Name: Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Impara la tecnica di salivazione forzata per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e Culex per il virus Zika. Questo metodo consente di testare fino a 50 zanzare all'ora senza utilizzare animali da laboratorio.

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Ringraziamo Ella Weinert, Michelle Helms e Marlis Badusche per l'eccellente assistenza tecnica, Jessica Börstler per analisi di zanzare Culex , Norbert Becker e Björn Pluskota per la fornitura di Aedes albopictus uova e Olli Vapalahti per fornendo lo stock di virus. ML è stato sostenuto dall'associazione Leibniz; concessione numero SAW-2014-SGN-3.

1. preparare le zanzare femmina
<ol><li>Raccogliere le zanzare da una gabbia grande utilizzando un aspiratore (circa 400 zanzare per grande gabbia).</li>
	<li>Anestetizzare le zanzare con l'anidride carbonica (CO2) per 7 s.</li>
	<li>Ordinare 20 femmine per flaconcino in plastica (Ø 50 mm × 100 mm). Nota: Se le zanzare si svegliano, utilizzare un altro 3 s di CO2.
</li>
	<li>Morire di fame le zanzare durante la notte.</li>
</ol>2. artificiale farine di sangue
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>
Preparare il pasto di sangue infettivo.
	<ol>
<li>Diluire lo stock di virus alla concentrazione di 1 x 108 placca formando unità (PFU) / mL. Nota: La concentrazione di magazzino è stata determinata eseguendo il metodo di coltura del tessuto infezione dose 50 (TCID50) e calcolata da Spearman & Kärber algoritmo10,11.</li>
		<li>Mix scaduto sangue umano (conservazione del sangue) dalla banca del sangue (non adatto per umano piu ', ma utile per le zanzare) con fruttosio (soluzione all'8%), filtrato siero bovino (FBS) e soluzione di lavoro dello stock virus (umano sangue: fruttosio: FBS è scaduto: soluzione di lavoro = 5:3:1:1). Nota: Abbiamo scelto il sangue umano, perché questo è l'ospite mammifero naturale noto di ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congelare 140 µ l di miscela di farine di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50.</li>
	<li>
Eseguire la nutrizione artificiale utilizzando diversi metodi di alimentazione, a seconda della specie:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: utilizzare una membrana sistema di alimentazione per 30 min (1 mL / alimentatore).</li>
		<li>
Culex spp.: fornire il sangue infettivo tramite un bastoncino di cotone durante la notte e non riscaldare il sangue (300 µ l per flaconcino).</li>
		<li>
Aedes albopictus: mettere due gocce (50 µ l) del mix di farine di sangue nella fiala di plastica e lasciare che le zanzare feed per 2 h. Non riscaldare il sangue. Nota: Le zanzare confluiranno nel primo 15 min. Il tempo di incubazione prolungata è necessario per ragioni di sicurezza. Le goccioline di sangue vengono drenate dopo 2 h, che così si riduce il rischio di contaminazione durante l'ordinamento di alimentato le zanzare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestetizzare le zanzare con CO2 per 7 s. Nota: Se le zanzare si svegliano, utilizzare un altro 3 s di CO2.</li>
	<li>Ordinamento e totali completamente gonfio le zanzare in un nuovo flacone.</li>
	<li>Aggiungere un batuffolo di cotone, saturato di fruttosio (8% soluzione) tra il flaconcino e una spina.</li>
	<li>Mantenere le zanzare alla temperatura di 18 ° C o di 27 ° C dell'umidità dell'80% designata per 14 o 21 giorni.</li>
	<li>Nutrire le zanzare con tamponi di cotone saturato di fruttosio. Ricostituire ogni 72h con 1,5 mL di fruttosio (8% soluzione) per flaconcino (fino a 20 zanzare, a seconda l'alimentazione frequenza, vedere passaggio 2.5).</li>
</ol>3. costretto salivazione saggio il giorno 14 o 21
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>2 x 104 cellule Vero di semi / per pozzetto in un 96 bene piastra con 200 µ l di terreno di coltura (Dulbecco´s modificato supplementato eagle (DMEM) con 3% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 5 µ g/mL anfotericina B, 2 mM L-Glutammina 1% non essenziali aminoacidi (NEAA), piruvato di sodio 1%).</li>
	<li>
Preparare il dispositivo di salivazione:
	<ol>
<li>Posizionare una lastra di vetro quadrato (20 × 20 cm) sul banco in un angolo di 30°. Nota: Questa è necessaria a causa di depressione nel laboratorio di sicurezza. Se la piastra è orizzontale o verticale, sarà perdita di liquido.</li>
		<li>Posizionare il nastro biadesivo sulla parte superiore della lastra di vetro.</li>
		<li>Ruolo l'argilla di modellistica fino a quando raggiunge un diametro di 0,5 cm e attaccarlo in orizzontale 1 cm di distanza il nastro adesivo su due lati.</li>
		<li>Tagliare i primi 0,3 cm della punta di una punta di filtro 10 µ l. Nota: Si consiglia di preparare questo prima di iniziare l'esperimento di fuori del laboratorio di biosicurezza.</li>
		<li>Riempire i puntali con filtro con 10 µ l di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4).</li>
		<li>Posizionare i puntali con filtro sull'argilla di modellistica con la punta verso il nastro adesivo.</li>
		<li>Fissare le punte di filtro con una leggera pressione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare le zanzare:
	<ol>
<li>Anestetizzare le zanzare con CO2.</li>
		<li>Rimuovere le gambe e le ali per immobilizzare le zanzare.</li>
		<li>Difficoltà la zanzara vivente corpi sul nastro appiccicoso sopra una punta di filtro.</li>
		<li>Inserire delicatamente la proboscide la punta del filtro.</li>
		<li>Eseguire il test di salivazione per 30 min.</li>
		<li>Rimuovere i puntali con filtro ed eliminare l'argilla e il nastro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. elaborazione della Saliva
Nota: Passaggi 4.1 – 4.6.2 vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>Espellere il contenuto nelle provette di reazione contenente 10 µ l di PBS.</li>
	<li>Mescolare delicatamente e trasferire il contenuto nei pozzetti della piastra ben 96 preparati utilizzando un pozzetto per campione.</li>
	<li>Incubare la piastra per 7 giorni a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Utilizzare il binocolo per controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico (CPE).</li>
	<li>Se il pozzo è positivo per CPE, raccogliere il surnatante di pipettaggio 140 µ l in una provetta di reazione per l'estrazione di RNA.</li>
	<li>
Purificare il RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA.
	<ol>
<li>Mix 140 µ l del surnatante con 560 µ l di AVL buffer (buffer di lisi virale) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>560 µ l di etanolo (96%) e vortexare il campione. Nota: I campioni sono inattivati dopo questo passaggio e possono essere scaricati dal laboratorio BSL-3.</li>
		<li>Dispensare 630 µ l del campione su una colonna e la centrifuga con 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Scartare il filtrato, dispensare il restante µ l 630 sulla colonna, quindi ripetere la centrifugazione.</li>
		<li>Lavare il RNA, associato alla membrana della colonna, aggiungendo 500 µ l di tampone 1 per la colonna e la centrifuga di lavaggio a 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 2 e centrifugare a 12.500 x g per 3 min.</li>
		<li>Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta di reazione di 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di tampone di eluizione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare a 6.000 x g per 1 min e poi scartare la colonna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare i campioni per ZIKV RNA tramite RT-qPCR.</li>
</ol>5. il trattamento dei corpi di zanzara
Nota: Passaggi 5.1 – 5.5 vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>Rimuovere i corpi della zanzara e collocare ogni corpo in una provetta di reazione. Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di media di omogeneizzazione (DMEM senza eventuali supplementi) nella provetta di reazione.</li>
	<li>Omogeneizzare il corpo usando motore sbattitore e utilizzare un pistillo nuovo per ogni campione.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di omogenato in una piastra a 96 pozzetti per la purificazione. Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.</li>
	<li>Inattivare la piastra mediante incubazione per 60 min a 60 ° C.</li>
	<li>Purificare il RNA da purificazione automatizzata degli acidi nucleici. Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.</li>
</ol>6. analisi
<ol><li>Quantificare le copie di RNA virale usando RT-qPCR. Nota: Le copie di RNA erano una media sopra tutti i corpi di zanzara ZIKV-positiva e senza includere le zanzare ZIKV-negativi.</li>
	<li>Calcolare l'IR, definito come il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di femmine nutrite.</li>
	<li>Calcolare il TR, definito come il numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi. Impossibile calcolare la velocità di trasmissione per combinazioni di specie e temperatura con nessun corpo ZIKV-positivi.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region">http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region</a> (2016).</li>
<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
<li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li>
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<li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li>
<li>Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Eurovsurveillance%22%5BJournal%5D)">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li>
<li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124653306500038">Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual</a>. , (1996).</li>
<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
<li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites & Vectors. 8, 463(2015).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeger-Lucarelli%2C+J+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22">PLOS Neglected Tropical Diseases</a>. Turell, M. J. 10 (10), (2016).</li>
<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Precedentemente è stato indicato che i risultati ottenuti con salivazione forzata sono in linea con la classica rialimentazione esperimenti6. Tuttavia, ri-alimentazione esperimenti sia in nostro metodo presentato della salivazione forzata, è Impossibile direttamente prova attività salivazione o monitorare il rilascio di saliva. Per dimostrare l'attività di salivazione, campioni potrebbero essere testati per altri componenti presentano nella saliva (ad es., proteine, carboidrati, ecc.). Inoltre, ulteriori qPCRs dovrebbe consentire il rilevamento di copie di RNA virale. Questo, tuttavia, richiede frazionamento dei campioni di saliva per varie analisi, che possono limitare la sensibilità nell'analisi della cultura delle cellule in caso di numeri di particelle molto basso. A sua volta, questo potrebbe portare ad una sottovalutazione dei tassi di trasmissione determinato.
Per ottenere risultati riproducibili, è necessario garantire che tutte le zanzare rimanere in vita fino alla fine dell'esperimento. Questo è controllato controllando visivamente l'attività di movimento del corpo delle zanzare. Inoltre, l'uso del principio del dosaggio salivazione per una specie di zanzara dato deve essere testato alimentando virus di controllo, che sono conosciuti per essere trasmesso da questa specie di zanzara specifici. Viceversa, ogni virus introdotti in un esperimento deve essere testato in una zanzara suscettibile.
Saggi di salivazione forzata hanno molti vantaggi. Un numero elevato di zanzare possa essere testato contemporaneamente su un singolo esemplare base in condizioni standardizzate controllate senza entrare in conflitto con norme di benessere degli animali9.
Il metodo è utilizzato da diversi laboratori. Tuttavia, messe a punto esatti può variare, che può portare a differenze nei risultati tra i laboratori. Un componente critico è il capillare per raccogliere la saliva, che può essere fatto di vetro14 o plastica15. Per rispettare le norme di sicurezza ad alta di un insectary di livello 3 di biosicurezza, abbiamo usato plastica puntali con filtro invece di tubi capillari in vetro, riducendo così il rischio di lesioni. Inoltre, puntali con filtro hanno il vantaggio che il liquido raccolto possa essere trasferito facilmente utilizzando una pipetta.
L'installazione del dosaggio salivazione forzata qui presentato è basato su due ricercatori lavorano insieme e la condivisione di compiti. Smobilitazione della zanzara viene eseguita da una sola persona, mentre l'altro prepara simultaneamente l'installazione forzata salivazione. Ciò notevolmente riduce i tempi di movimentazione e minimizza il rischio di campione di commutazione come cambiare tra la smobilitazione-luogo di lavoro e la salivazione-piastra non è necessario. Inoltre, esso consente di posizionare le zanzare sul dispositivo salivazione forzato immediatamente dopo la smobilitazione. Questa zanzara piuttosto breve tempo di trattamento è essenziale per il successo salivazione forzata. Infine, le zanzare possono essere controllate direttamente per motilità in tutta l'intero esperimento.
Il dosaggio di salivazione presentato qui è usato per avere una chiara comprensione del potenziale vettoriale di specie di zanzare. Tuttavia, per rispondere a domande specifiche (ad es., i numeri di punture di zanzare che sono necessari per infettano i vertebrati), animale esperimenti potrebbero essere ancora necessari.

Nel 2015, virus di Zika (ZIKV), un virus zanzara (mobovirus), appartenente alla famiglia dei Flaviviridae, emerse in Colombia e in Brasile e si diffuse rapidamente in tutta l'America e i Caraibi, causando un'epidemia con un notevole numero di associati casi clinici di microcefalia e sindrome di Guillain-Barré1. Le zanzare della specie Aedes aegypti e Aedes albopictus sono considerate i vettori primari e secondari di ZIKV2, ma altre specie del genere Aedes hanno anche dimostrato di avere competenza vettoriale sperimentale3 . A differenza delle specie Aedes , la maggior parte della specie Culex testato finora non sono in grado di trasmettere il virus4. Semplicemente, i dati per Culex quinquefasciatus fornito risultati inconcludenti3. Allo stato attuale, manca un'informazione su competenza vettoriale zanzara per ZIKV in condizioni di temperatura moderata (< 20 ° C). Tuttavia, queste informazioni sono notevole per le valutazioni del rischio di spread possibili alle regioni con clima temperato come l'Europa centrale.
Un vettore competente per ZIKV è in grado di acquisire, mantenere, amplificare e infine trasmettere il virus. Di conseguenza, test zanzara corpi o parti di corpi, tra le gambe, del midgut, testa o ghiandole salivari, per ZIKV non è sufficiente per determinare la competenza vettoriale. È obbligatorio per verificare per particelle virali infettive all'interno della saliva rilasciata. Per valutare la competenza vettoriale, sia il tasso di infezione (IR, numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di zanzare gonfio) e velocità di trasmissione (TR, numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi), devono essere determinato. IRs di zanzare possono essere facilmente analizzati dalle zanzare semplicemente omogeneizzazione, seguite da una reazione a catena d'inversione-transcriptase della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) ZIKV di targeting. Inoltre, l'infezione può essere ulteriormente caratterizzato determinando i numeri di copia virale per zanzare. Al contrario, l'analisi dei tassi di trasmissione si basa sulla rilevazione delle particelle di virus vitale nella saliva delle zanzare individuali. Ciò può essere ottenuto alimentandosi di zanzare infette su animali ospite suscettibile, seguiti dall'analisi della viremia in host5. Tuttavia, questo metodo si basa sugli organismi di modello adatto ed è costoso e limitato dalle norme di benessere degli animali. Per evitare l'uso degli animali da laboratorio per l'analisi dei tassi di trasmissione e di ridurre i costi, ri-sistemi di alimentazione artificiale usando il sangue le goccioline sono stati descritti6. Tuttavia, test su scala individuale combinato con un elevato numero di individui è difficile e richiede tempo. La prima descrizione di un dosaggio di salivazione su scala individuale è stata pubblicata nel 19667 e durante gli anni recenti, salivazione forzata esperimenti sono diventati il metodo di scelta per valutare la competenza di vettore di zanzare3,8 .
Basato sul nostro studio di competenza vettoriale di Europa centrale le zanzare recentemente pubblicato9, descriviamo forzata salivazione, come riportato da Anderson et al. 8 con alcune modifiche. Questo metodo consente a resa elevata standardizzata esperimenti in condizioni di biosicurezza alto livello (BSL-3) e include l'identificazione del virus attivo di cultura basata su cellule saggi. Gli esperimenti descritti qui includono 856 zanzare. Sono stati infettati con ZIKV da farine di sangue artificiale e successivamente analizzati per la presenza di particelle virali infettive nella saliva. Le zanzare introdotte in esperimenti comprendeva due laboratorio consolidata popolazioni di biotipo Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens molestus (Cx. p. molestus), come pure il campo catturato Culex pipiens pipiens biotipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e due popolazioni di Ae. albopictus . Con l'eccezione di una delle due popolazioni Ae. albopictus , che è stato raccolto in Italia, tutte le zanzare sono stati raccolte in Germania.

<table><tbody><tr><td>Inject + matic Sleeper</td><td>Inject + matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Gabbia per l'allevamento di insetti</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi di coltivazione Drosophila</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>fiala di plastica per zanzare</td></tr><tr><td>Plug per tubi di coltivazione drosophila</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Camera climatica costante</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Sangue</td><td></td><td></td><td>umano conservato, scaduto, non utilizzabile per applicazioni mediche</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>nastro</td><td></td><td></td> biadesivo <td>nessun fornitore specifico</td></tr><tr><td>Gammex Guanti senza polvere con AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>per motivi di sicurezza necessario durante il lavoro con le punture nel laboratorio BSL3</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostica</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td></td><td>4462359 Isolamento dell'RNA dei corpi delle zanzare</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolamento del filtro surnatante</td></tr><tr><td> punte (20 &micro; L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Tagliare i primi 3 mm della punta del</td></tr><tr><td>motore manuale mixer</td><td>carl roth</td><td>esaurito</td><td></td></tr><tr><td>micro pestelli per motore manuale</td><td>mixer carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutammina Penicilina/Streptomicina</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fruttosio</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr> P0832100 <tr><td>Hemotek Hemotek</td><td></td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Argilla</td><td></td><td></td><td>da modellare nessun fornitore specifico</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Sistema di purificazione</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aedes albopictus</td><td></td><td></td><td>le uova sono state raccolte a Friburgo, Germania</td></tr><tr><td>Binocolo</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Lampada binoculare</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Competenza vettoriale è definito come il potenziale di una specie di zanzara per trasmettere un virus zanzara (mobovirus) ad un ospite vertebrato. Particelle di virus vitale vengono trasmessi durante un pasto di sangue tramite la saliva di una zanzara infetta. Saggi di salivazione forzata consentono di stabilire il potenziale di vettore sulla base di singole zanzare, evitando l'uso di esperimenti sugli animali. Il metodo è adatto per analizzare un gran numero di zanzare in un esperimento entro un breve periodo di tempo. Analisi di salivazione forzata sono state usate per analizzare 856 individuali zanzare intrappolate in Germania, tra cui due diversi biotipi di Culex pipiens pipiens , Culex torrentium nonché Aedes albopictus, che sono stati infettati sperimentalmente con il virus di Zika (ZIKV) e incubate a 18 ° C o 27 ° C per due o tre settimane. I risultati hanno indicato la mancanza di competenza vettoriale dei taxa diversi Culex per ZIKV. Al contrario, Aedes albopictus era suscettibile di ZIKV, ma solo a 27 ° C, con velocità di trasmissione simile a una colonia di laboratorio di Aedes aegypti testata in parallelo.

Aedes aegypti è noto come vettore competente per ZIKV almeno sotto condizioni climatiche tropicali12. Di conseguenza, abbiamo usato Ae. aegypti come controllo positivo per stabilire il dosaggio e analizzare IRs come pure TRs a una temperatura di incubazione di 27 ° C e un'umidità dell'80%. IR e TR sono stati definiti come precedentemente descritto da Fortuna et al. 13. contestato Ae. aegypti ha mostrato IR del 50% e 72% e TR del 42% e 31% a 14 e 21 giorni post infezione (dpi), rispettivamente (Figura 1A e 1B). Successivamente, le zanzare europee sono state testate per infezione ZIKV e trasmissione utilizzando condizioni climatiche tropicali così come temperate.
Temperatura di incubazione di 27 ° C, tutte le specie di zanzare ha mostrato l'infezione di ZIKV alle 14 dpi, nonché 21 dpi, tranne Cx. p. pipiens e Cx. torrentium individui, che è stata positiva solo 14 dpi. Tutte le specie di Aedes ha mostrato maggiore IRs (tra 50% e 72%) così come più alta concentrazione di RNA virale (106 fino a 10 campioni di copie/zanzara9 RNA) in confronto i diversi taxa di Culex , che ha rivelato IRs che varia tra 0 % e 32% e carichi virali di 103 a 10 esemplari di4 RNA copie/zanzara. Tutte le specie di Aedes visualizzato saliva ZIKV-positiva (TR 13 – 42%), mentre nessuno dei campioni di saliva dai taxa di Culex contenute ZIKV (Figura 1A e 1B). Interessante, velocità di trasmissione alle 21 dpi erano simili in Ae. aegypti e Ae. albopictus dalla Germania (30%), ma erano sostanzialmente più bassi in Ae. albopictus dall'Italia (13%).
Incubazione di zanzare sfidate ad una temperatura moderata di 18 ° C ha rivelato generalmente inferiore virus viene caricato nelle specie Aedes (4– 10 106 RNA copie/zanzara) così come in diversi taxa di Culex (102 –104 RNA copie/zanzara). Tuttavia, alla temperatura di incubazione di 18 ° C, trasmissione di ZIKV non è stata osservata per una delle specie di zanzara studiato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figura 1: tassi di trasmissione di zanzare infettati sperimentalmente con ZIKV. Risultati di studi di competenza vettoriale con ZIKV in specie diverse zanzare. Sei zanzara diversi taxa sono stati infettati con ZIKV e incubate a 27 ° C, 18 ° C per 14 (A) o 21 (B) giorni. TR è definito come il numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi. Il numero totale di zanzare studiato era 856, con un minimo di 30 persone per ogni taxa di zanzara/temperatura/punto di tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.

Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie trasmesse dalle zanzare, ad esempio se una specie di zanzara è o meno un vettore concorrente per un determinato virus. Il vantaggio principale di questo metodo è che una grande quantità di zanzare può essere analizzata contemporaneamente, senza l'uso di animali da laboratorio come i topi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede capacità motorie che possono essere acquisite solo attraverso la pratica.La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché i passaggi chiave sono difficili da imparare; Richiedono esperienza nella gestione di zanzare e virus e anche capacità motorie. Per iniziare, diluisci il brodo virale. Quindi, mescolare il sangue umano scaduto con fruttosio, siero bovino filtrato e il brodo virale.Congelare 140 microlitri di miscela di farina di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50. Quindi, metti due goccioline da 50 microlitri della miscela di farina di sangue in una fiala di plastica e lascia che le zanzare si nutrano per due ore. Dopo aver anestetizzato le zanzare, conta gli individui completamente gonfi e trasferiscili in una nuova fiala contenente un batuffolo di cotone imbevuto di fruttosio.Quindi, mantieni le zanzare a 27 gradi Celsius e all'80% di umidità per 14 o 21 giorni. Reintegrare i dischetti di cotone saturi di fruttosio ogni 72 ore con 1,5 millilitri di fruttosio. Innanzitutto, seminare 20.000 cellule Vero per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con terreno di crescita integrato.Per preparare il dispositivo di salivazione, posizionare una lastra di vetro quadrata sulla panca con un angolo di 30 gradi. Quindi, far aderire il nastro biadesivo alla parte superiore della lastra di vetro. Quindi, arrotolare l'argilla da modellare fino a ottenere un diametro di 0,5 centimetri e fissarla alla piastra orizzontalmente a un centimetro di distanza dal nastro biadesivo.Tagliare le punte dal numero richiesto di punte filtranti da 10 microlitri e riempire ciascuna punta con 10 microlitri di PBS. Quindi, posiziona le punte sulla pasta da modellare e fissale con una leggera pressione. Quindi, immobilizza le zanzare rimuovendo le zampe e le ali.Fissare le zanzare al nastro sopra le punte del filtro. Posiziona delicatamente la proboscide di ogni zanzara in una punta del filtro. Dopo 30 minuti, rimuovere le punte del filtro e scartare l'argilla e il nastro adesivo.Trasferire la saliva raccolta in provette di reazione contenenti 10 microlitri di PBS. Mescolare delicatamente la saliva e il PBS e trasferire la miscela nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra per sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Utilizzando un microscopio ottico, controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico. Una volta che un pozzetto è positivo per l'effetto citopatico, utilizzare una pipetta per raccogliere 140 microlitri di surnatante. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta di reazione.Successivamente, mescolare 140 microlitri di surnatante con 560 microlitri di tampone AVL e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, aggiungere 560 microlitri di etanolo e capovolgere il campione per mescolare. Utilizzando questo protocollo, diverse specie di zanzare sono state testate per l'infezione e la trasmissione del virus Zika in varie condizioni climatiche.In condizioni di incubazione a 27 gradi Celsius, tutte le specie di Aedes hanno mostrato saliva positiva al virus Zika. Al contrario, nessuno dei campioni di saliva dei taxa Culex conteneva prove del virus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per 50 zanzare in un'ora se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di salivazione forzata. Non dimenticare che lavorare con zanzare infette può essere molto pericoloso, quindi è necessario adottare sempre misure di sicurezza speciali per la manipolazione delle zanzare in condizioni BSA-3 durante l'esecuzione di qualsiasi esperimento.

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Impara la tecnica di salivazione forzata per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e Culex per il virus Zika. Questo metodo consente di testare fino a 50 zanzare all'ora senza utilizzare animali da laboratorio.

Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

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