Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

La trasmigrazione dei linfociti è una caratteristica importante di qualsiasi risposta immunitaria. Pertanto, questo protocollo è significativo perché consente a un ricercatore di valutare la mobilità dei linfociti in un sistema in vitro ben definito. Il vantaggio principale di questa tecnica è che varie chemiochine possono essere valutate per determinare la loro efficacia nell'indurre la migrazione in cellule definite di recente, come le cellule linfoidi innate del gruppo due, o ILC2.

Un secondo vantaggio è che gli inibitori o le terapie biologiche volte a bloccare particolari vie della chemiochina possono essere testati con questo metodo prima di fare esperimenti più costosi con gli animali. Inizia con l'accisa di polmoni e milza da topi maschi e femmine eutanasiati trattati con ovuli usando da due a tre animali per gruppo. Posizionare i tessuti asportati in tubi di dissociazione separati in base al tipo di tessuto e al sesso animale.

Posizionare il tessuto polmonare in 500 microlitri di mezzi di dissociazione polmonare in un tubo di dissociazione, posizionare il tubo nel dissociatore automatico dei tessuti e dissociarlo utilizzando il protocollo polmonare. Ripetere questi passaggi per un totale di due volte. Per dissociare il tessuto di milza, posizionarlo in 500 microlitri di mezzi RPMI completi nel dissociatore, quindi utilizzare il protocollo di milza.

Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico con tecnica sterile d'ora in poi, filtrare ogni tessuto dissociato attraverso un colino cellulare di 40 micrometri e raccogliere in tubi conici da 50 millilitri. Risciacquare i tubi di dissociazione contenenti omogeneati polmonari con cinque millilitri di mezzi aggiuntivi di dissociazione polmonare, tubi contenenti omogenati di milza con cinque millilitri di RPMI completo e filtrarne il contenuto attraverso i filtri utilizzati per i loro tessuti corrispondenti. Per dissociare ulteriormente il tessuto polmonare, incubare gli omogeneati polmonari per 15-30 minuti in un incubatore Celsius di 37 gradi con anidride carbonica al 5%.

Quindi aggiungere cinque millilitri di RPMI completo sia agli omogeneati polmonari che alla milza e alla centrifuga. Dopo aver scartato il supernatante, unire i pellet contenenti splenociti e cellule polmonari del gruppo di animali dello stesso sesso in un unico tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di RPMI completo a ciascun tubo e rimorsi.

Determinare il conteggio totale delle celle utilizzando un contatore di celle automatizzato. Regolare le sospensioni cellulari maschili e femminili a 100 milioni di cellule per millilitro nel tampone di separazione, quindi aggiungere a un tubo di polistirolo da cinque millilitri. Dopo aver isolato le cellule linfoidi innate del gruppo due da 2/3 delle cellule totali descritte nel manoscritto, utilizzare le cellule rimanenti per la procedura di isolamento delle cellule T positiva al CD4.

Per avviare l'isolamento positivo alle cellule T CD4, aggiungere il siero per topi alla sospensione di arricchimento cellulare CD4 T. Quindi aggiungere un cocktail di isolamento al campione di cellule e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Vortice sfere rapide per 30 secondi, e aggiungere al campione cellulare per ottenere una diluizione di 75 microlitri per millilitro.

Mescolare delicatamente e incubare per 2 minuti e mezzo a temperatura ambiente. Top i campioni con circa due millilitri di tampone di separazione fino a tre millilitri, posizionare i tubi da cinque millilitri nel magnete a separazione facile a otto camere e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi punta il magnete in avanti e pipetta ogni sospensione cellulare in un tubo pulito da cinque millilitri.

Aggiungere 1,5 millilitri di RPMI senza siero a ciascun tubo e centrifugare. Versare il supernatante e rimescolare il pellet di cellule T positivo al CD4 a 10 milioni di cellule per millilitro in RPMI senza siero. Per iniziare questa parte del protocollo, determinare il numero di inserti Transwell necessari per l'esperimento sia per le celle T POSITIVE ILC2 che CD4 come descritto nel manoscritto.

Spostare delicatamente gli inserti Transwell da tre micron dalle file centrali di una piastra da 24 pozzi alle file superiore e inferiore della stessa piastra da 24 po 'con punta di pipetta e mani guantate. Aggiungere 500 microlitri di supporti di migrazione con CCL17 a 1/3 dei pozzi nella fila centrale della piastra da 24 porri. Aggiungere 500 microlitri di supporti di migrazione con CCL22 ad altri 1/3 dei pozzi.

E infine, aggiungere 500 microlitri di RPMI senza siero senza chemiocine agli ultimi 1/3 dei pozzi. Etichettare chiaramente il coperchio sulla piastra con il nome dell'apposito supporto di trasmigrazione posto nei pozzi inferiori. Quindi, riposizionare gli inserti Transwell nei pozzi contenenti i vari trattamenti.

Aggiungere delicatamente 100 microlitri di celle CD4 T o ILC2 al pozzo superiore di ogni inserto, assicurandosi di non mescolare o pipettare la sospensione cellulare su e giù nei Transwell. Etichettare chiaramente il coperchio sulla piastra con il tipo di cella posto in ogni pozzo e scrivere la data e l'ora del giorno in cui le celle sono state aggiunte. Ripetere questo processo a partire dalla rimozione degli inserti Transwell dalla piastra fino a quando tutte le celle non sono state posizionate negli inserti Transwell con supporti.

Una volta isolate le cellule di interesse, i passaggi più importanti sono tenere traccia delle chemiochine e dei tipi di cellule che vengono posizionate in particolari pozzi, aggiungere delicatamente le cellule alle camere superiori e, infine, evitare il contatto non necessario con la piastra di trasmigrazione durante l'incubazione di 48 ore. Posizionare delicatamente la piastra in un incubatore Celsius di 37 gradi con anidride carbonica al 5% e incubare per 48 ore, assicurandosi di ridurre al minimo il contatto con la piastra durante il periodo di incubazione. Dopo aver rimosso delicatamente la piastra dall'incubatore, rimuovere tutti gli inserti Transwell dalle file centrali nei pozzi vuoti appena sopra o sotto.

Raccogliere le celle dai pozzi superiore e inferiore degli inserti Transwell in tubi etichettati con superiore o inferiore con CCL17, CCL22 o supporto, con il tipo di cella e con il numero di replica. Risciacquare i pozzi inferiori con 500 microlitri di 1x PBS, raccoglierlo nei tubi corrispondenti e fare lo stesso per i pozzi migliori. Centrifugare i tubi a 378 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.

Utilizzare una pipetta per rimuovere delicatamente tutto il supernatante, quindi rimescolare la cella T e i pellet ILC2 con 50 microlitri di 1x PBS. Dopo aver rimosso 10 microlitri della sospensione cellulare, aggiungere 90 microlitri dello 0,4% di trypan blu. Contare le celle nel contatore delle celle automatiche.

E per ogni campione, registrare la percentuale di vitalità e il numero di cellule per millilitro, e determinare il numero totale di cellule per trattamento nella camera superiore e inferiore. Quando l'espressione CCR4 è stata valutata sia sulle cellule T cd4-positive che sull'ILC2 per citometria del flusso, non c'erano differenze tra ospiti maschi e femmine. Tuttavia, l'espressione di CCR4 su base per cella su ILC2 era più alta rispetto alle cellule T positive del CD4.

Quando la camera inferiore dell'apparato Transwell era riempita con supporti di coltura cellulare non trattati, supporti contenenti CCL22 o supporti contenenti CCL17, meno del 14% delle celle migrava in condizioni di controllo dei supporti. In risposta al CCL22, entrambi i tipi di cellule, indipendentemente dal fatto che fossero ospiti maschi o femmine, hanno risposto al CCL22. Inoltre, il CCL22 ha indotto una migrazione maggiore rispetto al CCL17 nell'ILC2 maschile.

D'altra parte, il CCL17 ha indotto una migrazione significativa delle cellule T CD4 femminili e dell'ILC2 rispetto ai soli media. Il trattamento CCL17 non era diverso dai supporti per cellule T cd4 positive maschili o ILC2 maschile. In condizioni non ottimali, quando la piastra con celle CD4 è rimasta a temperatura ambiente per le prime 24 ore e poi si è spostata nell'incubatore, non c'è stata migrazione verso CCL22 e CCL17.

Inoltre, la vitalità delle cellule era notevolmente bassa per le celle nella camera inferiore, dimostrando l'importanza di utilizzare le temperature e le condizioni corrette descritte in questo protocollo per ottenere risultati ottimali. Una volta completata la procedura di trasmigrazione, si dovrebbe vedere una migrazione significativa alla chemiochina di interesse rispetto ai pozzi di controllo dei media. Se non si verifica una migrazione significativa, si può presumere che la procedura non abbia funzionato correttamente o che i linfociti non rispondano alla chemiochina in questione.

Questa tecnica può essere ampiamente utilizzata per comprendere la migrazione dei linfociti quando quei linfociti hanno subito una vasta gamma di trattamenti in vivo.