Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie trasmesse dalle zanzare, ad esempio se una specie di zanzara è o meno un vettore concorrente per un determinato virus. Il vantaggio principale di questo metodo è che una grande quantità di zanzare può essere analizzata contemporaneamente, senza l'uso di animali da laboratorio come i topi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede capacità motorie che possono essere acquisite solo attraverso la pratica.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché i passaggi chiave sono difficili da imparare; Richiedono esperienza nella gestione di zanzare e virus e anche capacità motorie. Per iniziare, diluisci il brodo virale. Quindi, mescolare il sangue umano scaduto con fruttosio, siero bovino filtrato e il brodo virale.

Congelare 140 microlitri di miscela di farina di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50. Quindi, metti due goccioline da 50 microlitri della miscela di farina di sangue in una fiala di plastica e lascia che le zanzare si nutrano per due ore. Dopo aver anestetizzato le zanzare, conta gli individui completamente gonfi e trasferiscili in una nuova fiala contenente un batuffolo di cotone imbevuto di fruttosio.

Quindi, mantieni le zanzare a 27 gradi Celsius e all'80% di umidità per 14 o 21 giorni. Reintegrare i dischetti di cotone saturi di fruttosio ogni 72 ore con 1,5 millilitri di fruttosio. Innanzitutto, seminare 20.000 cellule Vero per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con terreno di crescita integrato.

Per preparare il dispositivo di salivazione, posizionare una lastra di vetro quadrata sulla panca con un angolo di 30 gradi. Quindi, far aderire il nastro biadesivo alla parte superiore della lastra di vetro. Quindi, arrotolare l'argilla da modellare fino a ottenere un diametro di 0,5 centimetri e fissarla alla piastra orizzontalmente a un centimetro di distanza dal nastro biadesivo.

Tagliare le punte dal numero richiesto di punte filtranti da 10 microlitri e riempire ciascuna punta con 10 microlitri di PBS. Quindi, posiziona le punte sulla pasta da modellare e fissale con una leggera pressione. Quindi, immobilizza le zanzare rimuovendo le zampe e le ali.

Fissare le zanzare al nastro sopra le punte del filtro. Posiziona delicatamente la proboscide di ogni zanzara in una punta del filtro. Dopo 30 minuti, rimuovere le punte del filtro e scartare l'argilla e il nastro adesivo.

Trasferire la saliva raccolta in provette di reazione contenenti 10 microlitri di PBS. Mescolare delicatamente la saliva e il PBS e trasferire la miscela nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra per sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Utilizzando un microscopio ottico, controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico. Una volta che un pozzetto è positivo per l'effetto citopatico, utilizzare una pipetta per raccogliere 140 microlitri di surnatante. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta di reazione.

Successivamente, mescolare 140 microlitri di surnatante con 560 microlitri di tampone AVL e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, aggiungere 560 microlitri di etanolo e capovolgere il campione per mescolare. Utilizzando questo protocollo, diverse specie di zanzare sono state testate per l'infezione e la trasmissione del virus Zika in varie condizioni climatiche.

In condizioni di incubazione a 27 gradi Celsius, tutte le specie di Aedes hanno mostrato saliva positiva al virus Zika. Al contrario, nessuno dei campioni di saliva dei taxa Culex conteneva prove del virus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per 50 zanzare in un'ora se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di salivazione forzata. Non dimenticare che lavorare con zanzare infette può essere molto pericoloso, quindi è necessario adottare sempre misure di sicurezza speciali per la manipolazione delle zanzare in condizioni BSA-3 durante l'esecuzione di qualsiasi esperimento.