Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Spårning av bispecifik antikroppsinducerad T-cellhandel med hjälp av Luciferas-transducerade humana T-celler

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Här beskriver vi en metod för att transducera humana T-celler med luciferas för att underlätta in vivo-spårning av bispecifik antikroppsinducerad T-cellshandel till tumörer i studier för att utvärdera antitumöreffekten och mekanismen för T-cellengagerande bispecifika antikroppar.

Abstract

T-cellengagerande bispecifika antikroppar (T-BsAbs) befinner sig i olika stadier av preklinisk utveckling och klinisk testning för solida tumörer. Faktorer som valens, rumsligt arrangemang, interdomänavstånd och Fc-mutationer påverkar antitumöreffekten av dessa terapier, vanligtvis genom att påverka homing av T-celler till tumörer, vilket fortfarande är en stor utmaning. Här beskriver vi en metod för att transducera aktiverade humana T-celler med luciferas, vilket möjliggör in vivo-spårning av T-celler under T-BsAb-terapistudier. T-BsAbs förmåga att omdirigera T-celler till tumörer kan utvärderas kvantitativt vid flera tidpunkter under behandlingen, vilket gör det möjligt för forskare att korrelera antitumöreffekten av T-BsAbs och andra ingrepp med T-cellernas uthållighet i tumörer. Denna metod lindrar behovet av att offra djur under behandling för att histologiskt bedöma T-cellinfiltration och kan upprepas vid flera tidpunkter för att bestämma kinetiken för T-cellshandel under och efter behandlingen.

Introduction

T-cellengagerande bispecifika antikroppar (T-BsAbs) är konstruerade antikroppar som används för att ge artificiell specificitet till polyklonala T-celler genom att engagera T-celler genom en bindningsarm och ett tumörantigen genom en annan bindningsarm. Denna teknik har framgångsrikt tillämpats på hematologiska cancerformer (CD19-riktad blinatumomab1), och många T-BsAbs är i preklinisk och klinisk utveckling för en mängd solida tumörer samt2. T-BsAbs engagerar polyklonala T-celler på ett stort histokompatibilitetskomplex (MHC)-oberoende sätt, och därför är även tumörer som nedreglerar humana leukocytantigener (HLA) mottagliga för denna typ av terapi 3,4. T-BsAbs har utvecklats i dussintals olika format, med skillnader i valens och rumsliga arrangemang av T-cellen och tumörbindande armar, interdomänavstånd och införandet av en Fc-domän, vilket påverkar halveringstiden och kan inducera effektorfunktioner om de finns5. Tidigare arbete i vårt laboratorium har visat att dessa faktorer signifikant påverkar antitumöreffekten av T-BsAbs, med upp till 1000-faldiga skillnader i styrka6. Genom detta arbete identifierade vi IgG-[L]-scFv-formatet som den perfekta plattformen för T-BsAbs (se avsnittet Representativa resultat för mer information om T-BsAb-format) och har tillämpat denna plattform på mål inklusive GD2 (neuroblastom), HER2 (bröstcancer och osteosarkom), GPA33 (kolorektal cancer), STEAP1 (Ewing sarkom), CD19 (B-cellmaligniteter) och CD33 (B-cellmaligniteter)7, 8,9,10,11,12,13.

En av de stora utmaningarna för att framgångsrikt implementera T-BsAb-terapi i solida tumörer är att övervinna en immunsuppressiv tumörmikromiljö (TME) för att driva T-cellshandel till tumörer14. De faktorer som påverkar T-BsAb-effekten som beskrivs ovan har en signifikant inverkan på T-BsAbs förmåga att effektivt inducera T-cellhoming till tumörer, men denna effekt är svår att utvärdera i ett in vivo-system i realtid. Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av användningen av luciferastransducerade T-celler i prekliniska studier av T-BsAbs för att utvärdera T-cellshandel till olika vävnader i experimentella immunsupprimerade musmodeller under behandling. Det övergripande målet med denna metod är att tillhandahålla ett sätt att utvärdera T-cellinfiltration i tumörer och andra vävnader, samt realtidsinsikt i T-cellhoming-kinetik och uthållighet, utan att behöva offra djur under behandlingen. För det ökande antalet forskare som fokuserar på cellulära immunterapier är förmågan att spåra T-celler in vivo i prekliniska djurmodeller avgörande. Vi strävar efter att ge en grundlig och detaljerad beskrivning av den metod vi har använt för att spåra luciferastransducerade T-celler för att göra det möjligt för andra forskare att enkelt replikera denna teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande procedurer har utvärderats och godkänts av Memorial Sloan Ketterings Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Transfektion av 293T-celler med luciferas och skörd av viral supernatant

  1. Odling av 293T-celler
    1. Bered media genom att tillsätta följande till en liter DMEM vardera: 110 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 11 ml penicillin-streptomycin.
    2. Tina 5 x 106 293T celler och överför dem till en T175-kolv med det medium som beretts enligt beskrivningen ovan.
    3. Dela 293T-cellerna 1:10 var 3: e dag i 6 dagar. Låt inte cellerna bli mer än 90% sammanflytande.
  2. Transfektion av 293T-celler
    Anmärkning: Följande mängder reagens beräknas för transfektering av en T175-kolv med 293T-celler. Justera därefter om fler kolvar ska transduceras.
    1. Överför 1,5 ml media till vart och ett av de två 50 ml rören med en pipett. Tillsätt 10 μg VSV-G-plasmid, 20 μg Gag/pol och 20 μg klickbaggeröd TD-tomat (CBR-TDR) luciferasplasmid till ett rör och blanda. Tillsätt 100 μl DNA in vitro-transfektionsreagens till det andra röret och blanda. Inkubera båda rören vid rumstemperatur (RT) i 5 minuter.
      NOTERA: Alla plasmider som beskrivs i detta manuskript tillhandahölls av Dr. Vladimir Ponomarev.
    2. Överför droppvis mediet som innehåller DNA-transfektionsreagenset in vitro till röret som innehåller DNA-plasmiderna (över ca 30 s) och blanda försiktigt med en pipett. Inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
    3. Under denna 20 minuters inkubation, lossa 293T-cellerna genom att tillsätta 5-10 ml 0,05% trypsin. När cellerna har lossnat, tillsätt 10 ml media och centrifugera vid 800 x g i 5 minuter. Resuspendera cellerna i 1,5 ml media.
    4. Tillsätt media som innehåller DNA-transfektionsreagenset in vitro och DNA-plasmiderna till 293T-cellerna och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
    5. Överför till en T175-kolv och tillsätt 18 ml media. Inkubera vid 37 °C över natten.
    6. Nästa dag, sug försiktigt media med en glaspipett utan att lossa cellerna. Byt ut med 18 ml färskt media. Inkubera vid 37 °C över natten i en inkubator.
  3. Skörda viral supernatant
    1. Ta bort den virala supernatanten med en pipett på is. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter för att pellet cellerna och skräpet.
      OBS: Om cellpelleten är stor stördes cellerna sannolikt från kolven när supernatanten avlägsnades. Dessa celler kan pläteras igen i en ny kolv med färskt medium.
    2. Filtrera virussupernatanten med ett 0,22 μm-filter.
    3. Använd viral supernatant omedelbart. Förvara den på is eller vid 4 °C i upp till 24 timmar, eller frys den vid -80 °C för långtidsförvaring.

2. Expansion och transduktion av aktiverade humana T-celler med luciferas

  1. Aktivering av humana T-celler in vitro
    1. Tvätta pärlorna genom att tillsätta 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,1% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till ett sterilt 15 ml rör, tillsätt pärlor (en pärla per två T-celler), placera i ett magnetställ i 2 minuter och sug ut PBS.
    2. Bered media enligt beskrivningen i steg 1.1.1, tillsätt sedan IL-2 till en slutlig koncentration på 30 IE/ml och tillsätt de tvättade pärlorna. Gör 2,5 ml media för varje två miljoner T-celler som ska aktiveras.
    3. Räkna T-cellerna (nyrenade eller tidigare renade, frysta, tinade och tvättade) med en hemocytometer och trypanblå fläck. Tillsätt T-celler till mediet som beretts i steg 2.1.2 och vänd försiktigt röret för att blanda. T-cellerna kommer att expandera minst 20x beroende på cellernas källa och allmänna hälsa. Bestäm antalet T-celler som ska aktiveras genom att beräkna antalet som behövs för att behandla mössen och dela med 20. Här användes 20 x 106 T-celler per mus baserat på preliminära experiment.
    4. Platta 2,5 ml media innehållande två miljoner T-celler, pärlor och IL-2 i varje brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta. Kultur vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-inkubator .
    5. Undersök T-cellerna under ett 20x mikroskop varje dag under de kommande 3 dagarna för att avgöra när man ska transducera med luciferas. Cellerna är redo när de klumpar ihop sig och tömmer mediet och förvandlar det från rött / rosa till ljusorange.
  2. Framställning av retronektinplattor
    OBS: Retronectin används för att belägga plattorna som används i transduktionen eftersom det förbättrar gentransduktion15.
    1. Tillsätt 2 ml 20 μg/ml retronektin i PBS till en brunn på en obehandlad 6-brunnsplatta. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur eller 1 timme vid 37 °C. En retronektinbelagd brunn krävs för varje två miljoner T-celler som ska transduceras.
    2. Aspirera retronektinet utan att repa botten av plattan.
    3. Tillsätt 3 ml 2% BSA i PBS (sterilfiltrerad) per brunn i 6-brunnsplattan. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
  3. Spinokulation
    1. Aspirera BSA utan att repa botten av plattan.
    2. Tvätta brunnarna en gång med 3 ml PBS per brunn. Fortsätt eller ersätt med färsk PBS och låt plattan vara täckt vid 4 °C över natten.
    3. Tillsätt 2 ml CBR-TDR-luciferasvirussupernatant (uppsamlat i steg 1.3) per brunn.
    4. Centrifugera vid 1,240 x g i 90 min vid 32 °C.
  4. Transduktion
    1. Räkna T-cellerna.
    2. Aspirera den virala supernatanten utan att repa botten av plattan.
    3. Platta två miljoner T-celler per brunn i 6 ml av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) innehållande 30 IE / ml human IL-2.
    4. Undersök T-cellerna dagligen. T-cellerna är redo att expanderas när de är nästan sammanflytande, vanligtvis efter 2 dagar.
    5. När cellerna är nästan sammanflytande, tvätta dem försiktigt från botten av plattan med en pipett och överför varje brunn till en separat T75-kolv. Tillsätt 9 ml media för totalt 15 ml media per kolv.
    6. Nästa dag, lägg till ytterligare 15 ml media. Cellerna ska vara redo att injiceras i möss dagen efter denna tillsats av media. Bekräfta framgångsrik transduktion genom att utföra flödescytometri (luciferaskonstruktionen innehåller en TD-tomatfluorofor som är synlig i PE-kanalen)16.

3. Engraftment av luciferastransducerade T-celler i immunsupprimerade möss

  1. Bered och räkna T-cellerna för injektion.
    1. Ta bort T-cellerna från kolvarna och räkna. Cellerna är redo att injicera när de har expanderat 20x-30x, vanligtvis vid dag 7 efter aktivering.
    2. Centrifugera T-cellerna vid 800 x g i 5 minuter. Resuspendera i 2 ml media och ta bort pärlorna med ett magnetställ.
    3. För experiment där T-celler injiceras separat från bispecifika antikroppar, räkna T-cellerna och resuspendera så att den slutliga koncentrationen är 20 miljoner T-celler per 100 μL media. Gå vidare till steg 3.2. För experiment med ex vivo-beväpnade T-celler (EAT), gå vidare till steg 3.1.4.
    4. För experiment med ex vivo-beväpnade T-celler, räkna T-cellerna och separera dem i individuella 1,5 ml rör för varje grupp, med 20 miljoner celler per mus. Till exempel, om det finns tre grupper om fem möss vardera, förbered tre 1,5 ml rör med 100 miljoner T-celler vardera.
    5. Centrifugera 1,5 ml rören vid 800 x g i 5 minuter. Ta bort mediet försiktigt utan att störa T-cellpelleten. Resuspendera i högst 50 μl medium som innehåller de bispecifika antikropparna. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
      OBS: För experiment som utförts i denna studie användes proprietära IgG-[L]-scFv T-cellengagerande bispecifika antikroppar genererade i laboratoriet. För T-cellsarmering, använd 5 μg antikropp per 20 x 106 T-celler. Kommersiellt tillgängliga bispecifika antikroppar kan också användas.
    6. Tvätta bort överflödiga antikroppar genom att tillsätta 1 450 μl media till varje rör. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter, aspirera försiktigt mediet och resuspendera vid en koncentration av 20 miljoner beväpnade T-celler per 100 μl media.
  2. Injektion och engraftment i möss
    1. Bedöva mössen i en kammare som tillför 3,5% (v/v) inhalerat isofluran i 1 l/min syre. Mössen är helt sövda när bakbenspedalens abstinensreflex har försvunnit.
      OBS: Ge termiskt stöd under hela proceduren.
    2. Använd en 26 G nål och injicera 20 miljoner T-celler i 100 μl media retroorbitalt per mus.
    3. Administrera 1 000 U rekombinant IL-2 subkutant för att stödja T-cellöverlevnad in vivo.
    4. Administrera de bispecifika antikropparna retroorbitalt (i ögat som inte används för T-cellsinjektion) eller intraperitonealt. Låt mössen återhämta sig från anestesi och återvända till sina burar.
      OBS: Återigen, här användes proprietära antikroppar som genererades i labbet, men kommersiellt tillgängliga antikroppar kunde användas istället. I experimenten här administrerades 0,3-10 μg antikropp per mus per dos. Antikropparna administrerades två gånger per vecka i 3-4 veckor.

4. In vivo-avbildning av möss transplanterade med luciferastransducerade T-celler

OBS: Detta steg ska utföras på avbildningsdagen, vilket inte nödvändigtvis är samma dag som T-cellerna och / eller antikropparna administreras till mössen. Vanligtvis utför vi avbildning 24 timmar efter administrering av luciferastransducerade T-celler.

  1. Beredning av D-luciferin
    1. Lös 1 g D-luciferin i 33,3 ml steril PBS (slutkoncentration: 30 mg/ml).
    2. Alikvot det upplösta D-luciferinet i 33 x 1,5 ml mikrocentrifugrör och håll rören vid -20 °C.
    3. På avbildningsdagen ska det tina upp tillräckligt många alikvoter på 30 mg/ml D-luciferin för att antalet djur ska avbildas. Ett rör räcker för 10 djur.
      OBS: Återfrys återstående D-luciferin efter användning. D-luciferin är stabilt i minst fem frys-/upptiningscykler.
  2. Administrering av D-luciferin till möss
    OBS: Innan du administrerar D-luciferin till mössen, öppna bildhanteringsprogrammet och initiera systemet. Kameran kan ta flera minuter att svalna, och detta bör göras innan mössen injiceras med D-luciferin för att säkerställa att avbildning kan ske 5 minuter efter administrering av substratet.
    1. Bedöva upp till fem möss i en kammare som levererar 3,5% (v/v) inhalerat isofluran i 1 l/min syre. Mössen är helt sövda när bakbenspedalens abstinensreflex har försvunnit.
    2. När mössen är helt bedövade, administrera 100 μl 30 mg/ml D-luciferin per mus (3 mg per mus) genom retroorbital injektion med en 26 G nål. Bild denna grupp av möss innan du administrerar D-luciferin till nästa grupp. Placera nästa grupp möss i isoflurankammaren som ska bedövas medan föregående grupp avbildas.
  3. Avbildning av luciferastransducerade T-celler
    1. Flytta de bedövade mössen till kamerans ljustäta kammare och fortsätt administrera 3 % isofluran vid 0,5 l/min. Placera mössen på sidorna så att flanken med xenograften är vänd uppåt mot kameran. Ta en annan uppsättning bilder med mössen i ryggläge för att utvärdera T-cellnärvaro i lungorna.
    2. Använd kontrollpanelen för förvärv och välj Självlysande, Fotografi och Överlägg. Ställ in exponeringstiden på auto, binning på medium och F / Stop på 1. Hämta bilder. Efter den första bilden ställer du in exponeringstiden så att den matchar den som beräknades automatiskt för den första bilden så att efterföljande bilder kan jämföras direkt. Det kan vara användbart att ta bilder med flera exponeringstider för att bestämma den optimala exponeringstiden för att uppnå den ljusaste signalen utan pixelmättnad.
    3. Ta bort mössen från isofluran, återgå till burarna och observera tills de är vakna och ambulerande.
    4. Upprepa stegen från steg 4.2.1 tills alla grupper har avbildats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrivs i steg 4.3 kan möss orienteras i olika positioner under avbildning för att utvärdera närvaron av T-celler i olika vävnader. Liggande positionering möjliggör bedömning av T-celler i lungorna, vilket är vanligt vid tidiga tidpunkter efter injektionen. Lateral positionering med det subkutana xenograft uppåt används för att bäst bedöma T-cellhandel till tumören. Kvinnliga C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac möss användes för alla experiment som beskrivs i detta manuskript. Figur 1 visar bilder från ett experiment där möss med GD2-positiva xenotransplantat behandlades med antingen luciferastransducerade T-celler beväpnade ex vivo med en GD2 BsAb eller luciferastransducerade T-celler och GD2 BsAb injicerade separat17. Figur 1A visar att beväpnade T-celler smugglade till tumören snabbare än obeväpnade T-celler (Figur 1B) och lämnade lungorna 2 dagar tidigare. Figur 1C visar kvantifieringen av detta fenomen. Figur 1E-G visar att det är möjligt att övervaka T-cellshandel i minst 28 dagar efter injektion av luciferastransducerade T-celler, vilket gör det möjligt för forskare att spåra T-cellhoming och persistens under hela behandlingen, till skillnad från andra tekniker som immunohistokemi (IHC) som endast tillåter en ögonblicksbild av T-cellinfiltration.

Utan förmågan att bedöma T-cellhandel in vivo kan forskare som testar T-BsAbs inte avgöra om T-celler infiltrerar och kvarstår i tumörer under behandlingen. Om en behandling misslyckas, utan att offra djur och utföra IHC, kan det vara svårt eller omöjligt att veta om misslyckandet berodde på brist på T-cellhandel, uthållighet, T-cellutmattning eller någon annan orsak. Figur 2A-C visar ett experiment där möss som bär bröstcancerpatient-härledda xenotransplantat behandlades med luciferastransducerade humana T-celler och HER2-riktade BsAbs med olika mutationer för att tysta Fc-funktioner 7. Figur 2C visar att behandling med HER2 BsAb med en oljudd Fc inte hade någon effekt på tumörtillväxt jämfört med en kontroll-BsAb, medan behandling med HER2 BsAbs innehållande en N297A-mutation ensam eller i kombination med en K322A-mutation helt kunde stoppa tumörtillväxten. Figur 2A och Figur 1B visar att i grupper med ljuddämpande mutationer nådde T-cellernas luminiscenssignal en högre topp dag 3 efter injektionen och kvarstod på en högre nivå jämfört med kontroll BsAb och oljudd HER2 BsAb. Uppföljningsexperiment visade att hos möss behandlade med T-celler och BsAbs med oljudda Fcs var T-cellerna i perivaskulära regioner i lungorna omgivna av murina neutrofiler och makrofager, vilket tyder på en Fc-beroende sekvestrering av de BsAb-bundna T-cellerna som förhindrar migration till tumören. Den pro-tumorigena effekten av tumörbosatta M2-polariserade makrofager har beskrivits väl. Figur 3A,B visar att hos möss som bär neuroblastom patient-derived xenografts (PDX) ökar utarmningen av Ly6c-positiva makrofager signifikant T-cellhoming till tumörer, vilket resulterar i minskad tumörtillväxt och förlängd överlevnad (Figur 3C)18. Denna effekt är ännu mer uttalad i osteosarkom PDX (figur 3D).

In vivo T-cellspårning gör det också möjligt för forskare att övervaka hur T-cellhandelskinetiken påverkas av andra variabler inom antikroppsteknik, inklusive strukturell konfiguration. Som beskrivits i inledningen av denna artikel underströk tidigare arbete i vårt laboratorium vikten av bivalens och cis-orientering av tumör- och T-cellbindande armar för in vivo-effekten av BsAbs. Figur 4 visar att bland en panel av BsAbs riktade mot tumörantigenet STEAP1 (Figur 4A) resulterade IgG-[L]-scFv-formatet i signifikant mer T-cellsinfiltration dag 6 efter den första dosen T-celler, som kvarstod under hela behandlingen (Figur 4C)10. Detta fenomen förutsågs inte genom cytotoxicitetsanalyser in vitro (figur 4B), vilket betonar vikten av att bekräfta in vitro-resultat i in vivo-modeller.

Figure 1
Figur 1: Beväpnade T-celler uppvisar snabbare tumörmålsökande kinetik än BsAb-riktade obeväpnade T-celler, som snabbt kringgår lungbindning. Luciferastransducerade T-celler expanderades och beväpnades med BsAb (Luc (+) GD2-EAT). Luc(+) GD2-EAT (10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-celler) eller Luc(+) obeväpnade T-celler (2 x 107 celler) med eller utan GD2-BsAb (10 μg) administrerades intravenöst till GD2-positiva PDX-bärande möss med neuroblastom när den genomsnittliga tumörvolymen nådde 100 mm3. (A) Bioluminiscensbilder av GD2-EATs handel med tumörer. (B) Bioluminiscensbilder av GD2 BsAb-riktad obeväpnad T-cellshandel med tumörer över dagar. (C) Kvantifiering av T-cellinfiltration i tumörer över tid mätt med bioluminiscens (n = 5 möss/grupp) uttryckt som totalt flöde eller strålning (fotoner/s) per pixel integrerad över tumörkonturen (ROI). (D) Tumörtillväxtkurvor hos enskilda möss behandlade med GD2-EAT, GD2-BsAb plus obeväpnade T-celler eller obeväpnade T-celler. För att testa persistensen in vivo hos antigenspecifika EAT:er administrerades Luc(+)GD2-EAT (beväpnade med 10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-celler) eller Luc(+) HER2-EATs (10 μg HER2-BsAb/2×107 T-celler) intravenöst till osteosarkom TEOS1C PDX-bärande möss. Ytterligare två doser av icke-luciferastransducerade GD2-EATs eller HER2-EATs administrerades dag 7 och dag 14. (E) Kvantifiering av bioluminiscens av Luc(+) EATs i tumörer efter behandling. (F) Tumörtillväxtkurvor hos enskilda möss behandlade med GD2-EAT, HER2-EAT eller obeväpnade T-celler, eller ingen behandling. (G) Bioluminiscensbilder av Luc(+), GD2-EATs (övre) eller Luc(+), HER2-EATs (lägre) i tumörer över tid. Bioluminiscens av Luc(+) EATs detekterades under 28 dagar efter injektionen. Förkortningar: EATS = ex vivo beväpnade T-celler; ROI = region av intresse. Felstaplar anger medelvärdets standardfel. Denna siffra har modifierats från Park et al.17. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: T-cellshandel med HER2-positiv human bröstcancer PDX hos DKO-möss. (A) Representativa bioluminiscensbilder av T-cellshandel. (B) Kvantifiering av T-cellhandel i tumörer över tid genom bioluminescens (n = 5 möss / grupp) uttryckt som totalt flöde eller strålning (fotoner / s) i varje pixel integrerad över hela tumörkonturen (ROI). (C) HER2-positiv bröstcancer PDX (M37) tillväxt (n = 5 möss/grupp) efter behandling med Ctrl BsAb, HER2 BsAb, och dess Fc-mutanter. Resultaten som visas är representativa resultat från minst tre oberoende experiment. De signifikanta skillnaderna beräknades baserat på arean under kurvan (AUC). Felstaplar anger medelvärdets standardfel. Denna siffra har modifierats från Wang et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Effekterna av monocytutarmning på BsAb-riktad T-cellshandel och in vivo-antitumörsvar . (A) Luciferastransducerade T-celler (Luc(+) T-celler) eller luciferastransducerade GD2-BsAb-beväpnade T-celler (Luc(+) GD2-EATs) administrerades med anti-Ly6C-antikroppar till mössen som bär ett neuroblastompatienthärlett xenograft (PDX). (B) Bioluminescens i tumörens lesioner övervakades. Bioluminiscensbilderna på dag 7 och kvantifiering av bioluminiscensen i tumörens lesioner. (C) In vivo antitumörsvar av GD2-EATs med anti-Ly6C-antikropp testades mot neuroblastom PDX. (D) In vivo antitumöreffekt av GD2-EAT med anti-Ly6C-antikropp testades mot osteosarkom PDX och långsiktig överlevnad analyserades. Felstaplar anger medelvärdets standardfel. Antitumöreffekten in vivo jämfördes med AUC- och överlevnadskurvanalyserna. Tumörinfiltrerande lymfocyter kvantifierades med användning av AUC för bioluminiscens. Skillnader mellan prover som anges i figuren testades för statistisk signifikans med hjälp av ett tvåsidigt Student's t-test för två uppsättningar data och envägs ANOVA med Tukeys post hoc-test för tre eller flera uppsättningar data. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Denna siffra har modifierats från Park et al.18. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Antitumöraktiviteter av anti-STEAP1 T-cellengagerande bispecifik antikropp. (A) Schematisk representation av de sex strukturella formaten för STEAP1 BsAb. (B) Antikroppsberoende T-cellmedierad cytotoxicitet (ADTC) test mot EFT-cellinjer (TC32 ad TC71) med användning av olika format av STEAP1 BsAb. Effektor till mål (ET) cellförhållande var 10: 1. (C) Bioluminiscensavbildning (BLI) av Luc(+) T-celler beväpnade med sex olika format av STEAP1 BsAb på (a) dag 6 och (b) dag 18 efterbehandling och kvantifiering av bioluminiscensintensitet i tumörens lesioner. Luciferastransducerade T-celler (Luc(+) T-celler) beväpnades med olika format av STEAP1 BsAb (10 μg STEAP1 BsAb/2 x 107 T-celler) och administrerades med kompletterande IL-2 (1 000 IE/dos) till mössen med EFT PDX (ES15a), och BLIföljde. Förkortningar: EFT = Ewing sarkomfamilj av tumörer; PDX = xenotransplantat av tumörer som härrör från patienter; STEAP = sextransmembranepitelialt prostataantigen. Felstaplar indikerar medelfel. Tumörinfiltrerande lymfocyter kvantifierades genom att beräkna arean under bioluminiscenskanskurvan. Skillnader mellan prover som anges i figuren testades för statistisk signifikans med hjälp av enkelriktad ANOVA med Tukeys post hoc-test. p < 0,0001. Denna siffra har modifierats från Lin et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan T-BsAb blinatumomab har godkänts för CD19-positiva hematologiska maligniteter, har den framgångsrika implementeringen av T-BsAbs i solida tumörer visat sig vara mycket svårare. Catumaxomab, en T-BsAb riktad mot epitelcelladhesionsmolekyl (EPCAM), godkändes för behandling av maligna ascites hos patienter med äggstockscancer, men produktionen av läkemedlet stoppades därefter av kommersiella skäl19. Inga andra T-BsAbs har godkänts för solida tumörer, vilket understryker de utmaningar som är förknippade med denna typ av terapi. Toxicitet på grund av cytokinfrisättningssyndrom (CRS) är ett vanligt problem, även om detta kan hanteras med steroider och cytokinhämmare. Förutom toxicitet är brist på effekt vanligt i prövningar av T-BsAbs för solida tumörer. Att inducera T-cellshandel och persistens i tumören har visat sig svårt, troligen på grund av olika immunsuppressiva faktorer i TME14. Men även prekliniskt är det ofta oklart varför en T-BsAb som presterar bra in vitro misslyckas med att effektivt behandla tumörer in vivo.

Metoden för att spåra T-celler in vivo i realtid som beskrivs i denna artikel är användbar för forskare av flera skäl. Övervakning av T-cellhoming ger mekanistisk inblick i varför vissa T-BsAbs lyckas eller misslyckas genom att låta forskare bestämma när T-cellhandel har börjat och hur länge T-cellerna har kvarstått i tumören under behandlingen. Metoden kan upprepas vid flera tidpunkter, vilket gör det möjligt för forskare att plotta kinetiken för T-cellhoming under flera veckor. (Representativa resultat i figur 1 visar att T-celler kvarstår i tumören i minst 28 dagar.) In vivo-avbildning av luciferastransducerade T-celler eliminerar också behovet av att offra djur under behandling för histologisk bedömning av T-cellsinfiltration, vilket minskar den totala kostnaden och antalet djur som behövs per experiment. Eftersom avbildningen kan upprepas så ofta som krävs, möjliggör det också en mycket enklare och grundligare utvärdering av T-cellhoming-kinetiken jämfört med histologisk analys, vilket i huvudsak är en ögonblicksbild av en enda tidpunkt om inte flera djur offras vid olika tidpunkter.

Det mest kritiska steget i denna metod är den framgångsrika transduktionen av T-celler med luciferaskonstruktionen. Misslyckad transduktion kan leda till T-celldöd eller brist på luciferassignal in vivo. Om T-celler inte expanderar som förväntat efter transduktionen kan det vara möjligt att minska virustitern med vilken de transduceras för att minska potentiell toxicitet från transduktionsprocessen. Ett annat tillvägagångssätt skulle vara att vänta ytterligare en dag mellan T-cellexpansionsstegen för att möjliggöra att T-cellerna blir mer sammanflytande innan de expanderas till ett större cellodlingskärl. Innan T-cellerna injiceras i mössen är det en bra idé att bekräfta transduktionsframgången med hjälp av flödescytometri (för att kontrollera TD-tomatreporterns uttryck) eller en bioluminescerande plattläsare. Om de transducerade T-cellerna fortfarande inte är synliga med bioluminescerande avbildning kan det vara möjligt att antalet T-celler är för lågt för detektion med denna teknik. Rabinovich et al. beskriver en liknande metod som använder förstärkt eldfluga luciferas för att detektera så få som 10 murina T-celler, som kan implementeras i situationer som kräver denna känslighetsnivå20.

Sammanfattningsvis ger in vivo-spårning av luciferastransducerade T-celler ett värdefullt verktyg för forskare som studerar T-BsAbs i immunsupprimerade musmodeller av cancer. Förutom de tillämpningar som diskuterats ovan har denna metod för T-cellspårning tillämpats på chimära antigenreceptor (CAR) T-celler och kan uppenbarligen tillämpas på syngena musmodeller som också använder adoptivt överförda T-celler21. Vi hoppas att denna strategi kommer att vara till hjälp för forskare som utvecklar translationella T-BsAbs och kommer att leda till en ökad framgång för dessa terapier hos patienter med solida tumörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

NKC rapporterar att de fått kommersiella forskningsanslag från Y-mAbs Therapeutics. NKC är uppfinnare och ägare av utfärdade patent licensierade av MSK till Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand och Abpro-labs. MSK och NKC har ekonomiska intressen i Y-mAbs. NKC rapporterar att de mottagit aktieoptioner från Eureka Therapeutics. HFG och MEC har inga relevanta upplysningar.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Vladimir Ponomarev för att dela luciferaskonstruktionerna som används i experimenten som beskrivs i det representativa resultatavsnittet i denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
  2. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
  3. Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
  4. Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
  5. Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
  6. Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
  7. Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
  8. Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
  9. Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
  10. Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
  11. Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
  12. Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
  13. Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
  14. Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
  15. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  16. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
  18. Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
  19. Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Tags

Cancerforskning bispecifika antikroppar T-cellsengagers luciferas T-celler xenotransplantat
Spårning av bispecifik antikroppsinducerad T-cellhandel med hjälp av Luciferas-transducerade humana T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter