Summary
Hier beschreiben wir einen Proteomik-Workflow zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms verschiedener Zelltypen. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Anreicherung von Proteinen auf der Zelloberfläche, die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse mit einer LC-MS/MS-Plattform und die Datenverarbeitung mit spezieller Software.
Abstract
In den letzten zehn Jahren hat die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik eine eingehende Charakterisierung biologischer Systeme in einer Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Das Zelloberflächenproteom ("Surfaceom") bei menschlichen Erkrankungen ist von großem Interesse, da Plasmamembranproteine das primäre Ziel der meisten klinisch zugelassenen Therapeutika sind und ein Schlüsselmerkmal für die diagnostische Unterscheidung von kranken Zellen von gesundem Gewebe sind. Die fokussierte Charakterisierung von Membran- und Oberflächenproteinen der Zelle ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Komplexität der zellulären Lysate, die Proteine von Interesse durch andere Proteine mit hoher Häufigkeit maskieren. Um diese technische Barriere zu überwinden und das Zelloberflächenproteom verschiedener Zelltypen mittels Massenspektrometrie-Proteomik genau zu definieren, ist es notwendig, das Zelllysat vor der Analyse auf dem Massenspektrometer um Zelloberflächenproteine anzureichern. In diesem Artikel wird ein detaillierter Arbeitsablauf für die Markierung von Zelloberflächenproteinen aus Krebszellen, die Anreicherung dieser Proteine aus dem Zelllysat und die anschließende Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse vorgestellt.
Introduction
Proteine dienen als grundlegende Einheiten, mit denen die meisten zellulären Funktionen ausgeführt werden. Die Charakterisierung der Struktur und Funktion relevanter Proteine ist ein wesentlicher Schritt, um biologische Prozesse zu verstehen. In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte in der Massenspektrometrie-Technologie, Analysesoftware und Datenbanken den genauen Nachweis und die Messung von Proteinen auf einer proteomweitenSkala ermöglicht 1. Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik kann in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, von der grundlagenwissenschaftlichen Analyse biochemischer Signalwege über die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele in einem translationalen Umfeld bis hin zur Diagnose und Überwachung von Krankheiten in der Klinik2. Beim Screening nach neuen Wirkstoffzielen ist die Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms besonders wichtig, da über 65 % der derzeit zugelassenen humanen Medikamente auf Zelloberflächenproteine abzielen3. Auch die Krebsimmuntherapie stützt sich vollständig auf krebsspezifische Zelloberflächenantigene, um Tumorzellen gezielt zu eliminieren4. Die massenspektrometrische Proteomik kann daher als vielversprechendes Werkzeug dienen, um neue Zelloberflächenproteine für therapeutische Interventionen zu identifizieren.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung herkömmlicher Proteomik-Methoden, um Tumorzellen auf neuartige Zelloberflächenproteinziele zu untersuchen. Ein Hauptproblem ist, dass Oberflächenproteine nur einen sehr kleinen Teil der gesamten Proteinmoleküle in einer Zelle ausmachen. Daher werden Fragmente dieser Proteine bei der massenspektrometrischen Analyse des Ganzzelllysats durch eine hohe Häufigkeit intrazellulärer Proteine maskiert5. Diese Einschränkung macht es schwierig, das Proteom der Zelloberfläche mit einem herkömmlichen Proteomik-Workflow genau zu charakterisieren. Um dieser Herausforderung zu begegnen, ist es notwendig, Wege zu entwickeln, um Zelloberflächenproteine aus dem Ganzzelllysat anzureichern, bevor sie auf dem Massenspektrometer analysiert werden. Eine dieser Methoden umfasst die Oxidation und Biotinmarkierung von glykosylierten Zelloberflächenproteinen in den intakten Zellen und die anschließende Anreicherung dieser biotinylierten Proteine aus dem Lysat mit einem Neutravidin-Pulldown, ein Prozess, der als "Zelloberflächeneinfang" bezeichnet wird6. Da ~85% der Oberflächenproteine von Säugetierzellen als glykosyliert angesehen werden7, dient dies als effektive Methode zur Anreicherung des Zelloberflächenproteoms aus dem gesamten Zelllysat. Dieser Artikel beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf, beginnend mit kultivierten Zellen, der Biotinmarkierung auf der Zelloberfläche und der anschließenden Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse (Abbildung 1). Über mehrere Replikate hinweg bietet diese Methode eine robuste Abdeckung des Zelloberflächenproteoms einer bestimmten Probe. Die Verwendung dieser Methode zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms sowohl von Tumorzellen als auch von gesunden Zellen kann die Entdeckung neuartiger Zelloberflächenantigene erleichtern, um potenzielle immuntherapeutische Ziele zu identifizieren8.
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Protocol
HINWEIS: AMO1-Plasmozytomzellen wurden für dieses Zelloberflächen-Proteom-Experiment verwendet. Das gleiche Protokoll könnte auch für andere Zelltypen verwendet werden, einschließlich einer breiten Palette von Suspensions- und adhärenten Zelllinien9 sowie verschiedener Arten von Primärproben10. Allerdings müssen die Zellzahlen (Ausgangsmaterial für das Experiment) in der Regel für eine äquivalente Proteomabdeckung optimiert werden. Ausführliche Informationen zu Materialien und Betriebsmitteln finden Sie in der Materialtabelle. Einzelheiten zu Puffern und Reagenzienlösungen und deren Zusammensetzung finden Sie in Tabelle 1.
1. Markierung der Zelloberfläche mit Biotin
- Zählen Sie die kultivierten Zellen und das Pellet durch Zentrifugation (5 min bei 500 × g, 24 °C) ca. 3,5 × 107 lebende Zellen.
HINWEIS: Die AMO1-Plasmozytomzellen wurden vor der Entnahme alle 3 Tage mit frischem Medium behandelt. - Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie 1 ml kalte (4 °C) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) von Dulbecco (kein Kalzium, kein Magnesium) hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren.
- Pelletieren Sie die Zellen erneut (wie in Schritt 1.1) und wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 1.2) noch einmal (insgesamt zwei Wäschen).
- Nach dem zweiten Waschen werden die Zellen pelletiert (wie in Schritt 1.1) und durch leichtes Pipettieren in 990 μl kaltem D-PBS resuspendiert.
- Bereiten Sie zuvor eine Stammlösung von 160 mM Natriummetaperiodat (NaIO4) vor. In 50 μL Aliquots aufspalten und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern. In Schritt 1.4 werden 10 μl 160 mM Natriummetaperiodatlösung in die Zellsuspension gegeben, gründlich gemischt und 20 min bei 4 °C auf einem End-to-End-Rotor inkubiert.
- Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, pelletieren Sie die Zellen (wie in Schritt 1.1), dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie sie in 1 ml kaltem D-PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal (insgesamt drei Wäschen). Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 989 μl D-PBS.
- Bereiten Sie zuvor eine Stammlösung von 100 mM Biocytinhydrazid vor. In 50 μl Aliquots aufteilen und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. In Schritt 1.6 werden 1 μl Anilin und 10 μl 100 mM Biocytinhydrazid in die Zellsuspension gegeben, gründlich gemischt und auf einem durchgehenden Rotor 60 min bei 4 °C inkubiert.
- Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, pelletieren Sie die Zellen (wie in Schritt 1.1), dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie sie in 1 ml kaltem D-PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).
- Nach dem dritten Waschgang wird der Überstand vorsichtig mit einer Pipette angesaugt und das Zellpellet durch Einlegen des Röhrchens in die Flüssigkeit N2 eingefroren. Legen Sie das gefrorene Pellet bei -80 °C, bis es bereit ist, mit der Lyse und dem Pulldown fortzufahren.
2. Zelllyse und Biotin-Pulldown
- Tauen Sie das gefrorene Zellpellet auf Eis auf.
- 500 μl 2x Lysepuffer zum Pellet geben, gründlich mischen und 30 s lang wirbeln.
Anmerkungen: Kräftiges Pipettieren und Vortexen kann erforderlich sein, um das Pellet vollständig zu lysieren. Einige unlösliche Ablagerungen (z. B. DNA) sind akzeptabel, da sie im nachfolgenden Beschallungsschritt entfernt werden. - Beschallen Sie das Zelllysat auf Eis (drei Bursts, je 20 s, 60 % Einschaltdauer).
- Zentrifugieren Sie das Lysat, um den verbleibenden Schmutz zu pelletieren (10 min bei 17.200 × g bei 4 °C).
- Während das Lysat zentrifugiert, geben Sie 100 μl Neutravidin-Agaroseharzkügelchen in eine Filtrationskolonne. Befestigen Sie die Säule an einem Vakuumverteiler, wenden Sie ein sanftes Vakuum an und waschen Sie die Perlen, indem Sie 3 ml Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.
- Entfernen Sie die Filtrationssäule aus dem Vakuumverteiler, verschließen Sie den Boden und geben Sie das geklärte Zelllysat in die Säule mit den Kügelchen. Verschließen Sie die Oberseite der Säule und inkubieren Sie das Lysat mit den Kügelchen auf einem End-to-End-Rotor für 120 min bei 4 °C.
Anmerkungen: Wenn Sie die Oberseite der Säule verschließen, halten Sie die untere Kappe fest an Ort und Stelle, da sie sich sonst lösen und das Zelllysat während der Inkubation austreten kann. - Bereiten Sie die Waschpuffer 1, 2 und 3 vor (ca. 5 ml jedes Waschpuffers pro Probe, siehe Tabelle 1) und legen Sie sie in ein 42 °C warmes Wasserbad
- Nachdem das Lysat die Inkubation beendet hat, setzen Sie die Filtrationssäule wieder auf den Vakuumverteiler, legen Sie ein leichtes Vakuum an und waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 5 ml Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.
Anmerkungen: Mehr als 5 ml der Waschpuffer können zum Waschen verwendet werden; Zusätzliches Waschen kann die unspezifische Bindung an die Perlen im Hintergrund verringern. - Wiederholen Sie den Waschschritt mit 5 ml Waschpuffer 2.
- Wiederholen Sie den Waschschritt mit 5 ml Waschpuffer 3.
- Sobald der letzte Waschpuffer vollständig durch die Raupen geflossen ist, entfernen Sie die Säule aus dem Verteiler. Geben Sie 100 μl "Lyse"-Lösung zu den Kügelchen und überführen Sie sie mit einer Pipette in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Drehen Sie das Röhrchen kurz, um die Perlen abzusetzen, und entfernen Sie 50 μl der Lösung, ohne die abgesetzten Perlen zu stören.
HINWEIS: Für die Reagenzien in diesem Schritt und allen nachfolgenden Schritten wird ein handelsübliches Proteomik-Probenvorbereitungskit verwendet. Das Kit bietet einen optimierten, vereinfachten Arbeitsablauf bei der Probenvorbereitung. Diese Schritte können jedoch auch unabhängig vom Kit durchgeführt werden, indem ein herkömmlicher Proteomik-Workflow verwendet wird, wie in Verma et al.9 beschrieben. Wenn die Perlen an der Seite oder am Boden der Säule kleben bleiben, lassen Sie die Perlen, die in das Röhrchen übertragen wurden, absetzen, und verwenden Sie eine zusätzliche "Lyse"-Lösung im Röhrchen, um die restlichen Perlen zu übertragen. - Legen Sie das Röhrchen bei 65 °C auf einen Heizblock/Shaker und schütteln Sie es 10 Minuten lang bei 1.000 U/min.
HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Reduktion und Alkylierung von Cysteinresten vor dem Aufschluss erforderlich.
3. Proteinverdauung
- Das getrocknete Trypsin ("Digest"-Röhrchen im Kit, gelagert bei -20 °C) wird durch Zugabe von 210 μl der "Resuspend"-Lösung resuspendiert. Pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass das gesamte getrocknete Trypsin resuspendiert ist.
- Nach Abschluss der Inkubation werden 50 μl der resuspendierten Trypsinlösung zu den Beads gegeben. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C und schütteln Sie es mindestens 90 Minuten lang bei 500 U/min, um das Protein zu verdauen.
- Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, wird die Lösung, die die Kügelchen enthält, in eine Spin-Säule überführt und die Säule in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung eingeführt. Schleudern Sie das Röhrchen (500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur [RT]), um die verdaute Peptidlösung von den Kügelchen zu trennen.
HINWEIS: In diesem Stadium kann eine PNGase-Behandlung an den Beads durchgeführt werden, sobald sie von der Peptidlösung getrennt wurden, um biotinylierte Peptidfragmente aus den Streptavidin-Beads zu eluieren. Diese Peptidprobe kann dann für den Rest des Arbeitsablaufs als separate, sekundäre Peptidprobe weitergeführt werden, die analysiert und mit der primären Probe aus der On-Bead-Trypsinisierung verglichen werden kann. Der PNGase-Ansatz wird wahrscheinlich komplementäre Daten zur On-Bead-Trypsinisierung liefern, da die zusätzliche Spezifität für eingefangene N-glykosylierte Asparagine auf der Grundlage einer MS-nachweisbaren Seitenkettenmodifikation besteht12. Der Nachteil dieses sequentiellen Elutionsansatzes ist jedoch, dass die Zeit des Massenspektrometers pro Probenanalyse doppelt so lang sein muss. - Fügen Sie 100 μl der "Stop"-Lösung hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen und die Peptidlösung anzusäuern.
4. Peptid-Entsalzung
- Platzieren Sie eine Entsalzungssäule mit einem Röhrchenadapter in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Geben Sie die gesamte angesäuerte Peptidlösung in die Säule. Schleudern Sie die Säule (3.800 × g für 3 Minuten), so dass die Lösung durch die Säule fließt. Die Peptide sind nun an die Säule gebunden; Verwerfen Sie den Durchfluss.
- 200 μl "Wash 1"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Verwerfen Sie den Durchfluss.
- 200 μl "Wash 2"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Übertragen Sie die Säule in ein neues, beschriftetes 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. 100 μl "Elute"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Weitere 100 μl "Elute"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Die Peptide werden nun von der Säule in das Röhrchen eluiert.
- Geben Sie die Peptidlösung in eine Vakuumzentrifuge und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Legen Sie die getrockneten Peptide bis zur Quantifizierung bei -80 °C und analysieren Sie sie auf dem Massenspektrometer.
5. Peptidresuspension und Quantifizierung
- Die getrockneten Peptide werden in 20 μl Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure, 2 % Acetonitril) resuspendiert.
- Zentrifugieren Sie die resuspendierten Peptide (17.200 × g für 10 Minuten), um unlösliche Ablagerungen zu pelletieren.
- Bereiten Sie Peptidstandards für den kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassay vor.
- Geben Sie 5 μl 1.000 mg/ml Peptid-Stammlösung in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Führen Sie eine siebenstufige serielle Verdünnung in der Platte mit deionisiertem Wasser (DI) wie folgt mit 5 μl jedes Standards pro Vertiefung durch: 1.000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml und 15,625 mg/ml. Geben Sie 5 μl DI-Wasser in eine achte Vertiefung für den Rohling.
- Geben Sie 4 μl DI-Wasser in drei separate Vertiefungen der 96-Well-Platte. Geben Sie 1 μl der resuspendierten Peptidlösung in jede Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 5 μl zu erhalten.
Anmerkungen: Wenn Sie die Peptidlösung zur Quantifizierung pipettieren, pipetieren Sie vorsichtig von der Oberseite der Lösung, um zu vermeiden, dass sich abgesetzte Ablagerungen stören. - Berechnen Sie, wie viel Arbeitsreagenz benötigt wird (45 μl pro Welle). Bereiten Sie das erforderliche Volumen des kolorimetrischen Assay-Arbeitsreagenzes vor. Wirbeln Sie das Arbeitsreagenz, um eine ordnungsgemäße Vermischung der Komponenten zu gewährleisten.
- Geben Sie 45 μl des Arbeitsreagenzes in jede der Standard- und Probenvertiefungen.
HINWEIS: Erstellen Sie die Standards in zweifacher Ausführung und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um einen minimalen Unterschied im Zeitpunkt der Zugabe des Reagenzes zu den Vertiefungen zu gewährleisten. - Die Platte mit Alufolie abdecken und bei 37 °C 15 min inkubieren.
- Analysieren Sie die Platte mit einem automatischen Plattenlesegerät. Verwenden Sie die für die Standardproben aufgezeichneten Absorptionswerte, um eine lineare Standardkurve zu erstellen. Bestimmen Sie die Gleichung aus Standardkurve undR2-Wert . Wenn derR2-Wert angemessen ist (≥0,95), verwenden Sie die Standardkurve, um die Konzentration der resuspendierten Peptide zu bestimmen, wobei die fünffache Verdünnung in der kolorimetrischen Assay-Platte berücksichtigt wird.
6. Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analyse der verdauten Peptide
- Stellen Sie die Konzentration der Peptidproben durch Zugabe von Lösungsmittel A auf 0,2 μg/μl ein und überführen Sie 10 μl in ein 0,6 mL proteinarmes Röhrchen.
- Legen Sie das Röhrchen in den LC-Autosampler.
- Stellen Sie die LC- und MS/MS-Parameter gemäß Abbildung 2 und Abbildung 3 ein.
- Injizieren Sie 5 μl (1 μg) der Peptidprobe zur Analyse in den LC-MS/MS-Aufbau.
HINWEIS: Die hier gezeigten LC-MS/MS-Einstellungen sind nur repräsentativ für die Abbildungen. Abhängig von der Verfügbarkeit des LC- und MS-Geräts können Benutzer die Einstellungen für den LC-Gradienten und die MS/MS-Parameter ändern, um eine tiefe Proteomabdeckung zu erhalten. Für diese Arbeit wurde die MS-Datenanalyse mit MaxQuant https://www.maxquant.org/, die sekundäre Datenanalyse mit Perseus https://maxquant.net/perseus/ und die Pathway-Analyse mit https://reactome.org/ durchgeführt.
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Representative Results
Für dieses Experiment charakterisierten wir das Zelloberflächenproteom einer Tumorzelllinie, indem wir N-glykosylierte Membranproteine intakter Zellen mit Biotin markierten und diese markierten Proteine aus dem gesamten Zelllysat mit einem Neutravidin-Pulldown anreicherten (Abbildung 1). Des Weiteren führten wir eine Proteomanalyse mittels LC-MS/MS durch, um angereicherte Zelloberflächenproteine zu charakterisieren. Anders als bei der Ganzzell-Proteomanalyse ging es hier darum, nur Zelloberflächenproteine zu charakterisieren. Daher begannen wir mit einer Stichprobe von 3,5 × 107 AMO-1 Plasmozytomzellen. Wir erhielten eine endgültige Peptidkonzentration von ~630 ng/μl basierend auf dem kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassay, und die Gesamtausbeute betrug ~12,6 μg Peptide (in 20 μL) (Abbildung 2A). Anschließend injizierten wir 1 μg Peptidprobe in das LC-MS/MS-System und wiederholten die Injektion dreimal für technische Wiederholungen. Die verwendeten LC- und MS-Parameter wurden auf der Grundlage früherer Experimente optimiert (Abbildung 2C und Abbildung 3A). Wir haben einen langen LC-Gradienten von 4 h verwendet, um eine maximale Abdeckung zu gewährleisten.
LC-MS/MS-Daten wurden mit MaxQuant analysiert; Wir konnten 2.221 Proteine mit mindestens einem einzigartigen Peptid und 1.764 Proteine mit mindestens zwei einzigartigen Peptiden in allen drei Replikaten identifizieren. Insgesamt wurden 12.307 einzigartige Peptide identifiziert. Wir haben die Anreicherung von Zelloberflächenproteinen in der Probe mit Hilfe eines Python-Skripts bestimmt (das genaue Skript, das wir verwendet haben, finden Sie in der ergänzenden Abbildung S1), das die von MaxQuant erhaltenen Ergebnisse mit mehreren etablierten Datensätzen von Zelloberflächenproteinen vergleicht. Zu diesen Datensätzen gehören das zuvor beschriebene "in silico surfaceome"3 und ein Datensatz, der aus Proteinen erstellt wurde, die in UniProt13 als membranlokalisiert annotiert wurden (Datensätze sind in der ergänzenden Tabelle S1 verfügbar). Diese Analyse ergab 601 Oberflächenproteine in unserer Stichprobe (ca. 27 % aller identifizierten Proteine) (Abbildung 4A). Es wurde eine Gene Ontology Annotation (http://geneontology.org/) durchgeführt, die darauf hinwies, dass etwa 30% der Proteine kanonisch auf der Plasmamembran lokalisiert sind. Die Analyse des Reaktom-Signalwegs (https://reactome.org/) deutete ebenfalls auf eine relative Anreicherung der Membranproteine hin, die am Transmembrantransport und an den Interaktionen auf der Zelloberfläche beteiligt sind (Abbildung 5 und ergänzende Tabelle S2).
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Markierung der Zelloberfläche und die anschließende Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse. Zunächst werden Proteine an der Oberfläche der gewünschten Zellprobe mit Biotin markiert. Diese Zellen werden dann lysiert und anschließend mit Neutravidin-Kügelchen inkubiert, die Biotin-markierte Proteine binden. Die Kügelchen werden dann wiederholt gewaschen, um intrazelluläre Proteine und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die Proteinprobe wird dann unter Zugabe von Trypsin einem On-Bead-Aufschluss unterzogen. Die resultierende Probe von Peptidfragmenten wird dann entsalzt, um Verunreinigungen aus den Wasch- und Aufschlussschritten zu entfernen. Die endgültige Peptidprobe wird dann getrocknet und kann einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Standardkurve für die kolorimetrische Peptidquantifizierung und LC-Gradient. (A) Acht-Punkt-Standardkurve, die durch einen kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassay zur Bestimmung der Peptidkonzentration in verarbeiteten Proben generiert wurde. (B) Eine Illustration des LC-MS/MS-Systems, das zur Verarbeitung von Proben verwendet wird. (C) Flüssigkeitschromatographie-Gradient und Flussrate, die für die Injektion von Proben in das Massenspektrometer verwendet werden. Abkürzungen: LC-MS/MS = Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Massenspektrometrie-Parameter und repräsentatives Chromatogramm . (A) Parameter, die für dieses Experiment mit einem Orbitrap-Massenspektrometer verwendet wurden. (B) Repräsentatives Chromatogramm, das durch massenspektrometrische Analyse nach dem Protokoll "Cell Surface Capture" für einen 4-Stunden-Gradienten erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Analyse der Proteinanreicherung auf der Zelloberfläche und Vergleich von technischen Replikaten. Zu diesen Datensätzen gehören das zuvor beschriebene "in silico surfaceome"3 und ein Datensatz, der aus Proteinen hergestellt wurde, die in UniProt13 als membranlokalisiert annotiert wurden. (A) Die Anzahl der Proteine und Peptide, die nach dem Entfernen von Verunreinigungen, umgekehrten Proteinen und einem q-Wert > 0,05 mit einem anderen Grenzwert identifiziert wurden. (B) Das Diagramm stellt die Verteilung des identifizierten Proteins und des Andromeda-Scores14 dar. (C) Das Streudiagramm veranschaulicht die Korrelation zwischen den Stichproben. Die Rangkorrelation von Spearman misst die Stärke und Richtung der Assoziation zwischen zwei Rangvariablen. (D) Boxplots, die die Variation von Lauf zu Lauf darstellen. (E) Stichprobenweises Verteilungsdiagramm, das die Datenqualität von Replikaten darstellt. Abkürzung: LFQ = markierungsfreie Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Analyse der Signalwege. Die Signalweganalyse wurde mit Reactome Version 8222 durchgeführt. Eine anschauliche Darstellung der Interaktionen der Zelloberfläche an der Gefäßwand, die die Anreicherung des Zelloberflächenproteoms für Schlüsselinteraktionen zeigt, die an der Interaktion von Thrombozyten und Leukozyten mit dem Endothel beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name des Reagenzes | Zusammensetzung | Lagerung | |||||
| 100 mM Biocytinhydrazid | Biocytinhydrazid in Pulverform in DMSO gelöst | In 50 μL Aliquots aufspalten und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern. | |||||
| 160 mM Natriummetaperiodat (NaIO4) | festes NaIO4 in DI-Wasser gelöst | In 50 μL Aliquots aufspalten und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern. | |||||
| 2x RIPA-Lysepuffer | 2x RIPA-Lysepuffer, 1,25 mM EDTA, Einweg-Protease-Inhibitor-Cocktail | Bereiten Sie es jedes Mal frisch zu, bevor Sie 10x RIPA-Lysepuffer verwenden. | |||||
| Peptid-kolorimetrisches Assay-Arbeitsreagenz | 50 % Reagenz A, 48 % Reagenz B, 2 % Reagenz C | Vor Gebrauch jedes Mal frisch zubereiten. Komponenten bei 4 °C lagern. | |||||
| Lösungsmittel A | 0,1 % Ameisensäure, 2 % Acetonitril | Kann im Voraus zubereitet und bei Raumtemperatur gelagert werden | |||||
| Waschpuffer 1 | 1x RIPA-Lysepuffer, 1 mM EDTA | Kann große Chargen vorher zubereiten und bei Raumtemperatur lagern | |||||
| Waschpuffer 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Kann große Chargen vorher zubereiten und bei Raumtemperatur lagern | |||||
| Waschpuffer 3 | 2 M Harnstoff, 50 mM Ammoniumbicarbonat | Bereiten Sie es jedes Mal frisch zu, da Harnstoff mit der Zeit schnell abgebaut wird. | |||||
Tabelle 1: Puffer und Reagenzienlösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
Ergänzende Abbildung S1: Python-Skript zum Vergleich der von MaxQuant erhaltenen Ergebnisse mit mehreren etablierten Datensätzen von Zelloberflächenproteinen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S1: Datensätze von Zelloberflächenproteinen. Zu diesen Datensätzen gehören das zuvor beschriebene "in silico surfaceome"3 und ein Datensatz, der aus Proteinen hergestellt wurde, die in UniProt13 als membranlokalisiert annotiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S2: Hier werden die 10 relevantesten Pfade (sortiert nach p-Wert ) vorgestellt. Abkürzungen: FDR = False-Discovery-Rate; SLC = Träger gelöster Stoffe; TCR = T-Zell-Rezeptor. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die unvoreingenommene Charakterisierung von Tausenden unbekannter Proteine in einem bisher unmöglichen Maßstab ermöglicht hat. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Proteine zu identifizieren und zu quantifizieren sowie eine Reihe von Erkenntnissen über die Struktur- und Signalfähigkeiten von Zellen und Geweben zu gewinnen, indem wir die Vielfalt der in einer bestimmten Probe vorhandenen Proteine charakterisieren. Die Massenspektrometrie geht über die globale Proteinprofilierung in einer Probe hinaus und ermöglicht es uns, verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) an diesen Proteinen zu charakterisieren und einen noch tieferen Einblick in die Stadien der Signalwege und der Proteindynamik zu erhalten, die bei der Analyse auf DNA- oder RNA-Ebene nicht verfügbar sind1. Für die Entwicklung neuartiger Krebstherapeutika ermöglicht uns die massenspektrometrische Proteomik, das Proteinprofil von bösartigen Tumorzellen mit gesundem Gewebe zu vergleichen, um potenzielle Angriffspunkte für Medikamente zu identifizieren.
Das schnell wachsende Gebiet der Krebsimmuntherapie beruht auf Antigene, die auf der Oberfläche bösartiger Zellen exprimiert werden, um Tumore zu erkennen und selektiv zu zerstören. Da die Entwicklung neuartiger Krebsimmuntherapien durch den Mangel an einzigartigen krebsspezifischen Antigenen eingeschränkt ist, die in gesundem Gewebe fehlen, ist es von entscheidender Bedeutung, mehr neuartige Antigene zu identifizieren, die spezifisch für Tumorzellen sind15. Tumorspezifische Antigene müssen nicht unbedingt ganze Proteine sein, die nur in der Tumorzelle vorkommen, sondern können auch spezifische Proteinkonformationen oder PTMs sein, die in gesundem Gewebe fehlen16,17. Die proteomische Analyse von Zelloberflächenproteinen sowohl auf Tumor- als auch auf gesunden Zellen kann neue krebsspezifische Antigen-Targets liefern. Die Zelloberflächenproteomik erfordert die Anreicherung von Oberflächenproteinen aus dem Ganzzelllysat vor der massenspektrometrischen Analyse, um die Komplexität der Probe zu reduzieren und eine Ionenunterdrückung der gewünschten Membranproteine (oft geringe Häufigkeit) durch hochexprimierte intrazelluläre Proteine zu vermeiden18. Während die hier verwendete Strategie zur Erfassung der Zelloberfläche einer der am häufigsten verwendeten Anreicherungsanreicherungsansätze für die Proteomik der Zelloberfläche ist, gibt es andere Methoden zur Anreicherung von Zelloberflächenproteinen, die in einen massenspektrometrischen Arbeitsablauf integriert wurden, darunter die selektive Ultrazentrifugation von Zellmembranen, die NHS-Biotin-Markierung von Oberflächenlysinen und die enzymvermittelte Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen19. 20. Der Teufel Direkte Vergleiche deuten darauf hin, dass der Ansatz zur Erfassung der Zelloberfläche die optimale Balance zwischen Benutzerfreundlichkeit und erfolgreicher, relativ unvoreingenommener Anreicherung von Zelloberflächenproteinen mit der geringsten Hintergrundmarkierung intrazellulärer Proteine bietet20.
In diesem Artikel wird ein effektives und zeiteffizientes Protokoll für einen Proteomik-Workflow auf der Zelloberfläche vorgestellt, indem das Zelloberflächenmarkierungs- und Pulldown-Verfahren mit einem optimierten Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow integriert wird (Abbildung 1). Das gesamte Verfahren, von der Ernte der kultivierten Zellen bis zur Analyse auf dem Massenspektrometer, konnte über einen Zeitraum von 3 Tagen durchgeführt werden. Um eine möglichst robuste Abdeckung des Oberflächenproteoms zu erhalten, muss die anfängliche Eingabe von Zellen möglicherweise auf der Grundlage des verwendeten Zelltyps optimiert werden. Es wird empfohlen, ein Pilotexperiment mit unterschiedlichem Zelleingang durchzuführen, der von einigen Millionen Zellen bis zu 50 Millionen Zellen reicht, um eine maximale Abdeckung zu gewährleisten. Wenn eine große Menge an hochexprimierenden intrazellulären Proteinen beobachtet wird, könnte ein verstärktes Waschen der Neutravidin-Beads nach der Inkubation mit dem Lysat die unspezifische Bindung von Proteinen an die Beads minimieren.
Wir empfehlen, das Experiment mit mindestens drei biologischen und drei technischen Wiederholungen pro Bedingung durchzuführen, um das Vertrauen zu erhöhen, dass die identifizierten Zelloberflächenmarker tatsächlich auf der Mehrheit der Zellen vorhanden sind. Darüber hinaus könnte es bei der Durchführung des Arbeitsablaufs zur Zelloberflächenerfassung für einen neuen Probentyp hilfreich sein, ein Ganzzelllysat unter Verwendung eines herkömmlichen Schrotflinten-Proteomik-Ansatzes21 zu analysieren, um ihn mit den Ergebnissen der Zelloberflächenerfassung zu vergleichen. Die Analyse der massenspektrometrischen Rohdaten kann durch verschiedene Datenbanksuch- und Softwarepakete durchgeführt werden - hier haben wir MaxQuant verwendet -, um eine Liste der identifizierten Proteine zu erhalten22,23. Diese Liste kann gegen verschiedene bekannte Datenbanken 3,24 von Oberflächenproteinen gefiltert werden, um eine Liste der in einem einzigen Experiment identifizierten Zelloberflächenproteine zu erstellen. Sobald eine Liste von Zelloberflächenproteinen erstellt wurde, können diese weiter auf ihre Rolle in relevanten biochemischen Signalwegen25 oder Wirkstoffzielkandidaten26 analysiert werden. Dieser Workflow kann auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, einschließlich Suspensions- und adhärente Zelllinien (für adhärente Zellen empfehlen wir, Zellen vor der Probenvorbereitung ohne Verwendung von Trypsin zu heben, um eine Spaltung der Zelloberflächenproteine zu vermeiden) sowie auf Primärproben.
Mit diesem Workflow waren wir in der Lage, das Zelloberflächenproteom einer bestimmten Zelllinie sicher zu charakterisieren. Durch den Vergleich des Oberflächenproteoms von Tumorzelllinien mit gesunden Zellen und durch Querverweise mit einer RNA-Sequenzierungsdatenbank für normales Gewebe konnte eine Liste potenzieller immuntherapeutischer Ziele erstellt werden 8,13. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass trotz der signifikanten Anreicherung von Zelloberflächenproteinen im Vergleich zu einem Standard-Ganzzell-Lysat-Experiment die Mehrheit der Proteine, die durch massenspektrometrische Analysen in diesem Workflow identifiziert wurden, immer noch als intrazellulär annotiert sind. Abhängig von der Stringenz der verwendeten Oberflächenproteindatenbank stammen etwa 25%-30% der identifizierten Proteine von der Zelloberfläche. Wir gehen davon aus, dass ein signifikanter Teil des nicht-oberflächennahen Hintergrunds wahrscheinlich von Hintergrundproteinen ausgeht, die unspezifisch an Beads gebunden sind (wie z.B. durch die CRAPome27-Analyse charakterisiert), während andere die Zellpenetration des Markierungsreagenzes darstellen, um mit N-glykosylierten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum, Golgi oder anderen intrazellulären Kompartimenten zu reagieren.
Während alternative Peptid-Elutionsmethoden wie die PNGase-Behandlung zu einer viel stärkeren Anreicherung von N-Glykositen unter den analysierten Gesamtpeptiden führen, erlaubt dieser Ansatz nur die Identifizierung einzelner glyzysylierter Peptide und verliert wertvolle Informationen aus dem nicht-glykosylierten Rest der heruntergezogenen Proteinsequenz12. Diese zusätzlichen Informationen können mit diesem On-Bead-Trypsinisierungsansatz erfasst werden, allerdings mit dem potenziellen Nachteil einer reduzierten Spezifität für N-glykosylierte Proteine, die im Massenspektrometer analysiert werden. Darüber hinaus überwindet selbst die PNGase-Elution nicht die Herausforderung, intrazelluläre glykosylierte Proteine zu markieren, und eine PNGase-Elution führt typischerweise nur zu einem einzigen Peptid pro Protein; Dies führt nach der Erfahrung unseres Labors zu einer signifikanten Variabilität bei der Proteinidentifikation, während der hier beschriebene On-Bead-Aufschluss zu mehreren Peptiden pro eingefangenem Protein führt. Je nach Ziel des Experiments könnte man daher möglicherweise unterschiedliche Strategien für den Einsatz der Strategie zum Einfangen der Zelloberfläche wählen. Diese Strategien umfassen die Miniaturisierung und Automatisierung des Protokolls zur Erfassung der Zelloberfläche für kleine Probeneingaben28 und die Verwendung von Streptavidin-Kügelchen mit unterschiedlicher Bindungskapazität29 je nach Anwendung. Die hier dargestellte Methode und der Workflow dienen als robuste, einfach durchzuführende allgemeine Strategie für die Anreicherung von Zelloberflächenproteinen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Kamal Mandal (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) für die Hilfe bei der Einrichtung des LC-MS/MS-Laufs, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) für die Hilfe bei der Datenanalyse und Dr. Audrey Reeves (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) für die Hilfe bei der Datenanalyse. Verwandte Arbeiten im A.P.W.-Labor werden von NIH R01 CA226851 und dem Chan Zuckerberg Biohub unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2B wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
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