Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare
August 7th, 2018
Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie trasmesse dalle zanzare, ad esempio se una specie di zanzara è o meno un vettore concorrente per un determinato virus. Il vantaggio principale di questo metodo è che una grande quantità di zanzare può essere analizzata contemporaneamente, senza l'uso di animali da laboratorio come i topi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede capacità motorie che possono essere acquisite solo attraverso la pratica.
La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché i passaggi chiave sono difficili da imparare; Richiedono esperienza nella gestione di zanzare e virus e anche capacità motorie. Per iniziare, diluisci il brodo virale. Quindi, mescolare il sangue umano scaduto con fruttosio, siero bovino filtrato e il brodo virale.
Congelare 140 microlitri di miscela di farina di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50. Quindi, metti due goccioline da 50 microlitri della miscela di farina di sangue in una fiala di plastica e lascia che le zanzare si nutrano per due ore. Dopo aver anestetizzato le zanzare, conta gli individui completamente gonfi e trasferiscili in una nuova fiala contenente un batuffolo di cotone imbevuto di fruttosio.
Quindi, mantieni le zanzare a 27 gradi Celsius e all'80% di umidità per 14 o 21 giorni. Reintegrare i dischetti di cotone saturi di fruttosio ogni 72 ore con 1,5 millilitri di fruttosio. Innanzitutto, seminare 20.000 cellule Vero per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con terreno di crescita integrato.
Per preparare il dispositivo di salivazione, posizionare una lastra di vetro quadrata sulla panca con un angolo di 30 gradi. Quindi, far aderire il nastro biadesivo alla parte superiore della lastra di vetro. Quindi, arrotolare l'argilla da modellare fino a ottenere un diametro di 0,5 centimetri e fissarla alla piastra orizzontalmente a un centimetro di distanza dal nastro biadesivo.
Tagliare le punte dal numero richiesto di punte filtranti da 10 microlitri e riempire ciascuna punta con 10 microlitri di PBS. Quindi, posiziona le punte sulla pasta da modellare e fissale con una leggera pressione. Quindi, immobilizza le zanzare rimuovendo le zampe e le ali.
Fissare le zanzare al nastro sopra le punte del filtro. Posiziona delicatamente la proboscide di ogni zanzara in una punta del filtro. Dopo 30 minuti, rimuovere le punte del filtro e scartare l'argilla e il nastro adesivo.
Trasferire la saliva raccolta in provette di reazione contenenti 10 microlitri di PBS. Mescolare delicatamente la saliva e il PBS e trasferire la miscela nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra per sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Utilizzando un microscopio ottico, controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico. Una volta che un pozzetto è positivo per l'effetto citopatico, utilizzare una pipetta per raccogliere 140 microlitri di surnatante. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta di reazione.
Successivamente, mescolare 140 microlitri di surnatante con 560 microlitri di tampone AVL e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, aggiungere 560 microlitri di etanolo e capovolgere il campione per mescolare. Utilizzando questo protocollo, diverse specie di zanzare sono state testate per l'infezione e la trasmissione del virus Zika in varie condizioni climatiche.
In condizioni di incubazione a 27 gradi Celsius, tutte le specie di Aedes hanno mostrato saliva positiva al virus Zika. Al contrario, nessuno dei campioni di saliva dei taxa Culex conteneva prove del virus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per 50 zanzare in un'ora se eseguita correttamente.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di salivazione forzata. Non dimenticare che lavorare con zanzare infette può essere molto pericoloso, quindi è necessario adottare sempre misure di sicurezza speciali per la manipolazione delle zanzare in condizioni BSA-3 durante l'esecuzione di qualsiasi esperimento.
Panoramica
Questo articolo discute un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare, in particolare Aedes albopictus e vari taxa di Culex, per la trasmissione del virus Zika. La tecnica della salivazione forzata consente l'analisi simultanea di molteplici zanzare senza l'uso di animali da laboratorio.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Biologia vettoriale
- Virologia
- Malattie trasmesse dalle zanzare
Contesto
- Comprendere la competenza vettoriale è cruciale per il controllo dei virus trasmessi dalle zanzare.
- La salivazione forzata è un metodo nuovo per valutare il potenziale di trasmissione delle zanzare.
- I metodi precedenti richiedevano spesso animali da laboratorio, cosa che questa tecnica mira a eliminare.
- Le abilità motorie fini sono essenziali per questo metodo, richiedendo pratica ed esperienza.
Obiettivo dello studio
- Valutare la competenza vettoriale di diverse specie di zanzare per il virus Zika.
- Dimostrare un metodo che consenta un'analisi ad alto rendimento della saliva delle zanzare.
- Fornire una guida visiva per i ricercatori nuovi alla tecnica.
Metodi utilizzati
- Preparazione di un mix di sangue per l'alimentazione delle zanzare.
- Tecnica di salivazione forzata per raccogliere la saliva dalle zanzare.
- Metodi di coltura cellulare per valutare la presenza del virus Zika.
- Incubazione e analisi dei campioni per gli effetti citopatici.
Risultati principali
- Le specie di Aedes hanno mostrato saliva positiva per il virus Zika in condizioni controllate.
- I taxa di Culex non hanno mostrato prove di virus Zika nella loro saliva.
- Il metodo consente di testare fino a 50 zanzare in un'ora una volta padroneggiato.
- Le dimostrazioni visive aiutano significativamente nell'apprendimento della tecnica.
Conclude
- La salivazione forzata è un metodo efficace per studiare la trasmissione dei virus trasmessi dalle zanzare.
- La formazione e la pratica sono essenziali per l'implementazione con successo della tecnica.
- Le misure di sicurezza devono essere rispettate quando si maneggiano zanzare infette.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
