Name: En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri la preparazione en face delle arterie del topo per l'immunofluorescenza e la microscopia confocale. Questo metodo consente di analizzare la localizzazione proteica e l'organizzazione cellulare nella parete vascolare.

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Le attività di ricerca degli autori sono sostenute da sovvenzioni dell&#39;Istituto Nazionale di Salute al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

I protocolli per la legatura parziale dell&#39;arteria carotide del mouse e l&#39;isolamento dell&#39;arte del topo e dell&#39;arteria carotide per l&#39;immunocoltura del viso sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali (IBT 2014-9231). 1. Ligation di arteria carotide parziale sinistra <ol><li> Preparare lo spazio chirurgico mettendo un tavoletta da 12 pollici da 14 pollici sul tavolo e coprire il tappetino e la tavola con un grande teli chirurgici puliti. Regolare il braccio del basamento del braccio in modo che il campo visivo dello stereomicroscopio sia nell&#39;area centrale del piano di riscaldamento. </li><li> Accendere il riscaldatore sul tavolo e impostare la ghiera di controllo a 3 livelli al livello di calore medio. A questa impostazione della temperatura, la superficie della scheda chirurgica (vedi 1.6.1) sarà di 38-40 ° C. <ol><li> Mettere una gabbia pulita su un altro tappetino. Ruotare il riscaldamento come sopra. Questa gabbia sarà utilizzata per il recupero dopo l&#39;intervento chirurgico (vedi 1.16) e l&#39;alloggiamento. </li></ol></li&gt; <li> Sul tavolo chirurgico inserire una sacca per sterilizzazione autoclavata contenente forbici iride (1 paio), pinze per tessuti (1 coppia), pinze super grip (2 paia), forbici a molla (1 coppia), retrattore sbattuto (1 coppia, larghezza 2,5 mm) (1), sutura di seta sterilizzata 6-0, applicatori a cotone, applicatori in miniatura di cotone, drappi chirurgici e 2 spugne di garze da 2 &quot;x 2&quot;. Inoltre mettere una bottiglia di spremitura contenente il 70% di etanolo e un altro contenente cherheidina chirurgica chirurgica il tavolo chirurgico. </li><li> Pesare un mouse. Il peso corporeo è necessario per determinare l&#39;adeguata quantità di analgesia, che verrà somministrata immediatamente prima dell&#39;intervento. </li><li> Inserire un mouse nella camera di induzione. </li><li> Accendere il serbatoio dell&#39;ossigeno e il vaporizzatore anestetico per anestetizzare il topo nella camera di induzione. Mantenere il livello di isoflurano al 2%. Ci vogliono 3-5 minuti prima che il mouse smetta di muoversi. <ol><li> Mentre il mouse è in anestesia, Mettere un piccolo pezzo di sterile chirurgico (24 pollici x 24 pollici) sotto lo stereomicroscopio per creare una superficie chirurgica. Quindi posizionare una tavola chirurgica acrilica (che è stata pulita con alcol al 70%) sulla superficie drappeggiata. La tavola chirurgica dovrebbe quindi essere sul piano di riscaldamento, ma separata da due strati di teli chirurgici. </li></ol></li><li> Quando il topo smette di muoversi nella camera di induzione, trasferire il mouse in un&#39;area di preparazione pre-chirurgica e posizionare il naso nel cono conico collegato al vaporizzatore (2% isoflurano). Rimuovi i capelli intorno all&#39;area cervicale usando un trimmer elettrico o una lozione rimozione dei capelli. Raccomandiamo la rimozione dei capelli perché questo metodo non produrrà pezzi di capelli allentati, che sono difficili da rimuovere completamente dall&#39;area chirurgica. </li><li> Con il cono in posizione, spostare il mouse sulla scheda chirurgica. <ol><li> Tape giù le zampe anteriori destra e sinistra alla scheda chirurgica. Tape giù entrambe le gambe posterioriSul lato destro del mouse. Ciò provoca una leggera rotazione del corpo del topo in modo tale che il lato sinistro dell&#39;area del collo del mouse diventa meglio posizionato per la chirurgia. </li></ol></li><li> Disinfettare l&#39;area di incisione con l&#39;alcool al 70%, la chirurgia cherheidina, e ancora con l&#39;alcool al 70%. Coprire il mouse con un drappo chirurgico sterilizzato tranne per l&#39;area di incisione cervicale. </li><li> Confermare con il pizzico del piede che il mouse è completamente anestetizzato e dare analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) tramite iniezione intraperitoneale o sottocutanea. </li><li> Sotto il microscopio di dissezione, effettuare un&#39;incisione midline ventrale attorno all&#39;area cervicale usando una forbice da scalpello o da iride. NOTA: usiamo forbici perché la distanza di lavoro dello stereomicroscopio è limitata, rendendo difficile l&#39;uso di un bisturi. </li><li> Esporre l&#39;arteria carotide comune sinistra (LCCA) spingendo da parte e riposizionando le ghiandole salivari che coprono i vasi sanguigni sul lato sinistro dellaNimal. </li><li> Identificare tutti i vasi sanguigni nel campo chirurgico ( Figura 1 ). L&#39;LCCA si biforcera nell&#39;arteria carotide interna sinistra (ICA) e nell&#39;arteria carotide esterna sinistra (ECA). L&#39;arteria tiroidea superficiale (STA) nasce dall&#39;ECA dal lato mediale. L&#39;arteria occipitale (OA) di solito sorge dalla ECA, ma in alcuni topi deriva dall&#39;ICA. </li><li> Legare tutti i rami d&#39;arteria tranne l&#39;OA usando la sutura di seta sterilizzata 6-0. Per raggiungere questo obiettivo, fare le due seguenti legazioni. <ol><li> Rimuovere delicatamente il tessuto connettivo attorno e sotto l&#39;arteria carotide interna sinistra (ICA). Prendi un pezzo di sutura di seta 6-0 (~ 2,5 cm) con le pinze e lo passa sotto l&#39;arteria. Utilizzando un&#39;altra coppia di pinze, tirare la sutura circa 1/3 della sua lunghezza e legare l&#39;arteria. </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo attorno all&#39;arteria carotide esterna sinistra (ECA) allo stesso modo sopra descritto e fare una legatura prossimale al tiro superiore superiore sinistroD arteria (STA) ( figura 1 ). Fare attenzione a non danneggiare le fibre nervose che corrono all&#39;interno del campo chirurgico. </li></ol></li><li> Quando queste legazioni sono state fatte, riportare le ghiandole salivari nella posizione originale e idratare il campo chirurgico collocando 2-3 gocce di salina sterile. Chiudere la pelle usando le suture con vernice 6-0 rivestite. </li><li> Dopo l&#39;intervento, posizionare il mouse nella gabbia pre-riscaldata (vedere 1.2.1). Il mouse dovrebbe svegliarsi entro 5 minuti e cominciare a camminare. Una volta confermato che il mouse si comporta normalmente, portare la gabbia nella stanza di alloggiamento animale. </li><li> Osservare il mouse ogni giorno per i primi 3 giorni di recupero. Il mouse può essere mantenuto fino a quando l&#39;esperimento richiede le varie condizioni richieste dal protocollo sperimentale. Le preparazioni in faccia possono essere fatte in qualsiasi momento dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 2. En Face Immunostaining <ol><li> Eutanizzare un topo con CO 2 per overdose di inalazione. </li><li>Nastro il mouse in posizione supina (pancia verso l&#39;alto) su una scheda di dissezione. </li><li> Esporre la cavità addominale facendo un&#39;incisione midline usando le forbici dell&#39;iride. </li><li> Esporre la cavità toracica tagliando le nervature lateralmente allo sterno. </li><li> Fare un nick nella vena cava o tagliare una delle arterie femorali per scaricare il sangue. </li><li> Inserire un ago da 26 G attaccato ad una configurazione di gravità (120 cm di pressione dell&#39;acqua) nell&#39;apice del ventricolo sinistro e perfezionare il sistema circolatorio con soluzione salina contenente eparina (40 U / mL). Continuare la perfusione fino a quando la salina che scorre dal taglio diventa chiara. </li><li> Passare il sistema di perfusione dalla soluzione salina alla soluzione di fissazione contenente 4% di paraformaldeide in PBS (salina tampone fosfato) e continuare a perfusione per altri 5 min. </li><li> Raccogliere l&#39;aorta e le arterie carotide sinistra e destra usando forbici e pinze a punta liscia e collocare in un tubo conico da 50 mL contenente il fissativo sul ghiaccio. </li><li&gt; Trasferire la vaschetta in un piatto di Petri contenente PBS sotto un microscopio di dissezione e rimuovere con cura i tessuti connettivi e legati all&#39;arte e alle arterie carotide. Separare e suddividere l&#39;aorta e le arterie carotide longitudinalmente per esporre l&#39;endotelio ( Figura 2 ). </li><li> Trasferire separatamente ciascuna vasca in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 0,5 mL di una soluzione permeabilizzante (0,1% Triton X-100 in PBS) per pozzetto. Permeabilizzare i vasi sanguigni per 10 minuti con il dondolo a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavare brevemente con PBS. </li><li> Per bloccare i siti di legame non specifici dell&#39;anticorpo, incubare i vasi sanguigni nel 10% di siero normale della specie animale in cui sono stati prodotti gli anticorpi secondari, in TTBS (Tris-tamponato salina (TBS) con 2,5% Tween 20) per 30 minuti con Dondolando a RT. </li><li> Incubare le vasi con gli anticorpi primari opportunamente diluiti in TTBS con 10% di siero normale (come sopra descritto) durante la notte con il dondolo a 4 ° C. Il livelloDi diluizione deve essere determinato per ogni anticorpo. </li><li> Eseguire la seguente colorazione di controllo. <ol><li> Incubare le vasi con TTBS anziché un anticorpo primario seguito da incubazione con un anticorpo secondario. </li><li> Incubare le navi con TTBS contenenti siero o immunogeno non immunitario (o pre-immunitario) dello stesso animale (specie) in cui sono stati effettuati anticorpi primari, seguiti da incubazione con un anticorpo secondario. </li><li> Omettere l&#39;incubazione con un anticorpo secondario. Questi esemplari di controllo devono essere trattati nello stesso modo e nello stesso tempo in cui viene eseguita la colorazione con anticorpi specifici. </li></ol></li><li> Lavare i vasi sanguigni 3 volte con TTBS per 10 minuti ciascuno con il dondolo a RT. </li><li> Incubare con anticorpi secondari a fluorescenza diluiti opportunamente in TTBS con 10% di siero normale (come sopra descritto) per 1 h con il dondolo a RT. La colorazione nucleare con DAPI (4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo) può essere eseguita simultaneamenteT questa fase aggiungendo 1/5000 in volume di una soluzione di riserva DAPI che contiene 5 mg / mL di DAPI in H 2 O. </li><li> Lavare 3 volte con TTBS per 10 minuti ciascuno con il dondolo a RT. </li><li> Sciacquare brevemente in PBS. </li><li> Mettere una goccia del reagente antifumo su un vetro di copertura (22 mm x 50 mm) e posizionare un vaso sanguigno sul vetro di copertura con l&#39;endotelio rivolto verso il basso. </li><li> Posizionare un vetrino (22 mm x 75 mm) sul vaso sanguigno evitando le bolle di cattura. </li><li> Posizionare la diapositiva su una pulizia pulita del laboratorio ( es. Kimwipe) e coprire la diapositiva con due pezzi di pulizia del laboratorio. Mettere delicatamente 3,5 kg di peso ( ad es. Usare una bottiglia d&#39;acqua su un libro spesso) sullo scivolo per un massimo di 5 minuti per appiattire il campione del vaso sanguigno. </li><li> Rimuovere il peso e togliere la soluzione in eccesso da tutto il coperchio. </li><li> Applicare uno smalto ai 4 angoli della copertura, posizionare le diapositive in una scatola di scorrimento, rivestimento rivolto verso l&#39;alto e tenere al buio a RT(O 4 ° C) durante la notte. Questo processo appiattisce ulteriormente il tessuto e rende più facile eseguire la microscopia ad alti ingrandimenti. </li><li> Sigillare completamente il coperchio con smalto. </li><li> Eseguire la microscopia non appena il lucido per unghie è asciutto. </li><li> Se necessario, conservare le diapositive a -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-%27thinned-wall%27+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li>
<li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1803374/">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li>
<li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li>
<li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13576293">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li>
<li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+face+stripping+of+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li>
<li>White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li>
<li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclero%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li>
<li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e(2012).</li>
<li>Chèvre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li>
<li>Heo, K. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li>
<li>Le, N. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ%22%5BJournal%5D)">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li>
<li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li>
<li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21173104">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li>
<li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10623329409024632">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep34331">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

Quando si manipolano con i vasi sanguigni del mouse, è importante ricordare che l&#39;endotelio è fragile e che qualsiasi eccessiva forza meccanica danneggerà le cellule endoteliali. Ad esempio, le cellule endoteliali si rompono o si staccano dalla parete del vaso se la vasca viene perfusa troppo forte, cosa che può accadere facilmente quando la vasculatura viene perfusa usando una siringa a mano. Per ottenere una pressione costante di perfusione, usiamo un sistema di perfusione gravitaziona...

Per gli studi istopatologici mediante microscopia leggera, i pezzi tridimensionali di tessuti biologici sono trattati in modo ordinario per l&#39;embedment di paraffina seguito da sezionamento e colorazione. Un campione di tessuto che è stato incorporato in paraffina può essere di parecchi millimetri in tutte e tre le dimensioni. Tuttavia, ai fini della microscopia leggera, deve essere prima sezionato in modo che la luce possa passare e poi venire macchiata in modo che la sezione sottile abbia abbastanza contrasto per l&#39;imaging. Poiché gli esemplari tagliati sono di solito 5-10 μm di spessore, si vede solo una frazione molto piccola dell&#39;intero campione in due dimensioni alla volta. È possibile raccogliere sezioni sequenziali e, dopo l&#39;imaging di ogni sezione singolarmente, eseguire la ricostruzione assistita da computer delle immagini 3D, ma in realtà è un lavoro noioso. L&#39;istopatologia dei vasi sanguigni, specialmente per studiare la patogenesi dell&#39;aterosclerosi, presenta problemi unici. L&#39;aterosclerosi è una malattia focalizzata che si sviluppaLocalmente in aree dove si verifica un flusso sanguigno disturbato. Inoltre, la malattia è iniziata nell&#39;intima, un tessuto sottile costituito da un monostrato di cellule endoteliali e matrice extracellulare, di grandi arterie. Per queste ragioni, è una sfida per individuare e studiare le lesioni precoci utilizzando vasi sanguigni sezionati perché si può facilmente perdere la sezione della lesione. Anche se una sezione comprende un&#39;area malata, si vedrà solo una porzione di 5-10 μm contenente cellule endoteliali e altre cellule della parete vascolare nei media e nell&#39;adventitia. Il tutto in faccia (pronunciato än fäs) i preparativi ci permettono di esaminare un&#39;ampia area della superficie del vaso sanguigno come l&#39;intero aorta dalla radice aortica fino alla comune arteria iliaca. Utilizzando un simile campione colorato con anticorpi specifici e altre sonde specifiche, si può individuare la localizzazione delle lesioni e anche dove si verificano vari eventi molecolari nelle cellule endoteliali congiuntamente wiAterogenesi come i cambiamenti nell&#39;espressione, localizzazione e modificazioni posttranslazionali delle proteine. Oltre a studiare l&#39;aterogenesi, la forma delle cellule endoteliali osservate nelle preparazioni en faccia viene utilizzata come indicatore del pattern di flusso sanguigno regionale. Tali dati sono importanti per studiare la meccanosignazione delle cellule endoteliali in situ. A questo scopo, non sono utili i vasi sanguigni a sezione trasversale istologica. Pertanto, per la medicina vascolare e la biologia, è particolarmente importante acquisire una tecnica per preparare preparazioni en vena dei vasi sanguigni che consente di osservare un&#39;ampia area della superficie del vascello così come le aree più profonde del sottosuolo. Come rivisto da Jelev e Surchev 1 , i biologi vascolari hanno sviluppato diversi metodi per osservare la fodera dei vasi sanguigni in faccia. Alcuni metodi ingegnosi furono sviluppati negli anni &#39;40 e &#39;50. Usando questi metodi, sono stati<html> In grado di studiare l&#39;organizzazione fondamentale delle cellule endoteliali che fanno riferimento alla superficie interna dei vasi sanguigni. Tuttavia, a causa del modo in cui queste preparazioni sono preparate (il cosiddetto metodo Hautchen 2 , 3 , 4 o il peeling off della superficie del vaso 5 ) e il modo in cui il campione è stato macchiato, non è stato sempre possibile ottenere morfologie ininterrotte Informazioni dalla superficie del vaso nelle zone più profonde della parete del vaso sanguigno. La preparazione completa del vaso di faccia combinata con la colorazione dell&#39;immunofluorescenza ci ha consentito non solo di studiare la morfologia delle cellule endoteliali e l&#39;espressione e la localizzazione delle proteine ​​in queste cellule, ma anche estendere tali studi alla regione subendoteliale della parete del vaso. Studi iniziali che utilizzano vasi sanguigni in faccia preparati macchiati immunoflurezzi cominciarono a apparire negli anni &#39;80 ,F &quot;&gt; 7. Con l&#39;avvento della microscopia confocale a scansione laser e della microscopia multifotonica di recente, è ora possibile ottenere immagini chiare in focus della struttura della parete dei vasi sanguigni in campioni vascolari immunofluorescenti e vascolari in animali vivi 8 , 9 , 10 , 11. Queste tecniche di imaging basate su computer creano immagini a sezione ottica in focus e, impilando tali immagini, è possibile ottenere immagini ricostruite 3D della parete del vascello e della rete vascolare nei tessuti. Può generare immagini di una sezione realizzata lungo l&#39;asse Z dell&#39;immagine ricostruita 12 , 13 . In questo articolo, illustreremo un metodo per la preparazione delle preparazioni in faccia del aorta del topo e dell&#39;arteria carotide per la colorazione immunofluorescenti. I preparativi per il visoPuò essere fatto anche dopo che queste navi sono state manipolate in modo sperimentale. Ad esempio, un&#39;arteria carotide può essere legata parzialmente e quindi una preparazione in faccia eseguita dopo una tale operazione. Per questo motivo, descriveremo anche in questo articolo come facciamo una legatura parziale sull&#39;arteria carotidea. Rispetto alla fabbricazione di preparati simili da animali di grandi dimensioni, come ratti, conigli e umani, i recipienti del mouse sono di taglia piccola e più fragili, richiedendo così una maggiore cura per la manipolazione durante l&#39;isolamento chirurgico dei vasi e preparandoli per la colorazione degli anticorpi e la microscopia. Poiché il modello animale più comunemente utilizzato per la modifica genetica è il topo, diventa critico per molti investigatori di gestire i vasi del mouse senza danneggiarli. In questo manoscritto descriveremo come gestire i vasi sanguigni del mouse quando facciamo preparazioni in faccia dell&#39;arte del topo e dell&#39;arteria carotidea. Ai fini della dimostrazione, utilizzeremo i topi selvatici tipo C57 / b6.

<table><tbody><tr><td>Soluzione iniettabile di cloruro di sodio allo 0,9% USP Sacca da 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>Fisher Scientific 12556005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura vicryl rivestita 6-0</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 capra anti-ratto IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 capra anti-coniglio IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) IgG policlonale di coniglio Santa</td><td>Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 pollici x 24 pollici</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatori smussati, 2,5 mm di larghezza</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofene (Rimadyl)&nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Scrub alla clorexidina, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Spugne di garza Curity 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo elettrico, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe Graefe extra fine</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td> <td>per irideFine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro vetro di copertura 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr> siero <tr><td>di capra normale</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di cortton puritani</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini aplicatori con punta in cotone</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Porta ago con manico rotondo</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in seta 6/0</td><td>Scienze fini Strumenti</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per strabismo</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Super Grip</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Medicazione trasparente</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face preparazione delle navi sanguigne del mouse

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sezioni di tessuti embedded di paraffina vengono utilizzati abitualmente per lo studio dell&#39;istologia del tessuto e dell&#39;istopatologia. Tuttavia, è difficile determinare ciò che la morfologia tissutale tridimensionale deriva da tali sezioni. Inoltre, le sezioni dei tessuti esaminati non possono contenere la regione all&#39;interno del tessuto necessaria ai fini dello studio in corso. Questa ultima limitazione ostacola gli studi istopatologici dei vasi sanguigni poiché le lesioni vascolari si sviluppano in modo focalizzato. Ciò richiede un metodo che ci permette di rilevare un&#39;ampia area della parete del vaso sanguigno, dalla sua superficie fino alle regioni più profonde. Una preparazione completa dei vasi sanguigni è in grado di soddisfare questo requisito. In questo articolo dimostreremo come fare preparazioni in faccia dell&#39;arte del topo e dell&#39;arteria carotide e di immunofluorescenziarle per la microscopia confocale e altri tipi di immagini a base di fluorescenza.

Un&#39;immagine immunofluorescenza tipica dell&#39;endotelio è mostrata in Figura 3 . Questa immagine mostra una singola sezione ottica di un aorta di topi prese vicino all&#39;apertura di un&#39;arteria intercostale (la grande zona di uovo scuro). L&#39;aorta è stato duplicato con anti-VE-cadherina (verde) e anti-VCAM-1 (molecola adesione cellulare vascolare-1) (rosso). Ogni cellula endoteliale è delineata con una colorazione lineare verde alla giunzione aderente. A cau...

Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell&#39;arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine ​​e l&#39;identificazione dei tipi di cellule nell&#39;intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.

En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare l'aorta del topo e l'arteria carotidea per la colorazione immunoistochimica en face dopo la legatura dell'arteria carotidea sinistra. Questo metodo ci consente di studiare l'organizzazione, l'espressione di ciascuna proteina e lo stato possibile delle cellule endoteliali e di altre cellule vascolari mediante tecniche di colorazione immunoistochimica. Le preparazioni en face permettono l'analisi di ampie aree dei vasi sanguigni al fine di valutare le differenze regionali nell'espressione di vari parametri cellulari normali e possibili.La procedura sarà dimostrata dal Dottor Quaico, un microchirurgo del nostro gruppo. Iniziare posizionando il topo anestetizzato su un tavolo chirurgico in posizione supina. Dopo aver verificato l'assenza di risposta alla pinzatura delle dita dei piedi, fissare le zampe anteriori alla tavola in posizione estesa e entrambe le zampe posteriori al lato destro del topo per esporre il lato sinistro del collo.Rimuovere i peli nella zona cervicale e disinfettare la cute esposta. Coprire il topo con un telo chirurgico sterilizzato che presenti un foro sulla regione operatoria ed applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Posizionare il topo sotto il microscopio stereoscopico ed eseguire un'incisione mediana ventrale nella zona cervicale.Riposizionare le ghiandole salivari che ricoprono i vasi sanguigni sul lato sinistro dell'animale per esporre l'arteria carotide comune sinistra, che si divide nell'arteria carotide interna sinistra e nell'arteria carotide esterna sinistra. Rimuovere delicatamente il tessuto connettivo intorno e al di sotto dell'arteria carotide interna sinistra ed utilizzare una pinzetta per passare un tratto di 2,5 centimetri di sutura di seta numero sei, precedentemente tagliata, sotto l'arteria, usando una seconda pinzetta per tirare la sutura di circa un terzo della sua lunghezza sull'altro lato del vaso. Legare l'arteria carotide interna sinistra.Quindi rimuovere il tessuto connettivo intorno all'arteria carotide esterna sinistra come appena dimostrato e praticare una legatura prossimale rispetto all'arteria tiroidea superiore sinistra. Quando tutte le arterie, ad eccezione dell'arteria occipitale, sono state legate, riposizionare le ghiandole salivari nelle loro posizioni originali e idratare il campo chirurgico con due o tre gocce di soluzione fisiologica. Successivamente, utilizzare sei punti di sutura in vycril rivestito con numero 6 per chiudere la cute e posizionare il topo nella gabbia preriscaldata con monitoraggio fino al completo recupero della posizione decubito. Al termine dell'esperimento, fissare il topo in posizione supina su un tavolo da dissezione e utilizzare forbici da iridectomia per esporre la cavità addominale mediante un'incisione mediana. Tagliare le costole lateralmente allo sterno per esporre la cavità toracica. Successivamente, praticare un'incisione nell'arteria femorale ed inserire un ago da 26 gauge collegato a un sistema di perfusione per gravità nell'apice del ventricolo sinistro per perfondere il sistema circolatorio con soluzione salina integrata con eparina.Continuare la perfusione fino a quando il liquido salino che fuoriesce dal taglio non diventa limpido. Quindi, passare il sistema di perfusione da soluzione salina a paraformaldeide al 4% in PBS. Dopo cinque minuti, posizionare il topo sotto il microscopio stereoscopico e utilizzare forbici a punta ottusa e pinze per isolare l'aorta e le arterie carotidi sinistra e destra.Successivamente, trasferire i tessuti in una piastra di Petri contenente PBS ed eliminare con attenzione il tessuto adiposo e quello connettivo, quindi procedere alla separazione e al taglio longitudinale dell'aorta e delle arterie carotidi per esporre l'endotelio. La cosa più importante da ricordare nella preparazione di vasi sanguigni in preparazione en face è che le cellule endoteliali possono essere facilmente danneggiate da un'eccessiva manipolazione. Non stirare mai i vasi, specialmente durante le fasi di prelievo e di pulizia.Quindi trasferire ciascun vaso in pozzi singoli di una piastra a 12 pozzetti contenente 0,5 millilitri di soluzione permeabilizzante per pozzetto. Permeabilizzare i vasi sanguigni per 10 minuti con agitazione a temperatura ambiente, seguito da un breve lavaggio in PBS. Bloccare qualsiasi legame non specifico mediante un'incubazione di 30 minuti in siero normale al 10% della stessa specie degli anticorpi secondari previsti, in TTBS, con agitazione a temperatura ambiente.Quindi etichettare i campioni con gli anticorpi primari di interesse diluiti in TTBS con siero normale al 10% durante la notte con agitazione a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, risciacquare i vasi sanguigni con tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in TTBS con agitazione a temperatura ambiente, seguiti dall'incubazione con gli anticorpi secondari appropriati diluiti in TTBS, siero normale al 10% e DAPI. Rimettere i campioni sul rocker e coprirli per proteggerli dalla luce.Dopo un'ora a temperatura ambiente con agitazione, lavare i campioni tre volte in TTBS fresco come indicato, seguito da un rapido risciacquo in PBS, e posizionare una goccia di reagente anti-fade per contenitore su ciascun vetrino coprioggetto da 22 per 50 millimetri. Al microscopio, posizionare un contenitore in ciascuna goccia di reagente con l'endotelio rivolto verso il basso, e coprire i contenitori con un vetrino da 22 per 75 millimetri per campione. Posizionare i vetrini su un fazzoletto da laboratorio pulito e coprirli con due pezzi di fazzoletto da laboratorio e un peso di 3,5 chilogrammi per appiattire i contenitori.Dopo un massimo di cinque minuti, rimuovere il peso e asciugare la soluzione in eccesso intorno alle lamelle. Quindi applicare lo smalto per unghie ai quattro angoli delle lamelle e posizionare i vetrini in una scatola portaoggetti, con la faccia della lamella rivolta verso l'alto. La mattina successiva, utilizzare ulteriore smalto per unghie per sigillare completamente le lamelle e acquisire le immagini dei vasi non appena lo smalto sarà asciutto.Di seguito è mostrata una tipica immagine di immunofluorescenza en face di endotelio doppio marcato con anticorpi anti VE-caderina e anti molecola di adesione cellulare vascolare 1, che illustra una singola sezione ottica di un'aorta di topo prelevata in prossimità dell'apertura di un'arteria intercostale. Si noti la colorazione verde lineare all'adesione delle giunzioni tra le cellule endoteliali e l'intensa colorazione anti molecola di adesione cellulare vascolare 1 all'apertura dell'arteria intercostale, dove è noto che si verifichi un flusso sanguigno disturbato. In queste immagini è possibile osservare la colorazione en face di un'arteria carotidea sinistra parzialmente legata e di un'arteria destra di controllo non legata, un giorno dopo l'intervento chirurgico, con una marcata intensificazione della colorazione anti molecola di adesione cellulare vascolare 1 visibile nel vaso legato.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire una legatura parziale dell'arteria carotide sinistra e di come preparare preparati en face nei vasi sanguigni del topo. Applicare questa tecnica anche ad altri piccoli animali. L'uso dei preparati en face non è ora limitato alla colorazione immunofluorescente, ma può essere impiegato anche con altre metodiche, come per lo studio di quelle regioni intere dopo colorazione con oriole, oppure per esperimenti ex vivo di contro-colorazione.

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Preparazione dei tubi endoteliali cerebrali dalle arteriole parenchimali di topo

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

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Scopri la preparazione en face delle arterie del topo per l'immunofluorescenza e la microscopia confocale. Questo metodo consente di analizzare la localizzazione proteica e l'organizzazione cellulare nella parete vascolare.

En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

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