スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

この神話体系は、ユビキチンが末端とC末端のCUBに安定して分離され、全長の疑似ユビキチン分子に再溶解できる能力を指すスプリットユビキチンの概念に基づいています。この再構成は、野生型NUBIによるISIN 13のグリシン変異への導入を用いると自然に起こりますが、NUBGと呼ばれるフラグメントを産生すると、CUVに対する親和性が大幅に低下し、その結果、偽ユビキチンの形成が阻害されます。NUBGとCUBがそれぞれプロテインAとプロテインBに融合し、AとBが相互作用することができれば、ペンセウユビキチン分子は再び形成されます。

神話では、内在性メンブレンベイトは、人工転写因子に結合したCUBフラグメントからなる攻撃に融合します。NUBGフラグメントには賞賛が融合していますが、餌と獲物との間の相互作用により、偽ユビキチンが再構成され、ハサミで示されている細胞質の脱ユビキチン化酵素によって認識されます。これらの酵素は、CUBのC末端の後に切断され、転写因子を放出し、転写因子は核および活性化因子レポーターシステムに入り込み、BA獲物の相互作用が起こる細胞の選択的単離と同定を可能にします。

こんにちは、トロント大学の分子遺伝学および生化学部門のIgor STAARs LabのJanie Snyderです。今日は、膜の手順をお見せします 2つのハイブリッドまたは神話、そして私たちはこの手順を使用して、私たちの研究室でこの手順を使用して、内在性膜タンパク質の相互作用を研究します。それでは始めましょう。

神話解析を行う前に、ベイトタンパク質のN末端またはC末端が細胞のサイトゾルにあることを確認してください。CUB Lex A VP 16 タグは、このような末端でタンパク質に融合する必要があります。転写因子の放出に必要な脱ユビキチン化酵素はサイトゾルに位置しているため、ベイトタンパク質のトポロジーがわからない場合は、NNC末端の両方にタグを付けたコンストラクトを生成することができ、N-U-B-G-I制御テストを使用して、これらのいずれかが神話での使用に適しているかどうかを確認し、それによって特定の末端が細胞質であることを示します。

次に、神話の2つの主要なバリエーションのうち、どちらが実験に適しているかを決定します。天然酵母タンパク質の場合、統合された神話またはイミーが最適な方法です。イミーでは、ベイツは内生的にCUB Lex a VP 16タグでタグ付けされ、ネイティブのプロモーターの管理下に置かれています。

これは、ベイツの野生型発現レベルが、非天然酵母タンパク質に対する偽陽性数の増加など、タンパク質の過剰発現に関連する問題を排除するのに役立つため、有利であり、従来の神話またはT神話を使用して、CU B Lex A V VP 16タグベイトがプラスミドからECTを局所的に過剰発現させることができる。この形式の神話は、初期の餌の構造と使用されるメディアを除いて、より広く適用できるため、このプロトコルではT神話に焦点を当てます。神話の両方の形式は本質的に同じ方法で実行されます。ベイトは、タグ付けと発現のために適切なベクターにクローニングする必要があります。

現在、BV 4、p、a、BV 4、および PCM BV 4 などのさまざまな T 神話ベクトルが利用可能であり、それぞれ非常に強い TF 1 の強い A DH 1 と弱い CYC 1 のプロモーターの制御下で、c 末端タグ付きベイツ、Beit Cub Lexie、VP 16 の構築を可能にします。チームエフェクターが選択されると、制限は適切な制限部位でプラスミドを消化します。切断は、CU B Lxe VP 16 タグのすぐ近くで、C 末端タギングの場合は上流側、N 末端タギングの場合は下流側でのみ発生する必要があります。

例えば、PAM BVベクターを使用する場合、SFI oneは理想的な選択肢であり、プラスミドが消化され、使用準備が整うまで摂氏マイナス20度で保存された後、次のステップは、目的の遺伝子の増幅とクローニングのためのプライマーを設計することです。フォワードプライマーの5つのプライムエンドは、制限部位の約35〜40ヌクレオチド上流と一致する必要があります。一方、3つのプライムエンドは、標的遺伝子の最初の18〜20ヌクレオチド、つまりベータ2とジェネリック受容体をコードするDRB 2と一致している必要があります。

この例では、リバースプライマーの5つのプライムエンドは、制限部位の約35〜40ヌクレオチド下流のリバース補体と一致する必要があります。標的遺伝子の最後の18〜20ヌクレオチドの逆補体に一致する3つのプライムエンドを使用して、示された例で行われているように、CUB LexがVP16タグがC末端に配置されている場合、N末端またはC末端のタグ付けが行われているかどうかに応じて、停止コードを省略し、 フォワードプライマーまたはリバースプライマーで使用されたプラスミド配列の選択された35〜40ヌクレオチドが、VP 16タグであるCU B Lexのフレーム内で標的遺伝子をクローニングすることを確認します。この例では、A DRBのC末端に2つのタンパク質がタグ付けされます。

リバースプライマー中のA MBV配列の35基底は、A DRB 2およびCUB遺伝子配列が同じリーディングフレーム内に位置するように選択されており、選択されたプライマーを用いてPCRにより目的の遺伝子を増幅する。PCRパラメータは、ギャップ修復相同組換えが起こり得る環境を提供するために使用される特定の酵素および特定のプライマーに依存する。以前に消化されたプラスミドおよび増幅された目的の遺伝子は、ギーツおよびウッズによって記載されたような標準的な酵母形質転換プロトコルを使用して、適切な酵母株に形質転換されます。

形質転換酵母がプレート上で増殖したら、株の単一のコロニーを選び、5ミリリットルのSDマイナスロイシンに接種します。液体培地は、培養物が一晩で成長し飽和に達した後、一晩で摂氏30度で成長します。細胞を5分あたり700 GSで遠心分離し、市販のミニプレップキットを使用して、細胞ペレットから上清分離ベイト血漿DNAを除去します。

最初の蘇生懸濁液と5分間激しくボルテックスした後、ペレットに少量の0.5ミリモルソーダライムガラスビーズで十分な酵母細胞溶解を確保するために、1つの変更を加えた標準プロトコルに従います。その後、通常どおり商用プロトコルに進みます。単離された酵母DNAを、DNAあたり1マイクログラムあたり10〜7番目の細胞の少なくとも1倍の形質転換効率で、プラスミド増殖に適した化学的に有能な大腸菌株に変換します。

形質転換大腸菌から血漿DNAを採取した後、使用前にシーケンシングによりベイトプラスミドの適切な構造を確認し、ベイトタンパク質が酵母膜に適切に局在していることを確認するために、ベイト株を分析する必要があります。局在は、蛍光顕微鏡を用いて決定します。ベイトタグ配列にA YFP分子を含めると、生細胞を直接可視化でき、imyで一般的に使用されています。

あるいは、タグのLex AまたはVP 16成分に対する抗体を用いた標準的な免疫蛍光法を、ベイトの適切な局在が確立された後に使用することができます。それは、餌が自己活性化IEではないことを確認するために、それは単独でレポーターシステムを活性化しないか、または餌が自己活性化されていないことを確認するために非相互作用賞賛の存在下で確認する必要があります、我々は、N-U-B-G-Iテストを採用しています。このテストでは。

ベイトは、相互作用するポジティブおよび非相互作用するネガティブコントロールの称賛で形質転換され、次に、各形質転換体の異なる希釈が適切な選択培地で発見されます。アベートは、ポジティブコントロールの存在下で選択的な培地で成長する必要があり、神話での使用に適したネガティブコントロールの存在下では成長しません。ベイトがバリデーションされたら、ベイトを含む神話レポーター株を目的の獲物ライブラリーで形質転換し、タンパク質タンパク質の相互作用をスクリーニングすることができます。

この大規模な酵母形質転換を開始するには、餌を含む神話レポーター株の単一のコロニーを5ミリリットルのSDマイナスロイシン培地に接種し、振とうしながら摂氏30度で一晩インキュベートします。一晩培養したものを200ミリリットルのSDからロイシン培地を除いたものに希釈し、OD600が0.6〜0.7に達するまで振とうしながら摂氏30度でインキュベートします。目標OD 600に達したら、200ミリリットルの培養物を4本の50ミリリットルスクリューキャップ遠心分離管に分割し、遠心分離によって細胞を回収します。

ペレットを滅菌二重蒸留水と酢酸リチウムトリッシーDTA溶液で洗浄した後、600マイクロリットルの酢酸リチウムトリッシーDTA溶液の各ペレットを4本の15ミリリットルスクリュー遠心分離管のそれぞれに懸濁します。2.5ミリリットルのPEG酢酸リチウム溶液、2つの600マイクロリットルの再懸濁細胞、100マイクロリットルのサケ精子DNA溶液および7マイクログラムの獲物ライブラリDNA4を加えます。チューブに1分間テキストを送信して十分に混合した後、摂氏30度のウォーターバスで45分間インキュベートします。

45分間のインキュベーション後、15分ごとに短時間混合します。各チューブに160マイクロリットルのジメチルスルホキシドまたはDMSOを加え、チューブを反転させてすぐに混合します。摂氏42度の水浴中で20分間インキュベートします。

ヒートショックが完了したら、遠心分離と再投与により細胞を回収します。各ペレットを2つのX-Y-P-A-Dの3ミリリットルに懸濁します。すべてのサンプルを1本の50ミリリットルスクリューキャップ遠心分離チューブにまとめます。

細胞を摂氏30度で90分間インキュベートし、細胞を回収します。細胞を遠心分離し、100マイクロリットルの再懸濁細胞を使用して、細胞ペレットを4.9ミリリットルの滅菌0.9%塩化ナトリウムに再懸濁します。10 x から 10, 000 x プレート、100 x および 1000 x 希釈の 100 マイクロリットルの範囲の滅菌 0.9% 塩化ナトリウムで 10 倍段階希釈を調製し、選択培地に 100 マイクロリットルを調製し、摂氏 30 度で 2 〜 3 日間インキュベートします。

これらのプレートはコントロールとして機能し、変換の効率を等しく計算するために使用されます。残りの4.8ミリリットルの再懸濁細胞とプレートを150ミリメートルの大きなプレートに分け、摂氏30度で3〜4日間インキュベートします。コロニーが成長したら、100マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウムで相互作用する可能性のある餌獲物ペアを含む細胞をそれぞれ表す単一のコロニーを懸濁し、5マイクロリットルのアリコートをXGを含む選択的な培地にプレートし、2〜4日間のみ成長させます。

堅調な成長と青色を示すコロニーは、さらなる分析のために選択されます。陽性酵母コロニーからプラスミドを単離し、シーケンシングを行った後、すべてのシーケンシングデータをコンパイルして解析し、インタラクターの予備リストを作成します。これらの相互作用を再確認するために、ベイト依存性テストが使用されます。

この試験では、同定された相互作用を発現するすべての獲物プラズマを元のベイト株と、CUB Lexに融合した単一の膜貫通ドメインからなるコントロール人工ベイトを抱く株に戻す、VP 16タグは、これらの変換から100マイクロリットルの滅菌二重蒸留水で単一のコロニーを再懸濁し、適切な選択培地とX scの下で5マイクロリットルの容量をスポットします。 獲物ごとに複数のトランスフォーマントを選択し、元の餌と人工餌の両方を同じプレートにスポットする必要があります。レポーターシステムの活性化を引き起こす獲物に人工餌を運ぶ酵母を摂氏30度で2〜4日間インキュベートすると、無差別と見なされ、特定の獲物が相互作用者のリストから削除されます。

人工餌ではなく、関心のある餌で酵母の成長と青い着色を引き起こす賞賛。特定のインタラクションを確認します。しかし、獲物を抱いている酵母とあなたの興味のある餌は成長しません。

この獲物はインタラクターのリストから削除されます。残りの賞賛は、神話のスクリーンで特定されたインタラクターの完全なリストを構成しています。神話の手順を完了すると、インタラクトホームマップが作成されます。

これは、研究者がケースバイケースで決定された特定の研究を使用してさらに分析する必要がある候補の相互作用のコレクションを表しています。それぞれの生物学的意義を評価するために、メンブレンE 2ハイブリッドまたは神話手順を実行して、目的のタンパク質の相互作用パートナーを特定する方法を示しました。神話の手順を実行するときは、関心のあるビーの末端やC末端がセルのcitoに位置していることを確認し、それに応じてタグ付け戦略を設計することが重要です。

さらに、餌の株が餌を適切に表現し、餌が正しく局在化していることを慎重に評価することが重要です。さらに、NUB GIコントロールテストは、スクリーニング条件の確立に役立つため、実施することが重要です。最後に、神話を使用して検出したすべての相互作用を個別に検証するようにしてください。

これらの簡単な手順に従うことで、神話の手順から可能な限り最高の結果を得ることができます。まあ、それだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。