La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare pollo, fette uditive del tronco encefalico da utilizzare per la fisiologia delle cellule intere in vitro o per colture organotipiche a lungo termine. Ciò si ottiene rimuovendo prima l'embrione dall'uovo. Il secondo passo della procedura consiste nel sezionare il cervello dal cranio e isolare la regione uditiva del tronco encefalico.

Il terzo passo della procedura consiste nel preparare fette della regione del tronco encefalico su un vioma. La fase finale della procedura consiste nel posizionare le fette del tronco encefalico in una camera per le registrazioni fisiologiche o su piastre Millipore per la coltura. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano fette sane del tronco encefalico uditivo da embrioni di pollo attraverso registrazioni fisiologiche o colture organotipiche a lungo termine.

Ciao, mi chiamo Armand Sidle. Entrambi questi metodi possono fornire informazioni sullo sviluppo uditivo degli uccelli. Può anche essere utilizzato per studiare la rigenerazione topografica dell'esone, la dinamica dei dendriti, nonché le proprietà intrinseche e sinaptiche dovute alla struttura e alla funzione uniche di questo circuito uditivo binaurale.

In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà. Il tessuto deve essere rapidamente sezionato, affettato e conservato per avere campioni vitali per approcci fisiologici e colturali. Per prima cosa, prepara una soluzione di agar al 4% aggiungendo 40 milligrammi di agar per millilitro di acqua distillata e scalda nel microonde fino a ebollizione.

Versare la soluzione di agar agar calda in una capsula di Petri e lasciarla raffreddare fino a quando non si sarà solidificata. Ritagliate un piccolo blocco di agar e incollatelo al palco del vibrato. Successivamente, preparare da 500 a 1000 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale o A CSF per dopo.

Utilizzare nella camera dello stadio vibrato gorgogliando continuamente con una miscela di ossigeno al 95%, intervallo di pH di anidride carbonica al 5%, da 7,2 a 7,4 e un'osmolarità da 295 a 310 milli osmoli per litro. Mentre l'A CSF bolle, pulire la dissezione nelle aree di coltura, Vibram e lama con etanolo al 70%. Sciacquare la lama vibram con acqua distillata e lasciarla asciugare, posizionare un tampone di assorbimento del fluido pulito sull'area di dissezione e disporre gli strumenti di dissezione appropriati, solitamente costituiti da bisturi, forbici, pinzette, lame di rasoio, spilli, capsula di Petri e una spatola sotto una cappa sterile per coltura tissutale riempire un pozzetto per embrione di pollo di sei.

Immergere a pozzetto con un millilitro di coltura, tramontare e incubare a 35 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Preparare tutti gli inserti della membrana di coltura necessari e conservarli nella cappa per dopo. Utilizzare sul tampone di dissezione.

Posiziona un uovo sotto una fonte di luce per individuare il vuoto vuoto pieno d'aria dell'embrione, che in genere è il lato grande dell'uovo. Rompi il lato grande dell'uovo usando l'estremità piatta della spatola, esponendo la sacca della membrana. Fare una fetta nella sacca della membrana con il bisturi o le forbici ed estrarre delicatamente la testa dell'embrione di pollo con la spatola.

Usando le forbici. Decapitare rapidamente la testa dell'embrione. Posiziona la punta di una lama di rasoio leggermente posteriormente al centro degli occhi e fai un'incisione rostrale per coccolare la linea mediana attraverso il cranio.

Applicare una leggera pressione per gli embrioni più giovani. Usa meno pressione per gli embrioni più vecchi. Usane di più ora che l'incisione è stata praticata.

Spingere delicatamente da parte la pelle e le piume per gli animali più anziani per esporre il cranio e verificare la linea mediana. Tagliare. Usando una forte pressione, bloccare la parte rostrale del cranio affettandola con una lama di rasoio. Posizionare la lama posteriormente agli occhi e tagliare rapidamente l'intero cranio e il tessuto cerebrale.

Posizionare il fazzoletto ostruito su una capsula di Petri con il lato della coccola rivolto verso l'alto. Fissare il tessuto attraverso la regione muscolare laterale e immergerlo completamente con bolle. Un liquido cerebrospinale.

Praticare incisioni dalla linea mediana ai laterali con piccole forbici nella regione caudale del cranio, leggermente anteriormente ai muscoli visibili del collo su entrambi i lati della testa. Estrarre il cranio e il tessuto per esporre il cervelletto e il cervello. Ora che il tessuto cerebrale è esposto, localizza il cervelletto e il tronco encefalico per rimuovere il tessuto dal cranio.

Usa un paio di piccole forbici per tagliare delicatamente dalla base del cranio il tessuto attaccato che circonda il tronco encefalico sul lato ventrale. Una volta che il tronco encefalico è stato rimosso dal cranio, fissarlo su una capsula di Petri piena di sigaro attraverso l'ottica. Successivamente, rimuovere completamente il cervelletto tagliando i peduncoli con piccole forbici, esponendo il pavimento del quarto ventricolo.

Utilizzare una pinzetta per rimuovere qualsiasi membrana e tessuto e vasi sanguigni dalla superficie del tronco encefalico e praticare tagli laterali attraverso la teta ottica. Per liberare il tronco encefalico, posizionare una piccola quantità di supercolla sul tavolino Vibram davanti al blocco di agar utilizzando una pinzetta angolata delicatamente ma rapidamente. Sollevare il tronco encefalico in corrispondenza del midollo spinale e posizionare il tessuto sulla supercolla con il lato rostrale rivolto verso il basso e il lato dorsale verso la lama vibram.

Assorbire la colla in eccesso con un fazzoletto di carta o carta da filtro. Riempire delicatamente il tavolino vibram con circa 100 millilitri di A CSF ossigenato. Se l'affettatura viene eseguita rapidamente, è possibile utilizzare l'A CSF ossigenato preparato.

Dalla prima sezione. Posizionare la lama Vibram in modo che si trovi a un angolo compreso tra 20 e 22 gradi rispetto al tavolino Vibram. Avviare il vibram alla massima ampiezza di oscillazione.

Quindi spostare il tavolino verso l'alto della lama in modo che la parte superiore del tessuto sia parallela alla lama. Prima di affettare. Muovi rapidamente la lama verso il tessuto del tronco encefalico, ma rallenta notevolmente appena prima che la lama entri in contatto con il tessuto.

Ora che la lama è in posizione, inizia ad affettare il tessuto con il movimento in avanti più lento possibile. Una volta attraversata l'intera sezione coronale del tessuto, allontanare delicatamente le fette dalla lama con un pennello e scartarle. Abbassare il livello del vibrato a passi da 300 a 500 micrometri e affettare.

Ancora una volta, ripeti fino a quando le firme anatomiche sono visibili nel tessuto del tronco encefalico, scartando tutte le fette precedenti. Ora affetta e raccogli il tessuto del tronco cerebrale contenente strutture uditive da 200 a 1000. Spessori micrometrici, raccogliendo con cura le fette utilizzabili nell'ordine di affettatura.

Se le fette devono essere utilizzate per la fisiologia in vitro, che verrà mostrata in una sezione successiva di questo video, a questo punto dovrebbero essere conservate singolarmente in camere personalizzate costituite da tubi di plastica cavi aperti nella parte superiore e rete di nylon incollata nella parte inferiore. Ogni singola camera è collegata a una camera di stoccaggio più grande in cui vengono continuamente gorgogliati circa 350 millilitri di A CSF. Se le fette devono essere utilizzate per colture organiche tipiche, vedere la sezione successiva immediatamente dopo la raccolta delle fette, trasferire le fette con circa 500 millilitri di A CSF utilizzando una pipetta di vetro lucidato a fuoco dotata a un'estremità di un bulbo di gomma su una piastra a 48 pozzetti su ghiaccio.

Posizionando una fetta per pozzetto e mantenendo l'ordine di affettatura. Al termine, raccogliendo tutte le fette di un cervello, portare la piastra a 48 pozzetti nella cappa di coltura tissutale. Recupera la piastra a sei pozzetti che è stata preparata in precedenza dall'incubatrice e portala anche nella cappa.

Posizionare un inserto a membrana in un pozzetto con terreno di coltura, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria intrappolate al di sotto. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire una fetta in una goccia di A CSF sulla membrana umida. Inserire e rimuovere l'eccesso di liquido cerebrospinale A che è ancora sopra con una micropipetta.

Ripetere per un massimo di quattro fette per membrana e posizionare le fette in modo che non si tocchino tra loro o con il bordo della membrana. Conservare le colture in un incubatore a 35 gradi Celsius e mantenerle cambiando il terreno di coltura tre volte alla settimana sotto una cappa di coltura tissutale. Posizionare ogni fetta in una camera di contenimento individuale utilizzando una pipetta di vetro lucidato a fuoco montata a un'estremità con il bulbo di gomma.

Continuando a mantenere l'ordine di affettatura. La camera di contenimento deve essere riempita con l'A CSF preparato in precedenza e continuamente gorgogliata con una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% per tutto il tempo durante gli esperimenti di fisiologia. Lasciare equilibrare le fette mettendo la camera di mantenimento in un bagno d'acqua a 35 gradi Celsius per circa un'ora, quindi lasciarla riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Le fette possono essere utilizzate fino a sei ore dopo la rimozione dal bagno caldo. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, le fette possono essere trasferite dalla camera di mantenimento a una camera di registrazione da 0,5 millilitri montata su un microscopio per esperimenti elettrofisiologici. Qui sono mostrate uno schema rappresentativo e immagini in vitro del circuito uditivo del pollo.

Le immagini a fette sono tipiche della regione uditiva del tronco encefalico e con la pratica possono essere facilmente identificate. Gli input eccitatori ORL dal nervo uditivo o da un progetto N sia al nucleo Magno cellis o NM che al nucleo angularis o N na. La NM proietta input eccitatori bilaterali al nucleo, alle lamine o alla NL su entrambi i lati del tronco encefalico.

Un input inibitorio dal nucleo olivare superiore o SON proietta verso na, nm e nl. Qui, una fetta coronale del tronco encefalico uditivo di un pollo E 11 viene mostrata dopo sette giorni. Nella cultura.

I neuroni sono stati marcati utilizzando metodi immunoistochimici, un anticorpo contro la proteina associata ai microtubuli due, che si trova nel soma e i dendriti marcano i neuroni in verde. Un gruppo di neuroni NM e assoni è marcato in rosso tramite elettroporazione di un colorante rin. I terminali omolaterali dell'assone nm indicati dalle punte di freccia bianche possono essere visti sporgere verso i dendriti NL dorsali.

Qui sono mostrate le variazioni di tensione della membrana sovrapposte in risposta ai passaggi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti dal tessuto acuto e coltivato a quattro e sette giorni in coltura. Si notino i cambiamenti nell'abbassamento della tensione iperpolarizzante, la forte riduzione della corrente verso l'esterno e l'attivazione del potenziale a singola azione che si sviluppa in modo simile nell'approccio della coltura a fette. Rispetto all'età equivalente al tessuto acuto, i potenziali di membrana a riposo erano compresi tra meno 55 e meno 60 millivolt Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 15 minuti se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tecniche sterili appropriate e, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare fette di gambo di treccia uditiva di pollo da utilizzare per registrazioni fisiologiche o da utilizzare per la coltivazione.