Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare
7 agosto 2018
Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie trasmesse dalle zanzare, ad esempio se una specie di zanzara è o meno un vettore concorrente per un determinato virus. Il vantaggio principale di questo metodo è che una grande quantità di zanzare può essere analizzata contemporaneamente, senza l'uso di animali da laboratorio come i topi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede capacità motorie che possono essere acquisite solo attraverso la pratica.
La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché i passaggi chiave sono difficili da imparare; Richiedono esperienza nella gestione di zanzare e virus e anche capacità motorie. Per iniziare, diluisci il brodo virale. Quindi, mescolare il sangue umano scaduto con fruttosio, siero bovino filtrato e il brodo virale.
Congelare 140 microlitri di miscela di farina di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50. Quindi, metti due goccioline da 50 microlitri della miscela di farina di sangue in una fiala di plastica e lascia che le zanzare si nutrano per due ore. Dopo aver anestetizzato le zanzare, conta gli individui completamente gonfi e trasferiscili in una nuova fiala contenente un batuffolo di cotone imbevuto di fruttosio.
Quindi, mantieni le zanzare a 27 gradi Celsius e all'80% di umidità per 14 o 21 giorni. Reintegrare i dischetti di cotone saturi di fruttosio ogni 72 ore con 1,5 millilitri di fruttosio. Innanzitutto, seminare 20.000 cellule Vero per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con terreno di crescita integrato.
Per preparare il dispositivo di salivazione, posizionare una lastra di vetro quadrata sulla panca con un angolo di 30 gradi. Quindi, far aderire il nastro biadesivo alla parte superiore della lastra di vetro. Quindi, arrotolare l'argilla da modellare fino a ottenere un diametro di 0,5 centimetri e fissarla alla piastra orizzontalmente a un centimetro di distanza dal nastro biadesivo.
Tagliare le punte dal numero richiesto di punte filtranti da 10 microlitri e riempire ciascuna punta con 10 microlitri di PBS. Quindi, posiziona le punte sulla pasta da modellare e fissale con una leggera pressione. Quindi, immobilizza le zanzare rimuovendo le zampe e le ali.
Fissare le zanzare al nastro sopra le punte del filtro. Posiziona delicatamente la proboscide di ogni zanzara in una punta del filtro. Dopo 30 minuti, rimuovere le punte del filtro e scartare l'argilla e il nastro adesivo.
Trasferire la saliva raccolta in provette di reazione contenenti 10 microlitri di PBS. Mescolare delicatamente la saliva e il PBS e trasferire la miscela nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra per sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Utilizzando un microscopio ottico, controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico. Una volta che un pozzetto è positivo per l'effetto citopatico, utilizzare una pipetta per raccogliere 140 microlitri di surnatante. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta di reazione.
Successivamente, mescolare 140 microlitri di surnatante con 560 microlitri di tampone AVL e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, aggiungere 560 microlitri di etanolo e capovolgere il campione per mescolare. Utilizzando questo protocollo, diverse specie di zanzare sono state testate per l'infezione e la trasmissione del virus Zika in varie condizioni climatiche.
In condizioni di incubazione a 27 gradi Celsius, tutte le specie di Aedes hanno mostrato saliva positiva al virus Zika. Al contrario, nessuno dei campioni di saliva dei taxa Culex conteneva prove del virus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per 50 zanzare in un'ora se eseguita correttamente.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di salivazione forzata. Non dimenticare che lavorare con zanzare infette può essere molto pericoloso, quindi è necessario adottare sempre misure di sicurezza speciali per la manipolazione delle zanzare in condizioni BSA-3 durante l'esecuzione di qualsiasi esperimento.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per analizzare la competenza vettoriale di zanzare, in particolare di Aedes albopictus e di diverse specie del genere Culex, nella trasmissione del virus Zika. La tecnica della salivazione forzata consente l'analisi simultanea di più zanzare senza l'uso di animali da laboratorio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dei vettori
- Virologia
- Malattie trasmesse da zanzare
Sfondo
- La comprensione della competenza vettoriale è fondamentale per il controllo dei virus trasmessi dalle zanzare.
- La salivazione forzata è un metodo innovativo per valutare il potenziale di trasmissione delle zanzare.
- I metodi precedenti richiedevano spesso l'uso di animali da laboratorio, che questa tecnica mira ad eliminare.
- Abilità di motricità fine sono essenziali per questo metodo, richiedendo pratica ed esperienza.
Scopo dello studio
- Valutare la competenza vettoriale di diverse specie di zanzare nei confronti del virus Zika.
- Dimostrare un metodo che consenta l'analisi ad alto rendimento della saliva delle zanzare.
- Fornire una guida visiva per i ricercatori alle prime armi con questa tecnica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una miscela ematica per l'alimentazione dei zanzare.
- Tecnica di salivazione forzata per raccogliere la saliva dalle zanzare.
- Metodi di coltura cellulare per valutare la presenza del virus Zika.
- Incubazione e analisi dei campioni per effetti citopatici.
Risultati principali
- Le specie di Aedes hanno mostrato saliva positiva per il virus Zika in condizioni controllate.
- I taxa di Culex non hanno mostrato evidenza del virus Zika nella loro saliva.
- Il metodo consente di testare fino a 50 zanzare in un'ora, una volta padroneggiato.
- Le dimostrazioni visive agevolano notevolmente l'apprendimento della tecnica.
Conclusioni
- La salivazione forzata è un metodo efficace per lo studio della trasmissione dei virus trasmessi dalle zanzare.
- La formazione e la pratica sono essenziali per l'attuazione corretta della tecnica.
- È necessario rispettare le misure di sicurezza quando si maneggiano zanzare infette.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I saggi di salivazione forzata consentono una valutazione ad alto rendimento della competenza vettoriale delle zanzare senza l'uso di modelli animali, supportando la validazione precoce degli obiettivi nella scoperta di antivirali. Il metodo permette la rilevazione quantitativa di virus in grado di replicarsi, ottenuta da singoli insetti, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione di candidati profilattici o terapeutici contro gli arbovirus. La scalabilità e la riproducibilità del metodo aumentano la fiducia predittiva nella riduzione del rischio preclinico di interventi bloccanti la trasmissione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando il potenziale di trasmissione virale in singoli vettori della malattia.
- Valore operativo: Permette la riduzione del rischio biologico degli obiettivi attraverso la valutazione diretta della competenza vettoriale in condizioni controllate.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando le specie di vettori non competenti, riducendo i falsi positivi nei programmi su arbovirus.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening antivirale successivo, confermando la suscettibilità al virus nei modelli vettore.
- Valore operativo: Standardizza il prelievo di saliva e il rilevamento del virus, garantendo risultati quantitativi riproducibili su grandi coorti di zanzare.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma per la valutazione ad alto rendimento di composti o vaccini inibitori della trasmissione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea ai sistemi rilevanti per le malattie testando la competenza vettoriale a temperature epidemiologicamente rilevanti (18–27°C).
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica tramite letture virali basate sulla saliva coerenti.
- Contenimento del rischio: Informa le decisioni di avanzamento stabilendo soglie di trasmissione dipendenti dalla temperatura per i candidati principali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo della salivazione forzata si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla convalida del bersaglio all'identificazione dei composti promettenti fino alla valutazione preclinica, in particolare per interventi diretti contro gli arbovirus.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi quantificando la presenza del virus nella saliva delle zanzare come indicatore funzionale del potenziale trasmissivo.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio attraverso la raccolta standardizzata della saliva e il rilevamento del virus, equivalente al TCID50, in cellule Vero.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (titolo virale nella saliva) che consentono confronti tra specie, ceppi e condizioni ambientali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica tramite dati di trasmissione stratificati per temperatura che rispecchiano finestre di trasmissione rilevanti per il campo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per lo screening di diversi arbovirus (ad esempio, ZIKV, DENV, CHIKV) su diverse specie di vettori senza necessità di riottimizzazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella biologia della trasmissione.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità tra gruppi di entomologia e virologia.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi antivirali.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate su dati empirici di competenza vettoriale.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nella gestione delle zanzare, in virologia e in tecniche microchirurgiche in condizioni di contenimento BSL-3.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi dispositivi per la salivazione, incubatori con controllo preciso dell'umidità e microscopia per la valutazione degli effetti citopatici.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla preparazione del pasto ematico, ai tempi di incubazione e agli intervalli di raccolta della saliva.
- Le considerazioni per l'adattamento includono le dimensioni specifiche del pungiglione, il comportamento alimentare e la morfologia delle ghiandole salivari nei diversi modelli di vettore.
- I limiti pratici comprendono la necessità di un addestramento esteso per raggiungere competenza e la dipendenza del metodo dal recupero di virus vitali dalla saliva.
