Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source

Presentiamo un protocollo di imaging live senza etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa per catturare immagini, analizzare e quantificare la cinetica di crescita del fungo filamentoso A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con la microscopia a fluorescenza.

In questo video, descriviamo un protocollo di imaging dal vivo privo di etichette per acquisire immagini del fungo modello aspergillus nidulans, utilizzando tecniche di microscopia ottica trasmessa. Usiamo queste immagini per analizzare e quantificare la cinetica di crescita di aspergillus nidulans sia in mezzi liquidi che solidi. Una rappresentazione visiva di questo protocollo consente agli utenti di acquisire familiarità con passaggi significativi di acquisizione di immagini e di elaborazione delle immagini al microscopio.

Un metodo comune utilizzato per misurare la crescita fungina filamentosa è due spore fungine inoculate in una capsula di Petri contenente agar nutriente e per misurare il diametro della colonia in via di sviluppo pochi giorni dopo. Tuttavia, questo approccio non è abbastanza sensibile da quantificare le differenze di crescita fine. Pertanto, sono state sviluppate misurazioni a singola cellula utilizzando la microscopia time lapse.

Queste misurazioni sono in grado non solo di fornire risultati accurati e quantitativi, ma anche di riflettere le dinamiche di crescita di diverse cellule all'interno di una popolazione. Inoltre, questo approccio mira a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nelle risposte di crescita fungina ai segnali endogeni e ambientali. Inizia versando 15 millilitri di agar nutriente liquido nelle piastre di Petri.

Posizionare il coperchio sulla parte superiore e lasciarlo raffreddare. Utilizzare le radiazioni UV per sterilizzare le piastre. Prima di strisciare il ceppo fungino di interesse da un ceppo, riscaldare il cappio nodulante nel bruciatore Bunsen fino a quando non è rovente, raffreddare il cappio pugnalandolo nell'agar.

Vortice del tubo e strisciare l'anello attraverso la superficie del mezzo minimo di agar integrato con le esigenze nutrizionali appropriate. Incubare le piastre per due o tre giorni a 37 gradi Celsius. Usando uno stuzzicadenti sterile, trasferire un piccolo numero di conidi toccando delicatamente una singola colonia su piastre di supporto completo.

Incubare le piastre per tre o quattro giorni a 37 gradi Celsius. I conidi di aspergillus nidulans, vengono raccolti in un tubo a vortice sterile da 1,5 millilitri, con 1,0 millilitri di acqua distillata in autoclave contenente lo 0,05% di volume per volume, Tween 80, per ridurre il numero di grumi di conidi. Una versione modificata del metodo dell'agar invertito viene utilizzata per l'imaging di funghi filamentosi sulla superficie del mezzo agar.

Inizialmente individuare 10 aliquote di microlitro di sospensione conidiale vigorosamente vortex, circa due volte 104 celle per millilitro su piastre di Petri di 15 millilitri minimo medio con un peso per volume di agar. Incubare la coltura sperimentale secondo lo stadio di sviluppo da indagare. Qui incubamo per tre giorni a 30 gradi Celsius.

Dopo, affettare un blocco di agar contenente la colonia, usando un bisturi sterile. Qui ritagliamo un cuneo di agar al margine della colonia, invertiamo e mettiamo la fetta di agar in un otto, ben scorrevole. Trasferire 10 aliquote microlitri di sospensione conidiale vigorosamente vortex di circa due volte 10 nella potenza di quattro nei pozzetto di un vetrino contenente 200 microlitri di mezzo minimo con gli appositi integratori.

Incubare per il tempo e la temperatura da esaminare ogni volta. La scelta del microscopio dipende dall'attrezzatura disponibile. In ogni caso, l'impostazione del microscopio dovrebbe includere uno stadio invertito, una camera ambientale o almeno una stanza con un controllo preciso della temperatura dell'aria.

Inizialmente preriscaldare il termostato e la camera del microscopio per stabilizzare la temperatura desiderata. Qui impostiamo la temperatura a 30 gradi Celsius. Accendere il microscopio, l'alimentazione dello scanner, l'alimentazione del laser e il computer e caricare il software di imaging.

Posizionare il vetrino del pozzo precedentemente preparato nella fase del microscopio e mettere a fuoco. Trova campi di vista che contengono celle isolate, non sovrapposte, o almeno non sovraffollate, per facilitare le misurazioni della crescita durante l'analisi delle immagini. Selezionare la tecnica di microscopia a luce trasmessa da utilizzare e attivare il rilevatore di luce trasmessa e i rilevatori per la fluorescenza quando necessario.

Impostare il microscopio per acquisire le immagini agli intervalli di tempo desiderati e avviare l'acquisizione di serie temporali. Il caricamento, la visualizzazione e l'elaborazione delle immagini vengono eseguiti con il software open source imageJ Fiji. Inizia importando le immagini nelle Figi utilizzando i plugin di un formato.

Selezionare la modalità colore predefinita e la scala automatica. Per visualizzare un timestamp e una barra di scala come sovrapposizione vai ad analizzare, strumenti, barra di scala. Impostare i parametri desiderati relativi a larghezza, altezza, colore e posizione della barra della scala.

Vai a immagine, proprietà, per visualizzare le proprietà dell'immagine nel software imageJ Fiji. Osservare le informazioni sull'intervallo di fotogrammi. Qui usiamo un intervallo di tempo di circa 15 minuti e premiamo ok.

Quindi vai su immagine, pile, etichetta e imposta le informazioni corrette su intervallo. Impostare la posizione dell'etichetta modificando X e Y.Impostare l'unità di misura nel testo del campo e premere anteprima. Usa la corrispondenza dell'istogramma per la correzione dell'illuminazione tra diversi fotogrammi selezionando l'immagine, la regolazione, la correzione della candeggina, la corrispondenza dell'istogramma.

Viene visualizzata una nuova finestra con illuminazione corretta. Usa il plugin MtrackJ nei plugin, MtrackJ, per tenere traccia della crescente punta ifale Per aggiungere la traccia, seleziona il pulsante Aggiungi nella barra degli strumenti e posiziona il primo punto sulla punta ifale usando il tasto sinistro del mouse. La serie temporale passerà automaticamente al fotogramma successivo.

Per completare il processo di tracciamento, fare doppio clic con il mouse sul punto finale o premere il tasto Esc. Lo scorrimento della tabella di output, la colonna più importante per il calcolo della crescita della punta ifale, è la velocità in un dato fotogramma. Traccia in modo sicuro le misurazioni, aggiungi file, salva con nome, nel formato di file di tua scelta, ad esempio CSV, importa il file salvato nel tuo programma di fogli di calcolo e calcola la visualizzazione e ulteriori test.

Premere il pulsante del filmato per generare un filmato, tipo di colore RGB, contenente i fotogrammi con le tracce disegnate al loro dentro, che può essere visualizzato in qualsiasi lettore multimediale standard. Seguendo questo protocollo, abbiamo catturato e analizzato varie immagini corrispondenti a diversi stadi di crescita e sviluppo del fungo filamentoso aspergillus nidulans. La figura mostra il confronto tra le misurazioni del tasso di crescita wild type e azhAD Delta ngnA Delta.

L'azhAD Delta ngnA Delta è un ceppo a doppia cancellazione in due geni implicati nella disintossicazione e assimilazione del prodotto da combattimento tossico L come aggiunto in due acidi carbossilici. Mostra misurazioni statisticamente significative del tasso di crescita più basso rispetto al ceppo selvatico in colture liquide sommerse. Questa differenza di crescita non è rilevabile misurando l'area della colonia di questi due ceppi in un mezzo minimo solido.

L'imaging dal vivo a lunga durata a singola cellula ha un valore significativo nello sforzo di ottenere informazioni spaziali e temporali sulla dinamica delle proteine cellulari. Questo protocollo è adatto anche per l'esecuzione di immagini di cellule vive a lungo termine. Qui vediamo la germinazione dei conidi che co-esprimono la proteina eisosomiale del nucleo GFP etichettata PilA e l'istone MRFP H1. Qui in presentiamo un protocollo per analizzare la cinetica di crescita fungina in modo riproducibile e affidabile senza la necessità di alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell'utente.

Questo protocollo consente una quantificazione oggettiva e accurata della crescita fungina.