En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell'arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine ​​e l'identificazione dei tipi di cellule nell'intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare l'aorta e l'arteria carotide del topo per la colorazione immunologica en face dopo la legatura dell'arteria carotide sinistra. Questo metodo ci permette di studiare l'organizzazione, l'espressione di ogni proteina e il possibile stato delle cellule antrali e di altre cellule vascolari nei metodi di immunocolorazione. Le preparazioni en face consentono l'analisi di ampie aree attraverso i vasi sanguigni per la valutazione della differenza regionale nell'espressione di vari parametri cellulari normali e possibili.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Quaico, un micro chirurgo del nostro gruppo. Inizia posizionando il topo anestetizzato su una tavola chirurgica in posizione supina. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al nastro di pizzicamento delle dita, le zampe anteriori sulla tavola in posizione tesa e entrambe le zampe posteriori sul lato destro del mouse per esporre al lato sinistro del collo.

Rimuovere i peli intorno alla zona cervicale e disinfettare la pelle esposta. Copri il topo con un telo chirurgico sterilizzato con un foro sulla regione chirurgica e applica un unguento sugli occhi dell'animale. Muovi il mouse sotto il microscopio da dissezione e fai un'incisione ventrale sulla linea mediana attorno all'area cervicale.

Riposizionare le ghiandole salivari che coprono i vasi sanguigni sul lato sinistro dell'animale per esporre l'arteria carotide comune sinistra, che si biforca nell'arteria carotide interna sinistra e nell'arteria carotide esterna sinistra. Rimuovere delicatamente il tessuto connettivo intorno e sotto l'arteria carotide interna sinistra e utilizzare una pinza per far passare una lunghezza di 2,5 centimetri di sutura di seta pretagliata a sei O sotto l'arteria, utilizzando una seconda pinza per tirare la sutura a circa un terzo della sua lunghezza sull'altro lato del vaso. Legare l'arteria carotide interna sinistra.

Quindi rimuovere il tessuto connettivo attorno all'arteria carotide esterna sinistra come appena dimostrato ed eseguire una legatura prossimale all'arteria tiroidea superiore sinistra. Quando tutte le arterie tranne l'arteria occipitale sono state legate, riportare le ghiandole salivari nelle loro posizioni originali e idratare il campo chirurgico con due o tre gocce di soluzione fisiologica. Quindi utilizzare sei suture in vicryl rivestite di O per chiudere la pelle e posizionare il topo nella gabbia preriscaldata con monitoraggio fino alla completa decubito.

Al termine dell'esperimento, fissare il topo in posizione supina su una tavola da dissezione e utilizzare le forbici dell'iride per esporre la cavità addominale con un'incisione sulla linea mediana. Tagliare le costole lateralmente allo sterno per esporre la cavità toracica. Quindi intacca l'arteria femorale e inserisci un ago calibro 26 attaccato a una profusione gravitazionale allestita all'apice del ventricolo sinistro per inondare il sistema circolatorio con soluzione salina integrata con eparina.

Continuare la profusione fino a quando la soluzione salina che scorre dal taglio diventa chiara. Quindi passare il sistema di profusione da soluzione salina a paraformaldeide al 4% in PBS. Dopo cinque minuti, muovi il topo sotto il microscopio da dissezione e usa le forbici smussate e le pinze per prelevare l'aorta e le arterie carotidi sinistra e destra.

Successivamente, trasferire i tessuti in una capsula di Petri di PBS e rimuovere con cura il grasso e i tessuti connettivi, seguiti dalla separazione e dalla scissione longitudinale dell'aorta e delle arterie carotidi per esporre l'endotelio. La cosa più importante da ricordare quando si preparano i vasi sanguigni en face è che le cellule endoteliali sono facilmente danneggiate da una manipolazione brusca. Non allungare mai i recipienti, soprattutto durante le fasi di raccolta e pulizia.

Quindi trasferire ogni recipiente nei singoli pozzetti di una piastra da 12 pozzetti contenente 0,5 millilitri di soluzione permeabilizzante per pozzetto. Permeabilizzare i vasi sanguigni per 10 minuti con oscillazione a temperatura ambiente, seguito da un breve lavaggio in PBS. Bloccare qualsiasi legame aspecifico con un'incubazione di 30 minuti in siero normale al 10% della stessa specie degli anticorpi secondari pianificati in TTBS, con oscillazione a temperatura ambiente.

Quindi etichettare i campioni con gli anticorpi primari di interesse diluiti in TTBS con siero normale al 10% durante la notte con oscillazione a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, sciacquare i vasi sanguigni con tre lavaggi di 10 minuti in TTBS con oscillazione a temperatura ambiente, seguiti dall'incubazione negli anticorpi secondari appropriati diluiti in TTBS e siero normale al 10% e dappy. Rimettere i campioni nel bilanciere e coprire per proteggerli dalla luce.

Dopo un'ora a temperatura ambiente con oscillazione, lavare i campioni tre volte in TTBS fresco come dimostrato, seguito da un breve risciacquo in PBS e posizionare una goccia di reagente anti sbiadimento per recipiente su singoli bicchieri di copertura da 22 x 50 millimetri. Al microscopio, posizionare un recipiente in ogni goccia di reagente con l'endotelio rivolto verso il basso e coprire i recipienti con un vetrino da 22 x 75 millimetri per campione. Posizionare i vetrini su una salvietta da laboratorio pulita e coprirli con due pezzi di salvietta da laboratorio e 3,5 chilogrammi di peso per appiattire i vasi.

Dopo un massimo di cinque minuti, rimuovere il peso e rimuovere la soluzione in eccesso intorno ai vetrini. Quindi applicare lo smalto ai quattro angoli dei vetrini coprioggetti e posizionare i vetrini in una scatola per vetrini, con il vetrino coprioggetti rivolto verso l'alto. La mattina dopo usa più smalto per sigillare completamente i vetrini coprioggetto e visualizza i recipienti non appena lo smalto è asciutto.

Qui viene mostrata una tipica immagine di immuno florescenza en face di un endotelio doppiamente colorato con anticorpi anti caderina VE e anti-molecola di adesione cellulare vascolare e che illustra una singola sezione ottica di un'aorta di topo prelevata vicino all'apertura di un'arteria intercostale. Si noti la colorazione del contorno lineare verde alla giunzione di aderenza delle cellule endoteliali e la forte colorazione della molecola di adesione delle cellule vascolari all'apertura dell'arteria intercostale dove è noto che si verifica il flusso sanguigno disturbato. In queste immagini si può osservare la colorazione en face di una carotide sinistra parzialmente legata e di un'arteria destra non legata di controllo un giorno dopo l'intervento chirurgico, con un aumento della colorazione evidente della molecola di adesione cellulare antivascolare nel vaso legato.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una legatura parziale dell'arteria carotide sinistra e di fare preparazioni en face nei vasi sanguigni del topo. Portalo con la tua ottica ad altri piccoli animali. L'uso di preparati en face è ora limitato alla colorazione in immuno-florescenza, ma può essere utilizzato anche con altri metodi, ad esempio per lo studio di intere regioni dopo la colorazione del rigogolo o per esperimenti ex vivo.