo plano de 96 poços (total de 10 placas, consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque a tampa na placa de 96 poços e digitalize as 10 placas usando um microscópio de varredura (consulte a Tabela de Materiais) para identificar poços contendo uma única célula.
- Transfira o conteúdo do poço contendo uma única célula para um tubo de PCR.
- Incline a placa (em direção ao operador) e aguarde alguns minutos até que a única célula tenha afundado na borda inferior do poço.
- Coloque a ponta da pipeta no canto inferior e transfira a célula única e o tampão (aspirar 210 μL/poço = 200 μL de tampão + 10 μL de ar) para um tubo de PCR.
NOTA: Certifique-se de usar uma dica de baixa retenção P200. - Verifique o poço usando um microscópio de fluorescência para confirmar a transferência.
- Se uma única célula ainda estiver no poço, adicione 200 μL/poço de 1 mM EDTA/PBS contendo um corante intercalador para DNA.
- Em seguida, repita a transferência.
- Centrifugar o tubo de PCR a 240 × g durante 5 min a 4 °C utilizando um rotor oscilante sem travão.
NOTA: A frenagem provoca um fluxo turbulento de água no tubo, o que interrompe a precipitação da célula única. Ao centrifugar com um rotor oscilante sem freio, a célula única sempre afundará no fundo do tubo. No entanto, se um rotor angulado for usado, a célula única se prende à parede lateral do tubo de PCR e pode ser perdida. - Remover 195 μL do sobrenadante com uma velocidade de pipetagem muito lenta.
- Adicionar 195 μL/tubo de solução de Acrilamida/Bis-acrilamida/APS (ver Tabela 1).
- Centrifugar o tubo de PCR a 240 × g durante 5 min a 4 °C utilizando um rotor oscilante sem travão.
- Remova 195 μL do sobrenadante com velocidade de pipetagem muito lenta.
- Transfira os 3 μL de fundo para o tubo de PCR contendo 4% de TEMED/óleo mineral e um grânulo magnético de poliacrilamida (gerado na etapa 6).
NOTA: Certifique-se de usar uma dica de baixa retenção P10. Dispense a célula perto do grânulo magnético de poliacrilamida. No óleo mineral, o líquido contendo a única célula adere à superfície do cordão magnético de poliacrilamida por tensão superficial. - Incubar durante a noite à temperatura ambiente.
NOTA: Este processo gera um grânulo de gel de acrilamida bicamada. O núcleo é um grânulo de gel magnético. A camada externa é gel de poliacrilamida contendo uma única célula. A célula única é embutida na camada externa do gel. Ponto de parada seguro: Depois de lavar as células individuais reutilizáveis com 50% de glicerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% tampão BSA/TBS, as células individuais reutilizáveis podem ser armazenadas a -20 °C por até 6 meses.
- Preparação de células individuais reutilizáveis (versão semiautomatizada)
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 3 h/96 células- Misturar 1 ml de suspensão celular (1 célula/μL) e 199 ml de 1 mM EDTA/PBS contendo um corante intercalador para ADN (ver Tabela 1).
- Transfira 200 μL da suspensão celular para cada poço de uma placa de nanopoço de 4 nL (ver Figura 3 e Tabela de Materiais) e coloque a placa de nanopoço de 4 nL em um robô automatizado de coleta de célula única (consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque uma placa de PCR de 96 poços como placa de destino no robô automatizado de coleta de célula única. Certifique-se de que cada poço contém 200 μL/poço de solução de Acrilamida/Bis-acrilamida/APS (ver Tabela 1).
- Transfira uma única célula de um nanopoço de 4 nL para um poço da placa de PCR de 96 poços (veja Vídeo Suplementar S1).
- Coloque uma tampa em cima da placa de PCR de 96 poços e centrifugar a placa de 96 poços a 240 × g por 5 min a 4 °C usando um rotor oscilante sem freio.
- Coloque a placa de PCR de 96 poços no convés de um robô automático de manuseio de líquidos (consulte a Tabela de Materiais, Figura 4 e Código Suplementar 1).
- Arraste e solte o Código Suplementar 1 na janela do software (consulte a Tabela de Materiais) do robô de manuseio de líquidos.
- Execute o programa no robô de manipulação automática de líquidos (consulte Vídeo Suplementar S2 e Vídeo Suplementar S3).
- Remover 195 μL do sobrenadante com uma velocidade de pipetagem muito lenta.
- Adicionar 50 μL de TEMED/óleo mineral a 4%.
NOTA: As etapas 8.2.8.1-8.2.8.2 podem ser executadas por pipetagem manual.
- Incubar durante a noite à temperatura ambiente (Figura 5). Ponto de parada seguro: Depois de lavar as células individuais reutilizáveis com 50% de glicerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% tampão BSA/TBS, armazene as células individuais reutilizáveis a -20 °C por até 6 meses.
Figura 3: Coleta e transferência automáticas de célula única para uma placa de PCR de 96 poços na etapa 8.2 . (A) Visão geral de um sistema de separação de células únicas. Um único robô de coleta de células está em uma capela limpa de fluxo laminar para evitar contaminação. (B) Uma placa de 24 poços com nanopoços de 4 nL dentro do poço. (C) Distribuição celular em um poço a partir da placa de 24 poços. Pontos verdes são células identificadas como uma única célula em cada nanopoço de 4 nL. Pontos magenta são células identificadas como duplos ou multipletos de células. (D) Imagem de campo brilhante do poço na placa de 24 poços. Um quadrado verde é um nanopoço de 4 nL contendo uma única célula. Um quadrado magenta é um nanopoço de 4 nL contendo múltiplas células. (E) Campo ampliado de cerca de nanopoços de 4 nL. Pontos brilhantes são células únicas em nanopoços de 4 nL. O sistema de seleção de célula única identifica nanopoços contendo uma única célula adquirindo imagens de campo brilhante e fluorescência de células com coloração DAPI. As células individuais identificadas são transferidas do nanopoço de 4 nL para um poço de uma placa de PCR de 96 poços. Barras de escala = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Abreviação = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Geração de células individuais reutilizáveis usando um robô de manuseio de líquidos. (A) Um deck do robô de manuseio de líquidos. O deck tem 11 slots para racks de ponta de pipeta (ponta P300: Slots 1-3, ponta P20: Slots 5-6), placa de 2 mL de poço profundo de 96 poços (Slot 4), duas placas de PCR de 96 poços contendo uma única célula por poço (Slots 7 e 10) e duas placas de fundo plano de 96 poços para resíduos líquidos (Slots 8 e 11). (B) O convés após a colocação do material de laboratório. (C) Representação esquemática da pipetagem robótica na etapa 8.8.1. O programa remove o sobrenadante sem aspirar uma única célula do fundo da placa de PCR de 96 poços. (D) Células únicas reutilizáveis geradas usando o Código Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
9. Recozimento e extensão aleatória do primer
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Os asteriscos (*) nas etapas seguintes indicam que um separador magnético pode ser usado para controlar a posição das esferas de poliacrilamida contendo uma única célula reutilizável no tubo. No entanto, o uso do separador magnético não é essencial. Ao descer a ponta da pipeta lentamente ao longo da parede do tubo, as contas são empurradas para cima para lavagem ou troca de tampão. Tempo: 9 h
- Remover o óleo mineral por pipetagem(*) e lavar (*) 5 vezes com 200 μL de tampão TP Mg(-) 1x (diluir 10x TP Mg(-) tampão para 1x tampão com água ultrapura, ver Tabela 1).
- Retirar o sobrenadante (*) e adicionar 15 μL de tampão de recozimento (ver quadro 1).
- Incubar por 1 h no gelo.
NOTA: O objetivo desta incubação é permeabilizar o plasma e as membranas nucleares e entregar o primer aleatório ao núcleo celular. - Coloque os tubos de PCR num termociclador e aqueça a 94 °C durante 3 minutos.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de aproximadamente 20 μL, incluindo o volume do cordão de poliacrilamida. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. - Transfira os tubos para um bloco metálico resfriado por gelo e incube por 2 min.
- Adicionar 4 μL da mistura MgSO4/NaCl/dNTP (ver Tabela 1) e misturar com um misturador de vórtice a uma velocidade média.
- Adicionar 1 μL de Bst polimerase, fragmento grande (ver Tabela de Materiais) e misturar usando um misturador de vórtice a uma velocidade média.
- Incubar durante 4 h num agitador (600 rpm a 4 °C).
NOTA: O objetivo desta incubação é entregar a Bst polimerase ao núcleo celular. - Coloque o tubo de PCR em um termociclador e execute um dos seguintes programas.
- Execute um programa de 4 horas: 10 °C por 30 min, 20 °C por 30 min e 25 °C por 180 min.
- Como alternativa, execute um programa noturno: 4 °C por 4 h, 10 °C por 2 h, 20 °C por 2 h, 25 °C por 4 h e mantenha a 4 °C.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de aproximadamente 25 μL, incluindo o volume do cordão de poliacrilamida. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. Ponto de parada seguro: Pare o experimento aqui por até 1 dia, armazenando as células individuais reutilizáveis a 4 °C.
10. Ligação de anticorpos
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 1.5 h
- Adicionar 1,625 μL de solução de NaCl/EDTA/BSA (ver quadro 1) e misturar por vórtice a baixa velocidade.
NOTA: Esta etapa visa 1) facilitar a quelação de Mg2+ por EDTA, 2) estabilizar a ligação do1º primer aleatório estendido por NaCl 300 mM e 3) bloquear a ligação inespecífica de anticorpos usando albumina de soro bovino (BSA) na reação subsequente. - Incubar por 1 h em gelo e adicionar 0,1 μg/mL cada de anticorpo e controlar a IgG conjugada com a Sonda de Anticorpos (preparada na etapa 5).
- Incube durante a noite no gelo com agitação suave em uma coqueteleira.
11. Ligadura de proximidade da sonda de anticorpos e primer aleatório proximalmente estendido
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Os asteriscos (*) indicam onde um separador magnético pode ser usado para controlar a posição de esferas de poliacrilamida contendo uma única célula reutilizável no tubo. No entanto, o uso do separador magnético não é essencial. Ao descer a ponta da pipeta lentamente ao longo da parede do tubo, as contas podem ser empurradas para cima para lavagem ou troca de tampão. Tempo: 6 h
- Lavar (*) duas vezes com 200 μL de tampão TPM-T 1x (20 min de incubação em cada lavagem) em gelo. Diluir 10x tampão TPM-T (Tris-HCl/cloreto de potássio/sulfato de magnésio/Triton X-100) para 1x com água ultrapura).
- Retire (*) o sobrenadante e lave (*) uma vez com 1x tampão T4 DNA ligase (ver Tabela de Materiais).
- Retirar (*) o sobrenadante e adicionar 19 μL de Solução Adaptadora de Ligadura (ver Tabela 1).
- Incubar durante 1 h a 25 °C.
- Adicionar 1 μL de DNA ligase T4 (ver Tabela de Materiais) e misturar o tubo num misturador de vórtices a uma velocidade média.
- Coloque o tubo em um termociclador e execute o seguinte programa: programa de ligadura de proximidade, 4 h a 16 °C e 30 min a 25 °C.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de aproximadamente 25 μL, incluindo o volume do cordão de poliacrilamida. A temperatura da tampa do termociclador é a temperatura ambiente. - Lavar (*) duas vezes brevemente com 200 μL de 1x Bst Mg(-) tampão EDTA(+) (ver Tabela 1; preparar 1x buffer a partir de 10x buffer de estoque) e armazenar a célula a 4 °C, durante a noite. Ponto de parada seguro: Pare o experimento aqui por até 1 dia, armazenando as células individuais reutilizáveis a 4 °C.
12. Extensão total da 1ª cartilha aleatória
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 4.5 h
- Lavar duas vezes com 200 μL 1x Bst Mg(-) tampão EDTA(-) (ver Tabela 1, preparar 1x buffer de 10x buffer), remover o sobrenadante e adicionar 20 μL da mistura Bst/dNTPs/MgSO4 (ver Tabela 1).
- Misturar com um misturador de vórtices à velocidade média e incubar durante 4 h num agitador orbital (a 6 °C e 500 rpm).
- Coloque o tubo em um termociclador e execute o seguinte programa: programa de extensão total: 10 °C por 1 h, 20 °C por 1 h, 30 °C por 1 h, 40 °C por 1 h, 50 °C por 1 h, 65 °C por 1 h, 94 °C por 10 min e segure a 4 °C.
NOTA: Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido aqui por até 1 dia armazenando as células individuais reutilizáveis a 4 °C.
13. Amplificação de deslocamento múltiplo
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 2,5 h (passos 13,1-13,2) + 15 min (passos 13,3-13,4) + 1 dia (passos 13,5-13,10)
- Adicionar 0,4 μL de 100 μM do 2ºprimer aleatório (ver quadro 3) e misturar com um misturador de vórtices a velocidade média.
- Incubar durante 2 h a 6 °C e 500 rpm num agitador orbital e colocar o tubo num termociclador e aquecer a 94 °C durante 3 minutos.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de aproximadamente 25,4 μL, incluindo o volume do cordão de poliacrilamida. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. - Coloque os tubos em um bloco metálico resfriado por gelo e adicione 1 μL/tubo de Bst DNA polimerase.
- Vórtice em velocidade lenta, coloque os tubos em um termociclador e execute o seguinte programa:
4 °C durante 4 h, 10 °C durante 30 min, 20 °C durante 30 min, 30 °C durante 30 min, 40 °C durante 30 min, 50 °C durante 30 min, 65 °C durante 60 min, 94 °C durante 3 min e manter a 4 °C.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de aproximadamente 26,4 μL, incluindo o volume do cordão de poliacrilamida. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. Ponto de parada seguro: Pare o experimento aqui por até 1 dia, armazenando as células individuais reutilizáveis a 4 °C. - Coletar o sobrenadante (aproximadamente 20 μL) e transferi-lo para um tubo de PCR.
- Conservar o sobrenadante recolhido a -80 °C.
- Adicionar 20 μL/tubo de tampão Tween 20/0,1x TE a 0,05% a um tubo de PCR contendo a célula única reutilizável (ver Tabela 1) e incubar a célula única reutilizável a 4 °C, durante a noite. Ponto de parada seguro: Pare o experimento aqui por alguns dias, estendendo o tempo de incubação.
- Recolher o sobrenadante e combiná-lo com a amostra recolhida no passo 13.5.
- Repita as etapas 13.7-13.8 mais uma vez. Mergulhe a célula única reutilizável em 50% de glicerol/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS e incube-a por 30 min em um agitador orbital (4 °C, 600 rpm). Conservar a célula única reutilizável a -20 °C até à próxima experiência.
- Adicionar 40 μL de mistura Exo-master (ver quadro 1) e colocar o tubo num termociclador e executar o seguinte programa: i) 95 °C durante 5 min, ii) 95 °C durante 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C durante 30 s, v) repetir os passos ii-iv 19 vezes, vi) 72 °C durante 5 min, vii) manter a 4 °C.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de aproximadamente 45 μL, incluindo o volume do cordão de poliacrilamida. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido aqui por pelo menos alguns dias, armazenando a amostra a -80 °C.
14. Purificação fenol-clorofórmio e precipitação de polietilenoglicol
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 1.5 h
- Transfira o produto para um tubo de baixa ligação de DNA de 0,5 mL e adicione 100 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico.
NOTA: Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico causa irritação e possivelmente queimaduras por contato. Use luvas, óculos de segurança e jaleco. Use apenas com ventilação adequada, ou use um respirador apropriado. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais. - Agitar durante 30 s manualmente e centrifugar a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
- Recolher a fase aquosa (80 μL) num tubo de baixa ligação de 0,5 ml de ADN e adicionar 40,84 μL/tubo de mistura de acrilamida linear/MgCl2 (ver Tabela 1).
- Adicionar 47,06 μL/tubo de 50% (p/v) PEG8000 (livre de RNase) e misturar por pipetagem.
- Incubar durante 20 min à temperatura ambiente e centrifugar a 240 × g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Retirar o sobrenadante e adicionar 400 μL/tubo de etanol a 80% (EtOH).
- Lave com EtOH 80%, retire o sobrenadante usando um aspirador e seque o pellet ao ar.
- Suspender o pellet com 20 μL de 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, tampão pH 7,4 e conservar a solução a -80 °C.
NOTA: Meça a concentração de ADN utilizando um corante intercalador específico para ADN de fita dupla (ver Tabela de Materiais). Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido aqui com segurança por pelo menos uma semana.
15. Transcrição in vitro
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase e RNase. Tempo: 5 h
- Descongelar o ADN de produtos derivados de uma única célula (a partir do passo 14) e preparar uma biblioteca mista de produtos derivados de uma única célula misturando 2 μL/célula dos produtos de ADN (volume total de 20 μL).
- Adicionar 26 μL de mistura mestra de transcrição in vitro (ver Tabela de Materiais e protocolo do fabricante) e misturar por pipetagem.
- Colocar o tubo de PCR num termociclador e incubar durante 4 h a 37 °C.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de 46 μL. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. - Adicionar 5 μL de tampão DNase I 10x (ver Tabela de Materiais) e adicionar 4 μL de DNase I (livre de RNase, 4 U, ver Tabela de Materiais).
- Misturar e incubar durante 15 min a 37 °C e transferir a amostra para um tubo de 0,5 ml.
- Adicionar 300 μL/tubo de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio (ver Tabela de Materiais) e misturar por vórtice suave.
NOTA: Tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio pode levar a queimaduras químicas graves por contato. Use luvas, óculos de segurança e jaleco. Use apenas com ventilação adequada ou use um respirador apropriado. Siga as diretrizes de segurança institucionais. Descarte os materiais de laboratório usados de acordo com as diretrizes institucionais. - Incubar durante 5 min em T.R. num agitador e, em seguida, armazenar as amostras a -80 °C até 3 dias.
NOTA: Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido aqui com segurança por até 3 dias.
16. Purificação do RNA
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase e RNase. Tempo: 2 h
- Adicionar 80 μL/tubo de clorofórmio à amostra do passo 15.7 e agitar vigorosamente o tubo manualmente durante 15 s.
- Incubar durante 2-15 min à temperatura ambiente e centrifugar a amostra a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
- Coletar e transferir a fase aquosa da amostra (~200 μL) para um novo tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 600 μL/tubo de tiocianato-fenol-clorofórmio de Guanidinium e transferir a amostra para um tubo de 1,5 ml.
- Adicionar 180 μL/tubo de clorofórmio e agitar vigorosamente o tubo manualmente durante 15 s.
- Centrifugar a amostra a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
- Coletar e transferir a fase aquosa da amostra (~450 μL) para um tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 60 μL/tubo de Acrilamida Linear (5 μg/μL) e adicionar 400 μL/tubo de isopropanol a 100% à fase aquosa.
- Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 10 min e centrifugar-o a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
- Retire o sobrenadante com cuidado.
- Lavar o pellet de RNA 3 vezes com 200 μL de etanol 75% (água livre de EtOH/RNase), remover o sobrenadante e secar ao ar o pellet de RNA.
NOTA: Não deixe o RNA secar completamente, pois o pellet pode perder solubilidade. - Ressuspender a pastilha de RNA em 20 μL de água livre de RNase contendo um inibidor de RNAse (1 μL/20 μL) e dissolver a pelota por pipetagem.
- Medir a absorbância a 260 nm.
17. Transcrição reversa
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 1 h
- Adicionar 7 μL/tubo de primer de transcrição reversa + mistura de dNTP (ver Tabela 1 e Tabela 3) e colocar os tubos em um termociclador.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de 27 μL. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. - Aqueça a 65 °C durante 5 min e coloque os tubos no gelo durante, pelo menos, 1 min.
- Adicionar 14 μL/tubo de mistura mestra de transcriptase reversa (ver quadro 1) e misturar por pipetagem.
- Colocar os tubos num termociclador e incubá-los a 55 °C durante 10 min e depois a 80 °C durante 10 min.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de 60 μL. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C.
18. Síntese da segunda vertente
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 2.5 h
- Adicionar 40 μL/tubo de água ultrapura e dividir a solução de 100 μL em dois tubos de PCR de 0,2 mL (50 μL/tubo).
- Adicionar 60 μL/tubo da mistura Second Strand Synthesis (ver quadro 1) e colocar os tubos num termociclador e executar o seguinte programa: i) 95 °C durante 5 min, ii) 95 °C durante 30 s, iii) 60 °C durante 30 s, iv) 72 °C durante 30 s, v) repetir os passos ii-iv 20 vezes e vi) manter a 4 °C.
NOTA: O tamanho do tubo é de 0,2 mL. O volume da solução é de 110 μL. A temperatura da tampa do termociclador é de 105 °C. - Adicionar 4,4 μL/tubo de EDTA 0,5 M (20 mM final) e conservar a -80 °C, durante a noite.
NOTA: Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido aqui com segurança por até alguns dias. - Purificar o ADN por purificação fenol-clorofórmio e precipitação de polietilenoglicol (descrito no passo 14).
NOTA: Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido com segurança aqui por pelo menos uma semana.
19. Digestão de enzimas de restrição e seleção de tamanho
NOTA: O procedimento a seguir é realizado sob uma coifa limpa para evitar a contaminação por DNase. Tempo: 3 h (passos 19.1-19.7)
- Medir a concentração de ADN do ADN purificado (a partir do passo 18.4) medindo a absorbância a 260 nm.
- Transfira 6 μg de DNA para um tubo de PCR, adicione 30 μL de tampão de digestão 10x e ajuste o volume para 294 μL com água ultrapura.
- Adicionar 6 μL da enzima de restrição BciVI e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Realizar precipitação de EtOH com poliacrilamida linear.
- Adicionar 60 μL/tubo de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e, em seguida, adicionar 40 μL/tubo de acrilamida linear (5 mg/ml, ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 400 μL/tubo de EtOH e incubar durante a noite a -20 °C.
NOTA: Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido aqui com segurança por um dia. - Centrifugar 12.000 × g durante 10 min a 4 °C e remover o sobrenadante.
- Lave o pellet duas vezes com EtOH 80% e seque o pellet.
- Dissolva o pellet com 20 μL de tampão 1xTE e adicione 4 μL/tubo de tampão de carregamento fresco 6x gel.
- Carregar a amostra em gel de agarose a 5%/tampão TAE 0,5x e realizar eletroforese (50 V por 40 min).
- Cortar e recolher o gel acima de 50 pb (ver Figura 6) e extrair o ADN utilizando um kit de extracção em gel.
NOTA: Ponto de parada seguro: O experimento pode ser interrompido com segurança aqui por pelo menos uma semana. - Construir a biblioteca de sequenciamento usando um kit de preparação de biblioteca de DNA (ver Tabela de Materiais)16,17.
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Representative Results
K562 células únicas foram geradas usando o protocolo descrito na etapa 8 (ver Figura 5). Células isoladas foram incluídas na camada externa do cordão de poliacrilamida. O DNA celular foi corado e visualizado usando um corante intercalador para coloração de DNA.
Figura 5: Células únicas reutilizáveis geradas. As células são coradas com um corante intercalador para DNA (fluorescência verde). As setas brancas indicam células únicas embutidas na camada externa de contas de poliacrilamida. A célula única reutilizável é colocada em uma placa de fundo plano de 96 poços. As imagens foram obtidas por um microscópio de varredura, BZ-X710. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os resultados apresentados na Figura 6 suportaram a geração dos produtos de DNA desejados. Os produtos de DNA da etapa 19.7 foram clivados pela enzima de restrição BciVI em fragmentos de 19-20 pb, 31-32 pb, 49 pb e >49 pb. Esses resultados suportam a conclusão de que a maioria dos produtos contém sequências derivadas de Antibody Probe e2ª sequência derivada de primers aleatórios. Os produtos de DNA foram posteriormente ligados com o adaptador Illumina usando um kit TruSeq Nano e sequenciados usando um sequenciador Illumina NovaSeq6000.
Figura 6: Produtos de DNA antes e após a digestão da enzima de restrição BciVI. (A) A digestão com BciVI gerou os fragmentos esperados de 19-20 pb, fragmentos de 31-32 pb e os produtos desejados (>49 pb) contendo Código de barras de anticorpos, sequência ligada, DNA genômico e código de barras celular. B) Distribuição das dimensões dos produtos finais no final da etapa 19.7. A biblioteca de DNA construída foi analisada por eletroforese capilar. A linha rosa claro indica os produtos desejados contendo adaptadores de sequenciamento, código de barras de anticorpos e código de barras celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os resultados do sequenciamento indicaram que os produtos gerados pelas etapas 7 a 19 contêm a sonda de anticorpos, a sequência ligada, a sequência do genoma e o código de barras celular. Leituras mapeadas únicas de anti-H3K27ac e anti-H3K27me3 foram significativamente mais numerosas do que de IgG de controle (ver Figura 7A). Isso indica que a ligação específica de anti-H3K27ac e anti-H3K27me3 aumenta o número de produtos desejados. A tecnologia mais avançada para análise de epigenoma de célula única, Paired-Tag, adquire cerca de 2.000 leituras únicas de H3K27ac e 1.500 leituras únicas de H3K27me3 por núcleo. Nossos resultados mostraram um número muito maior de leituras únicas (média de 699.398 sinais H3K27ac/célula e 505.433 sinais H3K27me3/célula). Os resultados também apoiaram a conclusão de que experimentos repetidos usando a mesma célula única reutilizável reduzem a perda de sinal e aumentam a densidade do sinal.
Os sinais REpi-seq mostrados na Figura 7A foram avaliados comparando-se os dados REpi-seq com os dados de ChIP-seq em massa. Na Figura 7B, em média, 91% ± 3,24% dos sinais H3K27ac do REpi-seq se sobrepuseram aos picos do H3K27ac no ChIP-seq em massa. Essa análise mede o nível de "precisão" na análise do epigenoma unicelular18. A precisão dos métodos epigenômicos atuais de célula única para a marca de histona ativa H3K4me3 é de 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18,50% (scChIC-seq; H3K4me3)19 e 60% (ACT-seq; H3K4me3)20. Além disso, a precisão do REpi-seq para a marca de histona inativa H3K27me3 foi, em média, de 52,09% ± 3,71% (Figura 7C), enquanto a precisão para H3K27me3 foi de 47% no ChIC-sequnicelular 19. Em conclusão, o REpi-seq apresenta alta precisão na detecção de H3K27ac e H3K27me3.
Analisou-se também a "sensibilidade"18 do REpi-seq, que mede quantos picos de ChIP-seq volumosos foram detectados pelas leituras reproduzidas do REpi-seq (Figura 7D,E). A sensibilidade do REpi-seq foi de 55,30% em H3K27ac e 50,94% em H3K27me3. Em outros métodos de epigenoma unicelular, a sensibilidade é de 5% no Drop-ChIP (H3K4me3)18, 5% no ACT-seq (H3K4me3)20 e 9,5% no scChIC-seq (H3K27me3)19. Estes resultados indicam que REpi-seq é sensível na detecção de sinais epigenéticos.
Figura 7: Números de sinal, precisão e sensibilidade no REpi-seq. Os mesmos experimentos foram repetidos 3 vezes com a mesma célula única reutilizável (uma célula K562). (A) Sinais adquiridos das mesmas oito células individuais. Cada ponto representa uma única célula reutilizável. Sinais únicos de controle IgG (preto), anti-H3K27me3 (azul) e anti-H3K27ac (vermelho) nas mesmas células individuais foram contados. Os sinais anti-H3K27me3 e anti-H3K27ac foram significativamente maiores do que a IgG controle, indicando que a ligação específica dos anticorpos gera sinais de forma mais eficiente do que a IgG controle. Barra: média, barra de erro: desvio padrão. (B, C) Precisão das leituras únicas de REpi-seq H3K27ac (B) e H3K27me3 (C). A precisão das leituras únicas derivadas de REpi-seq foi baseada na sobreposição com picos conhecidos de ChIP-seq da análise de células a granel K562 (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). As porcentagens de leituras de REpi-seq H3K27ac e H3K27me3 confirmadas pelos picos de ChIP-seq foram calculadas em cada célula. Os resultados são expressos como a porcentagem média de 8 células individuais. (D, E) Sensibilidade do REpi-seq na detecção de picos conhecidos de H3K27ac (D) e H3K27me3 (E). Foram utilizadas leituras únicas do REpi-seq. Picos de H3K27ac e H3K27me3 identificados por ChIP-seq de células a granel K562 no Projeto ECODE (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) foram reconhecidos por leituras únicas REpi-seq. Os resultados são expressos como a porcentagem média de picos ChIP-seq reconhecidos por leituras únicas REpi-seq. Os painéis B-E foram reproduzidos a partir de Ohnuki et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Buffers usados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Controle de anticorpos e IgG utilizados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: DNA de oligonucleotídeos utilizado neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
Vídeo suplementar S1: Coleta automatizada de célula única e transferência para uma placa de PCR de 96 poços (etapa 8.2.4). Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar S2: Remoção do sobrenadante de um poço contendo uma única célula usando um robô de manuseio de líquidos (etapa 8.2.8.1). Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar S3: Adição de 4% de TEMED/óleo mineral a um poço contendo uma única célula usando um robô de manuseio de líquidos (etapa 8.2.8.2). Clique aqui para baixar este vídeo.
Código Suplementar 1: Programa automatizado do robô de manuseio de líquidos das etapas 8.2.8.1-8.2.8.2. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este artigo descreve o protocolo passo-a-passo para a análise multiepigenômica de célula única recentemente relatada usando células únicas reutilizáveis7. Nos parágrafos subsequentes, discutimos pontos críticos, enfatizando possíveis limitações no protocolo.
Um dos pontos críticos ao longo do protocolo (das etapas 7.2-13) é evitar a contaminação por DNase. Uma única célula tem apenas duas cópias de DNA genômico. Portanto, danificar o DNA genômico reduz criticamente o número de sinal. Evitar a contaminação com DNase é essencial para proteger a integridade do DNA genômico.
A permeabilidade dos reagentes através da membrana celular/parede celular também é crítica durante todo o protocolo. O REpi-seq foi projetado para analisar o epigenoma de células humanas e de camundongos em nível de célula única. Espera-se que as condições ótimas para este método experimental variem dependendo da permeabilidade dos tipos celulares e da membrana nuclear a cada reagente. Portanto, quando o método é aplicado a outras células que não células de camundongos e humanas, como células vegetais, leveduras e bactérias, as condições em cada etapa precisam de otimização.
Acreditamos que um ponto crítico específico para a etapa 9.5 (recozimento do primeiro primer aleatório) é a rápida velocidade de resfriamento após a desnaturação do DNA genômico. O resfriamento lento e gradual após a desnaturação pode reduzir a eficiência de recozimento dos primers aleatórios que se ligam ao DNA genômico. Além disso, na etapa 11 (ligadura de proximidade), um ponto crítico é a composição do tampão. Tampões contendo polietilenoglicol (PEG) são amplamente utilizados para métodos de ligadura mais rápidos em aplicações de biologia molecular. Uma baixa concentração de PEG (por exemplo, <7,5%) promove a rápida formação de DNA de fita dupla sem precipitação de DNA. No entanto, observamos que o tampão de ligadura contendo PEG induz a retração do grânulo de gel unicelular contendo a célula única (célula única reutilizável), sugerindo que a malha do arcabouço de poliacrilamida encolheu. Como esse encolhimento pode causar redução da acessibilidade da ligase do DNA T4, decidimos não utilizar o protocolo de ligadura mais rápida para REpi-seq.
No REpi-seq, os resultados podem ser avaliados pela frequência de redetecção de sinais em células isoladas. A frequência de redetecção é útil para monitorar reações, incluindo ligadura de proximidade com a sonda de anticorpos e o primeiro primer aleatório. Relatamos anteriormente7 que 62,03% das leituras de H3K27ac em um experimento foram confirmadas em dois experimentos replicados, sugerindo que a eficiência da ligadura de proximidade em experimentos individuais é maior do que a porcentagem geral de redetecção em experimentos repetidos.
Também relatamos anteriormente7 a detecção bem-sucedida da ligação da RNA polimerase II (Pol II) ao DNA em células individuais reutilizáveis. A ligação de Pol II é difícil de capturar com os métodos atuais de epigenoma de célula única devido à natureza temporal e instável dessa ligação.
As abordagens atuais baseadas em transposase CUT&Tag para análise de epigenoma de célula única requerem a preservação da interação nucleossomo-DNA. Um anticorpo específico liga-se a uma modificação de histona; em seguida, a transposase ligada ao anticorpo cliva o DNA genômico e insere um código de barras de DNA no local de clivagem do DNA. Esta reação depende da interação nucleossomo (histona)-DNA. Portanto, é essencial que as interações nucleossomo-DNA e a estrutura das proteínas celulares e da cromatina permaneçam intactas. Assim, as abordagens CUT&Tag são inevitavelmente enviesadas para regiões acessíveis da estrutura da cromatina na análise de modificações de histonas.
O viés inevitável em direção às regiões acessíveis da cromatina dificulta o aumento do número de sinais epigenéticos na análise do epigenoma de uma única célula. As estruturas da cromatina são formadas por múltiplos tipos de interações moleculares, incluindo interações DNA-nucleossomo e nucleossomo-nucleossomo através de proteínas associadas ao nucleossomo. Assim, optou-se por não preservar as interações DNA-proteína e proteína-proteína nas células individuais reutilizáveis, preservando a localização das proteínas celulares. Essa característica é realizada com o uso de acrilamida monomérica e uma mistura de paraformaldeído (etapa 7 do protocolo), que modifica o grupo amino em proteínas celulares em vez de fazer ligações cruzadas de proteína para proteína ou proteína para DNA.
A localização das histonas e proteínas associadas ao genoma é retida pela conexão com o polímero de poliacrilamida. Os nucleossomos são desnaturados em torno de 71-74 °C21. Portanto, na célula única reutilizável, as histonas são provavelmente desnaturadas e relaxadas/dissociadas umas das outras após a etapa de recozimento do1º primer aleatório (94 °C). Isso pode relaxar a estrutura da heterocromatina e melhorar a acessibilidade de anticorpos e outras moléculas às regiões da heterocromatina. Esta conclusão é apoiada pelos resultados relatados7 mostrando que o viés associado à estrutura da cromatina é reduzido em células individuais reutilizáveis em comparação com as abordagens CUT&Tag9.
A conexão da histona H3 à poliacrilamida é mantida após pelo menos 3 rodadas de desnaturação térmica, pois a localização das histonas na célula única reutilizável é preservada ao longo de experimentos repetidos7. Esse recurso permite a repetição do mesmo experimento usando a mesma célula única. Experimentos repetidos contribuem para aumentar o número de sinais de uma única célula em comparação com as abordagens CUT&Tag.
A verificabilidade é um princípio fundamental na ciência. No entanto, a verificação de resultados experimentais de uma única célula não é viável em abordagens CUT&Tag, pois experimentos repetidos com as mesmas células não são possíveis. O DNA genômico é clivado pela transposase e recebe o código de barras de DNA para uma marca epigenética. O DNA genômico clivado é liberado de seu local original. Portanto, a abordagem CUT&Tag está em desvantagem para a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula. Esta característica dos métodos CUT&Tag está subjacente ao trade-off da diminuição da densidade do sinal com um aumento do número de marcas epigenéticas por célula única.
Para evitar esse problema, copiamos o DNA genômico em vez de cortar o genoma e, em seguida, marcamos o DNA genômico copiado com uma sonda de DNA de anticorpos. O REpi-seq permite a análise das mesmas células individuais e aumenta a densidade do sinal. Ele também fornece um meio para verificabilidade de resultados experimentais, multiplexação de análise epigenômica e solução do problema de trade-off em abordagens CUT&Tag. Embora o método supere as limitações da análise epigenômica baseada em transposase, ele ainda não é capaz de analisar um grande número de células em nível de célula única. É necessário um maior desenvolvimento.
Em conclusão, o REpi-seq copia o DNA genômico em vez de cortar o genoma e, em seguida, marca o DNA genômico copiado com uma sonda de DNA de anticorpos. O REpi-seq ainda está na infância e precisa aumentar a produção de células. No entanto, REpi-seq tem pontos fortes, que superam as limitações nos métodos atuais de epigenoma de célula única: 1) aumentar a densidade de sinal reduzindo as desistências de sinais através de experimentos repetidos nas mesmas células individuais; 2) redução do viés estrutural pela redução de regiões inacessíveis com base na estrutura da cromatina; 3) fornecer verificabilidade de resultados experimentais por experimentos repetidos na mesma célula, 4) identificação do sinal baseada na probabilidade de redetecção do mesmo sinal em cada célula; 5) analisar múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula sem competição entre marcas epigenéticas. Esses avanços permitem analisar mecanismos epigenéticos em uma única célula, o que é uma aplicação importante e inviável com os outros métodos epigenômicos unicelulares.
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Disclosures
Os Drs. Ohnuki e Tosato são co-inventores de uma patente intitulada "Métodos para preparar uma única célula reutilizável e métodos para analisar o epigenoma, transcriptoma e genoma de uma única célula" (EP3619307 e US20200102604). O pedido de patente foi depositado em parte com base em resultados preliminares relacionados à tecnologia descrita no presente manuscrito. A invenção ou invenções descritas e reivindicadas neste pedido de patente foram feitas enquanto os inventores eram funcionários em tempo integral do governo dos EUA. Portanto, de acordo com o 45 Code of Federal Regulations Part 7, todos os direitos, títulos e interesses sobre este pedido de patente foram ou deveriam ser atribuídos por lei ao Governo dos EUA. O governo dos EUA transmite uma parte dos royalties que recebe aos seus inventores empregados sob 15 U.S. Code § 3710c.
Acknowledgments
Agradecemos aos Drs. David Sanchez-Martin e Christopher B. Buck pelos comentários durante a fase de conceituação do projeto. Também agradecemos ao Núcleo de Genômica, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde pela ajuda em experimentos preliminares e ao Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH pelo aconselhamento em análise computacional. Agradecemos à Sra. Anna Word por ajudar na otimização das DNA polimerases utilizadas no método. Este trabalho utilizou os recursos computacionais do cluster NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Este projeto é apoiado pelo Programa Intramuros do Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, o Prêmio de Inovação do Diretor do NCI (#397172) e fundos federais do Instituto Nacional do Câncer sob o Contrato Nº HHSN261200800001E. Agradecemos aos Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy e a todos os membros do Laboratório de Oncologia Celular pelos comentários produtivos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo- DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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