Name: La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Impara a preparare fette di tronco encefalico uditivo di pollo per studi fisiologici in vitro e colture organotipiche a lungo termine. Questo metodo preserva i circuiti neuronali per analisi funzionali.

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Attuali ed ex membri del laboratorio Rubel.

1. Preparazione di dissezione Area <ol><li> Continuamente bolla artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) con una miscela di 95% O 2 / 5% di CO 2 (pH compreso tra 7,2-7,4, osmolarità 295-310 mOsm / l). </li><li> Mentre ACSF è spumeggiante, pulire l'area di lavoro con il 70% EtOH. Pulire anche il vibratome e lama di taglio. Risciacquare con acqua distillata lama (dH 2 O). </li><li> Luogo pulito pad assorbimento di liquidi sulla dissezione area con adeguati strumenti di dissezione. </li><li> Colla blocco agar (40 mg agarosio / ml, cioè 4%, in dH 2 O) alla fase di un vibratome-slicing camera *. * Suggerimento: preparare agar prima dissezione. Conservare pre-agar fatto all'interno di una capsula di Petri coperta in frigorifero. Agarosio acquistato da sostanze chimiche o EMD Invitrogen. </li></ol> 2. Preparato di 6-pozzetti con terreno di coltura <ol><li> Sotto una cappa sterile, riempire 1 vasca per animale di un 6-pozzetti con 1 ml di terreno di coltura e incubare a 35 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Preparare come molti inserti membrana cultura come necessaria e metterli in cappuccio per un uso successivo. </li></ol> 3. Isolamento del tronco di pollo uditive <ol><li> Uovo posto sotto una fonte luminosa di luce per determinare la piena vuoto dello spazio aereo dell'embrione (tipicamente grande lato dell'uovo). </li><li> Rompere grande lato di uovo esporre sacco membrana. Fai la fetta nella membrana sacco con bisturi e rimuovere delicatamente la testa di un embrione di pollo. </li><li> Rapidamente decapitare la testa con le forbici. </li><li> Mettete la punta della lama di rasoio leggermente al posteriore e tra gli occhi. Fare un rostrale-to-caudale incisione linea mediana attraverso il cranio applicando solo una leggera pressione *. * Suggerimento: pressione applicata dipende dall'età dell'embrione (cioè, più giovane = meno = più vecchi) </li><li> Premere delicatamente da parte della pelle e piume di esporre cranio e verificare taglio della linea mediana. </li><li> Blocco porzione rostrale del cranio da affettare con una lametta. Lama posizione posteriore per gli occhi e rapidamente tagliare intero cranio e tessuto cerebrale *. * Suggerimento: è necessaria una forte pressione per rimuovere completamente sezione rostrale. </li><li> Fai la linea mediana a incisioni laterali con piccole forbici nella regione caudale del cranio, leggermente anteriore ai muscoli del collo visibile su entrambi i lati della testa. Tirare fuori cranio ei tessuti per esporre cervelletto e al cervello. </li><li> Rimuovere delicatamente dalla base del tronco cerebrale del cranio, tagliando il tessuto fissato con piccole forbici. Una volta che tutto il tessuto viene tagliato, tronco cerebrale dovrebbe muoversi liberamente fuori dal cranio *. * Suggerimento: potrebbe essere necessario capovolgere il cranio (in basso cervello) per tagliare i tessuti attaccati. </li></ol> 4. Preparazione del tronco per affettare <ol><li> Una volta tolto dal cranio, perno tronco cerebrale giù attraverso l'ottica Tecta. </li><li> Rimuovere completamente il cervelletto con delicatezza il taglio con le forbici i peduncoli piccoli, esponendo il pavimento del quarto ventricolo. </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto membranoso e dei vasi sanguigni dalla superficie del tronco encefalico con una pinzetta e fare dei tagli laterali attraverso l'ottica Tecta per isolare il tronco cerebrale. </li><li> Mettete una piccola quantità di colla super-vibratome sul palco di fronte al blocco di agar (verso la lama vibratome). </li><li> Utilizzando una pinzetta, delicatamente e rapidamente sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale e del tessuto posto sulla super-colla con la parte rostrale verso il basso e verso la parte dorsale a lama vibratome *. * Suggerimento: colla in eccesso dovrebbe essere assorbito con un Kim-wipe o filtro di carta prima fase successiva. </li><li> Delicatamente versare ACSF ossigenata in fase vibratome *. * Nota: questo ACSF possono essere continuamente bolle con O 2 / CO 2. Tuttavia, bolle di ACSF in un piccolo volume di soluzione risultati in movimento indesiderato (e possibili danni) a fette tronco cerebrale. Se eseguita rapidamente, già ossigenato ACSF dalla dissezione è sufficiente. </li><li> Lama Vibratome dovrebbe essere ad un angolo di 20-22 °. Inizio vibratome (oscillazione dovrebbe essere fissato a massima ampiezza) e spostare stadio verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto è parallelo con la lama prima di tagliare. </li><li> Spostare rapidamente lama verso il tessuto cerebrale. Rallentare notevolmente appena prima del contatto della lama con il tessuto. </li><li> Iniziare taglio dei tessuti con più bassa possibile movimento in avanti. Una volta attraverso l'intera sezione coronale del tessuto, spostare delicatamente fetta di distanza dalla lama con una spazzola o un bicchiere rotto, licenziato pipetta lucido, adatta ad una estremità con un bulbo di gomma. </li><li> Inferiore fase 300-500 micron passi e fetta di nuovo. Ripetere l'operazione fino firme anatomiche sono visibili nel tessuto cerebrale. A questo punto, il tessuto cerebrale fetta contenenti strutture uditive a 200-1000 micron spessori, a seconda dell'età dei bisogni del tessuto e sperimentale. </li><li> Attentamente mantenere fette utilizzabile in ordine di taglio, cioè il 1 fetta ° rappresenta la regione più caudale del circuito (a bassa frequenza di elaborazione del suono) e l'ultima fetta rappresenta la sezione più rostrale (ad alta frequenza Processing) *. * Nota: per il posizionamento di fette per la cultura, vai alla sezione 6. Per in-vitro di stoccaggio fisiologia, vedere la sezione successiva. </li></ol> 5. Stoccaggio fetta di in-vitro Fisiologia <ol><li> A seconda dell'età degli embrioni di pollo e lo spessore della fetta, ogni animale dovrebbe prevedere 1-6 fette. </li><li> Delicatamente posto singole sezioni in camera con pipetta di vetro lucido fuoco montato ad una estremità con un bulbo di gomma. Camera devono essere numerate. Posto solo una fetta per ogni bene, al fine di mantenere alcune specificità tonotopica (ad esempio, la fetta più caudale nella camera 1 e la fetta più rostrale nella camera scorso). Camera deve essere riempito con ACSF e continuamente bolle con una miscela di 95% O 2 / 5% di CO 2 (pH 7,4, osmolarità 295-310 mOsm / l). </li><li> Lasciare fette per equilibrare mettendo la camera in un bagno caldo (36 ° C) per circa 1 ora. </li><li> Rimuovere camera da bagno caldo e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per circa mezz'ora. </li><li> Dopo ore e mezza a temperatura ambiente, fette possono essere trasferiti dalla camera tenendo ad una camera di registrazione ~ 0,5 ml montato su un microscopio per esperimenti di elettrofisiologia. </li><li> Fette può essere utilizzato per un massimo di ~ 6 ore dopo la rimozione dal bagno caldo. </li></ol> 6. Preparazione delle Culture Slice organotipica 8 <ol><li> Subito dopo la procedura di taglio (si veda Sezione 6) fette di trasferimento con ~ 500 microlitri ACSF utilizzando una pipetta di vetro lucido fuoco montato ad una estremità con un bulbo di gomma per un piatto ben 48 su ghiaccio. Una fetta per bene *. * Suggerimento: Fette devono essere almeno 300 micron e fino a 1000 micron di spessore. </li><li> Dopo fette sono stati raccolti, trasferire il 48 pozzetti alla cappa. </li><li> Rimuovere un 6-pozzetti contenenti terreno di coltura fuori dell'incubatore e trasferirlo alla cappa. </li><li> Appena prima di mettere le fette da un cervello solo su membrane, luogo uno degli inserti membrana preparati (vedi Sezione 2.2) in un pozzo con terreno di coltura. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria in membrana. </li><li> Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire una fetta in una goccia d'ACSF sulla membrana cultura e rimuovere ACSF in eccesso con una micropipetta. Ripetere l'operazione per le fette restanti (max 4 fette per membrana) *. * Suggerimento: assicurarsi fette non si toccano e fette posto centralmente sulla membrana in modo da non toccare il bordo della membrana. </li><li> Ripetere l'operazione per il numero di sezioni di cervello necessario *. * Suggerimento: se le culture sono manipolate in un punto secondo momento, potrebbe essere vantaggioso per limitare la quantità di membrane al 3 per 6 pozzetti per ridurre il tempo vengono rimosse le culture dal termostato. </li><li> Cambia terreno di coltura 3 volte a settimana sotto una cappa: Rimuovere vecchi media con un tubo a vuoto con una punta sterile mentre inserire membrana viene sollevato dal pozzo con un paio di pinze. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco bene mentre inserire membrana viene sollevato dal pozzo. Quando tutti i media è cambiato, messo piastra posteriore nell'incubatore. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Circuiti binaurale del tronco cerebrale uditivo pollo. (A) Schema di una sezione coronale e (BF) in vitro immagini fetta di tronco cerebrale uditivo pollo. Il circuito in (A) mostra afferente gli ingressi eccitatori dal nervo uditivo (AN) per nucleo magnocellularis (NM) e nucleo angularis (NA). NM progetti bilaterali ingressi eccitatori al nucleo laminaris (NL) su entrambi i lati del tronco encefalico. Un input inibitorio dal nucleo olivare superiore (SON) progetti di NA, NM e NL. In vitro a fette (BF) sono immagini sequenziali (200 micron ciascuno) andando da caudale (B) per rostrale (F) del tronco cerebrale uditivo pollo, che rappresenta il basso ad alta frequenza regioni, rispettivamente. Circuiteria è responsabile per la codifica proprietà temporali del suono utilizzato principalmente per la localizzazione del suono. Barra di scala a (B) = 500 micron e si applica per le immagini in (CF). Frecce (D) puntare al singolo strato corpo cellulare di NL. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Neuroni coltivati ​​sviluppare normale risposta fisiologica proprietà. Sovrapposte variazioni di tensione della membrana in risposta a iperpolarizzante e depolarizzanti passi corrente da acuta (A &amp; C) e della massa colta a 4 (B) e 7 (D) giorni di cultura (DIC). Nota di variazioni iperpolarizzante tensione "sag", forte riduzione della corrente verso l'esterno, e monocottura AP che si sviluppano in modo simile nell'approccio cultura fetta rispetto all'età tessuto equivalente acuta. Iniezioni di corrente sono stati 200 ms, a pochi passi di 50-100 pA. RMP sono stati tra -55 e -60 mV. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Struttura anatomica in sli culturaCES. metà sinistra del tronco cerebrale uditivo di un pollo E11 dopo 7 giorni di cultura (DIC). Un anticorpo contro la proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2), che si verifica nel soma e dendriti, è etichettato in verde. Un gruppo di nucleo magnocellularis (NM), i neuroni e le sue assoni sono etichettati in rosso tramite elettroporazione di un destrano Alexa colorante. Sia NM e la linea cellulare NL sono visibili. Ipsilaterale terminali degli assoni NM può essere visto proiettare al dendriti dorsale NL (punte di freccia bianca).

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per diversi decenni, la preparazione fetta acuta del tronco cerebrale pollo è stato usato per studiare l&#39;elaborazione uditiva 9, 10. Questo approccio ha fornito una quantità enorme di dati in vitro fisiologici sul trattamento binaurale da entrambi gli stati di sviluppo e maturare 4, 11, 12. Si sa molto su questo circuito ad alta specializzazione e il ruolo di ogni nucleo svolge nella lavorazione temporale dei suoni 13, 14. In realtà, manipolazioni sperimentali a breve termin...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACSF per pollo&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td>130 mM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-10576</td><td>26 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9333</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8282</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>423525000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mezzo di coltura per pollo (conservare a 4&amp;#x00B0;C)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mezzo minimo essenziale avanzato (con NEAA, piruvato di sodio a 110 mg/l, senza L-glutammato)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>48,00%</td></tr><tr><td>Soluzione salina equilibrata di Earl&amp;rsquo;s</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2888</td><td>24,00%</td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>1,00%</td></tr><tr><td>Soluzione di glucosio (200 g/l, filtrata sterile)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>2,75%</td></tr><tr><td>Serum equino (inattivato termicamente, filtrato sterile)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138</td><td>24,00%</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina*</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td>1,00 ml&lt;br/&gt;* = Aggiungere a 100 ml di mezzo di coltura se necessario per prevenire contaminazioni</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Attrezzatura specifica&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti per coltura cellulare Millicell-CM</td><td>PICMORG50</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Cluster per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Incubatore con giacca d'acqua al CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Forma Scientific</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Il tronco cerebrale uditivo pollo è un collaudato sistema di modello che è stato ampiamente usato per studiare l&#39;anatomia e la fisiologia del processo uditivo in periodi di discreto sviluppo 04/01 nonché meccanismi per la codifica temporale nel sistema nervoso centrale 5-7. Qui vi presentiamo un metodo per preparare le fette di pollo uditivi del tronco encefalico, che può essere utilizzato per acuti procedure sperimentali o di fette cultura organotipica per le manipolazioni sperimentali a lungo termine. Il tronco cerebrale uditivo pollo è composto da angularis nucleo, magnocellularis, oliva laminaris e superiore. Questi nuclei sono responsabili per l&#39;elaborazione del suono binaurale e singole preparazioni fetta coronale preservare l&#39;intero circuito. In definitiva, le culture fetta organotipica in grado di fornire l&#39;opportunità di manipolare vari parametri di sviluppo come l&#39;attività sinaptica, espressione di componenti pre e post-sinaptici, espressione di eccitabilità aspetti di controllo e di espressione genica differenziale Questo approccio può essere utilizzato per ampliare la conoscenza generale sullo sviluppo del circuito neurale, affinamento e maturazione.

Il tronco cerebrale uditivo pollo è costituita da nuclei responsabile per l&#39;elaborazione del suono binaurale. Una preparazione singola fetta coronale mantiene l&#39;intero circuito mentre l&#39;approccio colto fornisce una preparazione unica di studiare lo sviluppo della struttura neuronale e della funzione uditiva a livello molecolare, cellulare e di rete.

La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

Il tronco encefalico uditivo del pollo è un sistema modello consolidato, ampiamente utilizzato per studiare l'anatomia e la fisiologia dell'elaborazione uditiva a...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare fette del tronco encefalico uditivo di pollo da utilizzare per la fisiologia cellulare integrale in vitro o per colture organotipiche a lungo termine. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo l'embrione dall'uovo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel dissezionare il cervello dal cranio e isolare la regione del tronco encefalico uditivo.Il terzo passaggio della procedura consiste nel preparare sezioni della regione del tronco encefalico su un viome. L'ultimo passaggio della procedura è posizionare le sezioni del tronco encefalico in una camera per registrazioni di fisiologia, oppure su piastre Millipore per la coltura. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano sezioni sane del tronco encefalico uditivo di embrioni di pollo mediante registrazioni fisiologiche o colture organotipiche a lungo termine.Ciao, mi chiamo Armand Sidle. Entrambi questi metodi possono fornire informazioni sullo sviluppo uditivo negli uccelli. Possono inoltre essere utilizzati per studiare la rigenerazione topografica degli esoni, la dinamica dei dendriti, nonché le proprietà intrinseche e sinaptiche grazie alla strutt

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Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Questo video mostra il processo di preparazione di fette di cervello a forma di cuneo in un ambiente di laboratorio. Utilizzando un vibratomo, viene realizzata una fetta a forma di cuneo del cervello di un topo con spessore variabile. Questa fetta contiene la radice nervosa uditiva posizionata all'estremità più spessa, mentre i neuroni relativi all'udito si trovano all'estremità più sottile.

Preparazione di fette di cervello a cuneo per visualizzare i neuroni uditivi

Il video mostra la preparazione delle fette del cervelletto. Mostra una procedura dettagliata per isolare il cervelletto da un embrione di pollo. Le fette vengono quindi preparate dal cervelletto sezionato utilizzando un tritatessuti per ulteriori analisi sperimentali.

Ottenere fette di cervelletto da un cervello di pulcino embrionale

Culture fetta facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale di gene e perturbazioni farmacologiche. Tuttavia, le condizioni di coltura deve garantire che il normale sviluppo può procedere nell'ambiente ridotto della fetta. Illustriamo un protocollo che facilita il normale sviluppo del midollo spinale procedere per almeno 24 ore.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.

L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

Oscillazioni sono proprietà di rete fondamentali e sono modulati dalla malattia e la droga. Studiare le oscillazioni cerebrali slice permette la caratterizzazione di reti isolate in condizioni controllate. I protocolli sono forniti per la preparazione di fettine di cervello acuto per evocare CA1 oscillazioni γ.

Generazione di locali oscillazioni CA1 γ di Tetanic Stimolazione

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

L'integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l'attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

Qui presentiamo un protocollo per ottenere fette uditive non coronali del tronco cerebrale dell'embrione di pollo per lo studio delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo all'interno di una fetta del tronco cerebrale. Queste sezioni includono sezioni sagittali, orizzontali e orizzontali/trasversali che comprendono regioni tonotopiche più grandi all'interno di un singolo piano di fette rispetto alle sezioni coronali tradizionali.

Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

Impara a preparare fette di tronco encefalico uditivo di pollo per studi fisiologici in vitro e colture organotipiche a lungo termine. Questo metodo preserva i circuiti neuronali per analisi funzionali.

La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

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