スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

このシステムは、スプリット・ユビキチンの概念に基づいています。これは、ユビキチンをN末端のNUBIとC末端のCUBという2つの半分に安定して分離でき、かつこれらが再構成されて全長擬似ユビキチン分子になる能力があることを指します。野生型NUBIを使用した場合、この再構成は自発的に起こりますが、13番目のイソロイシンをグリシンに置換したNUBGと呼ばれるフラグメントを導入すると、CUBへの親和性が大幅に低下し、擬似ユビキチンの形成が阻害されます。もしNUBGがタンパク質Aに、CUBがタンパク質Bにそれぞれ融合されており、AとBが相互作用可能な状態であれば、擬似ユビキチン分子が再び形成されます。

この手法では、積分膜ベイトが、人工転写因子に結合したCUBフラグメントからなるタグに融合されています。一方、プレイはNUBGフラグメントに融合されており、ベイトとプレイの相互作用によって疑似ユビキチンが再構成されます。そして、この再構成されたユビキチンが、ハサミで例えられている細胞質内の脱ユビキチン化酵素によって認識されます。これらの酵素はCUBのC末端後を切断して転写因子を遊離させ、遊離した転写因子が核内に移行してレポーターシステムを活性化することで、ベイト・プレイ相互作用が起こった細胞を選択的に単離および同定することが可能になります。

こんにちは。トロント大学の分子遺伝学および生化学科にあるIgor STAARs LabのJanie Snyderです。今日は、膜タンパク質ツーハイブリッド法（M2H）の手順について説明します。私たちの研究室では、この手順を用いて膜貫通タンパク質の相互作用を研究しています。それでは始めていきましょう。

Myth解析を行う前に、ベイトタンパク質のN末端またはC末端が細胞の細胞質に位置していることを確認してください。CUB Lex A VP 16タグは、そのような末端にタンパク質と融合していなければなりません。転写因子の放出に必要な脱ユビキチン化酵素は細胞質に存在するため、ベイトタンパク質のトポロジーが不明な場合は、N末端とC末端の両方にタグを付けた構築物を生成し、後述するN-U-B-G-Iコントロールテストを用いて、どちらがMythでの使用に適しているかを確認することで、特定の末端が細胞質側にあるかを判断できます。

次に、2つの主要なmythのバリアントのうち、どちらが実験に適しているかを決定します。酵母の天然タンパク質を対象とする場合は、integrated mythまたはimmyが最適な手法です。immyでは、BatesにCUB LexおよびVP16タグが内在的にタグ付けされており、天然のプロモーターによる制御下に保持されます。

Batesの野生型発現レベルを利用することは、非天然酵母タンパク質の偽陽性の増加など、タンパク質の過剰発現に伴う問題の解消に役立つため有利です。従来のTwo-hybrid法またはT-hybrid法では、CU B Lex A V VP 16タグ付きベイトがプラスミドから局所的に過剰発現されます。本プロトコルでは、T-hybrid法の方がより汎用性が高いため、こちらに焦点を当てます。初期のベイト構築と使用する培物を除けば、両方のhybrid法は基本的に同一の方法で実施されます。ベイトは、タグ付けおよび発現に適したベクターにクローニングする必要があります。

現在、BV4、pABV4、PCM-BV4などのさまざまなT mythベクターが利用可能であり、これらを用いて、それぞれ非常に強力なTF1、強力なADH1、および弱いCYC1プロモーターの制御下で、C末端にタグ付けされたBait-Cub-Lex8-VP16を構築することができます。チームエフェクターを選択した後、適切な制限酵素部位でプラスミドを制限酵素消化します。切断は、C末端タグ付けの場合はタグの上流、N末端タグ付けの場合はタグの下流にあるCub-Lex8-VP16タグの直近でのみ行われる必要があります。

例えば、PAM BVベクターを使用する場合、SFI Iが最適な選択となります。プラスミドを消化し、使用時まで-20°Cで保存した後、次のステップとして、目的遺伝子の増幅およびクローニングのためのプライマーを設計します。フォワードプライマーの5'末端は、制限部位の上流約35〜40ヌクレオチドと一致させる必要があります。一方、3'末端は、β2アドレナリン受容体をコードするDRB2であるターゲット遺伝子の最初の18〜20ヌクレオチドと一致させる必要があります。

この例では、リバースプライマーの5'末端は、制限部位の下流約35〜40ヌクレオチドの相補鎖と一致させる必要があります。また、3'末端は標的遺伝子の末端18〜20ヌクレオチドの相補鎖と一致させますが、例に示されているようにC末端にCUB LexまたはVP16タグを導入する場合は、終止コドンを除外します。N末端またはC末端のどちらにタグを付けるかに応じて、フォワードプライマーまたはリバースプライマーに使用するプラスミド配列の35〜40ヌクレオチドを選択し、標的遺伝子がCUB LexまたはVP16タグとインフレームでクローニングされるようにしてください。今回の例では、ADRB2タンパク質のC末端にタグを導入します。

リバースプライマーにおけるA MBV配列の35塩基は、A DRB twoおよびCUB遺伝子配列が同一の読み枠内に配置されるように選択されており、選択したプライマーを用いてPCRにより目的遺伝子を増幅させます。PCRのパラメータは、ギャップ修復相同組換えが起こる環境を提供するために使用される特定の酵素および特異的プライマーによって異なります。あらかじめ消化したプラスミドと増幅した目的遺伝子を、GeetsおよびWoodsによって記述されているような標準的な酵母形質転換プロトコルを用いて、適切な酵母株に形質転換します。

形質転換した酵母がプレート上で生育したら、その株の単一コロニーをピックアップし、5 mLのSD-Leu培地に接種します。液体培地を用いて30 °Cで一晩培養し、培養液が飽和状態に達するまで育てます。細胞を700 gで5分間遠心分離し、上清を除去します。市販のミニプレップキットを用いて、細胞ペレットからベイトプラスミドDNAを単離します。

標準プロトコルに従いますが、少量の0.5 millimolar ソーダライムガラスビーズを用いて十分な酵母細胞の溶解を確実にするため、1箇所の変更を加えます。最初の再懸濁後、ペレットにビーズを加え、5分間激しくボルテックスしてください。その後は、通常通り市販のプロトコルに従います。単離した酵母DNAを、1 µg DNAあたり1 × 10⁷ cells以上の形質転換効率を持つ、プラスミド増殖に適した化学的コンピテントE. coli株に形質転換させます。

形質転換したe coliからプラスミドDNAを回収した後、使用前にシーケンシングを行い、ベイトプラスミドが正しく構築されていることを確認します。ベイト株を解析し、ベイトタンパク質が酵母膜に適切に局在していることを確認する必要があります。局在は蛍光顕微鏡を用いて判定します。ベイトタグ配列にYFP分子を組み込むことで、生細胞を直接可視化することができ、これはimyで一般的に用いられています。

あるいは、ベイトの適切な局在が確認された後、タグのLex AまたはVP 16成分に対する抗体を用いた標準的な免疫蛍光法を用いることも可能です。ベイトが自己活性化しないこと、すなわち、ベイト単独で、あるいは非相互作用性のプレイスの存在下でレポーター系を活性化させないことを確認する必要があります。ベイトが自己活性化しないことを確認するために、N-U-B-G-Iテストを実施します。このテストでは、

ベイトを、相互作用する陽性コントロールおよび相互作用しない陰性コントロールのプレイとともに形質転換し、その後、各形質転換体の異なる希釈液を適切な選択培地にスポットします。ベイトを酵母ツーハイブリッド（Y2H）法に使用するためには、陽性コントロールの存在下では選択培地で生育し、陰性コントロールの存在下では生育しない必要があります。ベイトが検証された後、ベイトを含むY2Hレポーター株を目的のプレイライブラリで形質転換し、タンパク質間相互作用をスクリーニングできます。

この大規模な酵母形質転換を開始するには、ベイトを含むMYTレポーター株の単一コロニーを5 mLのSD-Leu培地に接種し、30 °Cで振盪しながら一晩培養します。一晩培養した菌体を200 mLのSD-Leu培地で希釈し、OD 600が0.6から0.7に達するまで30 °Cで振盪培養します。目的のOD 600に達したら、200 mLの培養液を4本の50 mLスクリューキャップ付き遠心チューブに等分し、遠心分離によって細胞を回収します。

ペレットを滅菌二回蒸留水およびリチウムアセテートTris-EDTA溶液で洗浄した後、各ペレットを600 µLのリチウムアセテートTris-EDTA溶液に懸濁し、4本の15 mLねじ口遠心チューブに分注します。再懸濁した細胞600 µLに対し、PEGリチウムアセテート溶液2.5 mL、サケ精子DNA溶液100 µL、およびプレイライブラリDNA 7 µgを加えます。チューブを1分間ボルテックスして十分に混合し、その後、30 °Cのウォーターバスで45分間インキュベートします。

45分間のインキュベーション後、15分ごとに短時間混合します。各チューブに160 µLのジメチルスルホキシド（DMSO）を加え、チューブを転倒させて直ちに混合します。42 °Cのウォーターバスで20分間インキュベートします。

ヒートショックが完了したら、遠心分離により細胞を回収し、再懸濁します。各ペレットを3 mLの2 X-Y-P-A-Dに懸濁してください。すべてのサンプルを、単一の50 mLスクリューキャップ付き遠心チューブにまとめます。

細胞を30 °Cで90分間インキュベートし、細胞を回復させます。細胞を遠心分離し、細胞ペレットを4.9 mLの滅菌0.9%塩化ナトリウムに再懸濁し、再懸濁細胞100 µLを使用します。滅菌0.9%塩化ナトリウムを用いて、10倍から10,000倍までの10倍連続希釈系列を調製し、100倍および1000倍希釈液の100 µLを選択培地に播種し、30 °Cで2〜3日間インキュベートします。

これらのプレートはコントロールとして機能し、形質転換効率を均等に算出するために使用されます。残りの4.8 mLの再懸濁細胞を分け、150 mmの大型プレートに播種し、30 °Cで3〜4日間培養します。コロニーが形成されたら、相互作用する可能性のあるベイト-プレイペアを含む細胞を代表する単一コロニーをそれぞれ100 µLの0.9%塩化ナトリウムに再懸濁し、5 µLずつXGを含む選択培地へと播種し、2〜4日間のみ培養します。

旺盛な増殖を示し、青色を呈するコロニーを、さらなる解析のために選別します。陽性の酵母コロニーからプラスミドを単離してシーケンシングした後、すべてのシーケンシングデータをまとめて解析し、相互作用因子の暫定リストを作成します。これらの相互作用を再確認するために、ベイト依存性試験を用います。

この試験では、同定された相互作用因子を発現するすべての prey プラスミドを、元の bait 株および、単一の膜貫通ドメインを CUB Lex および VP 16 タグに融合させたコントロール用の人工 bait を保持する株にそれぞれ再形質転換します。これらの形質転換による単一コロニーを 100 µL の滅菌二回蒸留水に再懸濁し、適切な選択培地（＋ X-α-Gal）上に 5 µL ずつスポットします。理想的には、各 prey に対して複数の形質転換体を選択し、元の bait と人工 bait の両方を同じプレート上にスポットする必要があります。プレートを 30 °C で 2〜4 日間インキュベートします。人工 bait を保持する酵母においてレポーターシステムの活性化を引き起こす prey は、プロミスキャス（非特異的）であると見なされ、その特定の prey は相互作用因子のリストから除外されます。

目的のベイトを用いた酵母では増殖および青色への着色が認められるが、人工ベイトでは認められないことを確認し、特異的な相互作用を証明します。しかしながら、プレイと目的のベイトを保持する酵母が増殖しない場合は、

この獲物はインタラクターのリストから除外されます。残りの獲物が、 yeast two-hybrid スクリーニングで同定されたインタラクターの完全なリストとなります。 yeast two-hybrid 手順が完了すると、インタラクトームマップが得られます。

これは、研究者がケースバイケースで決定した特定の研究を用いてさらに分析しなければならない、候補となる相互作用の集合を表しています。それぞれの生物学的意義を評価するために、目的タンパク質の相互作用パートナーを同定するための膜 Yeast two-hybrid（Y2H）法、すなわちMYTH法の手順について説明しました。MYTH法を行う際は、目的のベイトのN末端および/またはC末端が細胞の細胞質側に位置していることを確認し、それに応じてタグ付け戦略を設計することが重要です。

さらに、ベイト株がベイトを適切に発現しているか、またベイトが正しく局在しているかを注意深く評価することが重要です。加えて、スクリーニング条件の決定に有用であるため、NUB GI コントロール試験を実施することが重要です。最後に、mythを用いて検出したすべての相互作用を、独立した手法で必ず検証してください。

これらの簡単な手順に従うことで、この手法から可能な限り最良の結果を得ることができます。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。