Summary
Burada için gerekli araçları geliştirmek
Abstract
Biz floresan işaretleri ve embriyonik fare neuroepithelium kültür dilim canlı görüntüleme entegre bir sistem geliştirdi. Biz izleme soy genetik hücre için mevcut fare hatları yararlandı: Bir Tamoksifen-indüklenebilir Cre hattı ve Cre-aracılı rekombinasyon üzerine dsRed ifade eden bir Cre muhabir hattı. Tamoksifen nispeten düşük düzeyde kullanarak, bize tek tek hücre bölünmeleri takip etmek izin, hücrelerin az sayıda rekombinasyon neden başardık. Ayrıca, bir Olig2-eGFP transgenik çizgi 1-3 kullanarak Sonic Hedgehog (Sus) sinyal için transkripsiyonel yanıt gözlenen ve kirpikler işaretleyici, Sstr3-GFP 4 ifade virüs kültürlü dilim nüfuz ederek kirpikler oluşumu izlenir. Görüntü için neuroepithelium, biz nöral tüp izole, E8.5 embriyolar hasat, görüntüleme odasına uygun kültür koşullarında sinir dilim monte ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yapılır. Bizim eskiin vivo canlı görüntüleme yöntemi bize fizyolojik ilgili bir şekilde birincil kirpikler oluşumu ve Sus cevap göreli zamanlama değerlendirmek için tek bir hücre bölünmeleri izlemek için sağlar. Bu yöntem, kolayca farklı floresan işaretleri kullanarak adapte ve alanında yerinde ve gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını izlemek için hangi ile araçları sağlar olabilir.
Protocol
Yetişkin fareler, mekanik servikal dislokasyon tarafından ötenazi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Embriyo Üretimi
- Çapraz Tamoksifen-indüklenebilir Cre çizgi, CAGGCreER ve dsRedCre muhabiri hattı (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Şekil 1) 5,6. Kızı hücreler, çapraz CAGGCreER ve Olig2-eGFP BAC transgenik farelerin (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Şekil 1) 7,8 ile DsRed doğrultusunda Sus yanıt göreli zamanlama izlemek için.
- % 100 etanol tamoksifen çözülür ve Cre ifade ve hücrelerin bir kısmında DsRed etiketleme ikna etmek için embriyonik 6.5 (E6.5) hamile kadın içine vücut ağırlığı 40 g başına 2.5 mg tamoksifen intraperitoneal gerçekleştirin.
- 48 saat sonra, embriyolar incelemek floresan mikroskop kullanılarak DsRed olumlu embriyolar tespit, kültür çanak aktarmak ve gözlemlerEx vivo görüntüleme sırasında E tek hücre bölünmesi (aşağıya bakınız).
2. Tüm Fare Embriyo Kültürü
- % 10 yeni doğmuş buzağı serumu ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) 9 ile desteklenmiş DMEM/F12 (1:1) içeren, önceden ısıtılmış yıkama ortamı içinde E8.5 embriyolar incelemek.
- Doğrudan floresan mikroskop altında 37 ° C ısıtma sahnede diseksiyonu, yer embriyo sonra GFP ve / veya DsRed pozitif (bkz. aşağıda) olarak tanımlar.
- Sonra bir L-glutamin ile takviye edilmiş fenol kırmızısı olmadan en az% 50 bir erkek Sprague-Dawley sıçan alınan serum ve% 50 DMEM/F12 (1:1) ihtiva eden önceden-dengelenmiş kültür ortamı 500 ul damla ve% 1 içine 2 embriyolar kadar veri transferi 0.85% NaCl ve P / S 9 1 M HEPES.
- Buharlaşmasını önlemek ve kültür kabına 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör embriyolar içeren transfer ortamı üzerinden dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (0,1 cm) uygulanır.
3.Viral Enfeksiyon
- Nöroepitelyumda etiket kirpikler amacıyla, bir E8.5 embriyo içeren kültür ortamı içinde bir 500 ul dengelenmiş bir düşüş Sstr3-GFP lentivirüs 5-10 ul, yaklaşık 2.000.000 virionlar ekleyin.
- Kültür 18 saat sonra, virüs yıkayın ve nöral tüp dilim hazırlamak için yıkama orta birkaç damla içine enfekte embriyo transferi.
4. Canlı Görüntüleme Nöral Tüp Dilim Hazırlık
- % 1 agar kaplı çanak, bir mikro-bıçak boyutu 0.025 mm kullanarak önceden ısıtılmış yıkama ortamda E8.5 embriyo nöral tüp parçalara ayır.
- 35 mm poli-L-lisin kaplı cam alt çanak fenol kırmızısı olmadan dengelenmiş kültür ortamı bir 150 ul damla izole nöral tüp ventral yüzü aşağı yerleştirin.
- Için cam lamel dar bir parça% 100 saf vazelin ve monte nöral tüp etrafında erimiş mum (IKEA mum), ve hafifçe basın yapılmış 1:1 karışımının az miktarda koyunörnek hareketsiz.
- Dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (~ 0.1 cm) (Şekil 2) ile çanak Kapak.
5. Görüntüleme ve Time-lapse Konfokal Mikroskop Canlı
- Sıcaklık düzenleyen bir çevre odası ile donatılmıştır Konfokal Ters Mikroskop Tarama Nikon A1R Lazer altında yer çanak, 37 ayarlı ° C ve% 5 CO 2.
- 40x yağ immersiyon objektif kullanımı Olig2-GFP ve DsRed pozitif hücreler izlemek için ise, GFP etiketli kirpikler ve DsRed pozitif hücreler kaydetmek için 60x yağ immersiyon objektif kullanın.
- Zaman atlamalı görüntüleme koşulları kurmak için NIS Elements yazılımı açın. Her 10 dakika 1.5 mikron (40x objektif) ve 0.4 mikron (60x objektif) bir aralığı ile en fazla 8 mikron bir aralığı ile z-yığınları 25 mikron kadar kazanır. Gerekirse 488 ve 561 nm uyarma dalga boyları ve iletilen kanal kullanın. 512 x 512 boyutunda görüntüler elde. Int birden fazla kullanıcı tanımlı bölgeler kurmakerest aynı anda kayıt yapmak için.
, Tarama hızı 1, çizgi ortalama 2 ve iğne deliği boyutu (61, görüntünün lazer gücü ve parlaklık için en iyi poz kullanımı düşük lazer yoğunluğu (4.5 kadar% EGFP 405/488 mCherry 561 için en fazla 11%) tarafından ayarlandı DsRed için mikron; Olig2 için 28.1 mikron, SSTR3GFP için 72 mikron, DsRed ve SSTR3GFP için 61.3 mikron, DsRed ve Olig2 için 58 mikron). Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanımı bize düşük lazer gücü ile parlaklık tespit sağladı. - Imaris 3D rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak kaydedilen verileri analiz.
6. İmmünofloresan
- Bir cam tabak içinde 1 saat boyunca buz üzerinde% 4 paraformaldehid / 0.1 M fosfat tampon (4 ° C) içinde izole edilmiş embriyolar ya da nöral tüp düzeltildi.
- Örnekler buz üzerinde PBS 2 saat (4 ° C) (değiştir PBS birkaç kez) ve gece boyunca ya da embriyoların lavabo kadar% 30 sakaroz / 0.1 M Fosfat Tampon koymak yıkayın.
- -80 Kuru buz ve mağaza ° C üzerinde, OCT dondurma Embed Pkriyostat (10 mm) üzerinde kesit erform.
- % 1 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu ihtiva eden yıkama çözeltisi içinde 10 dakika karıştırıldı ve PBS içinde% 0.1 Triton X-100 için slayt yıkayın.
- Konsantrasyonlarda takip de yıkama çözeltisi içinde primer antikorlar inceltilir Rat monoklonal anti-RFP (5F8,) 1:200; Tavşan anti-Arl13b serum 1:1500 ve fare monoklonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Tavşan anti-Olig2 1:300; Fare monoklonal Pax6, Şşş ve Nkx2.2-tüm 01:10 ve Ki67 1:500 poliklonal Tavşan. Düz nemlendirilmiş bir odasında slayt başına 150 ul yaklaşık ekle, kurumasını önlemek ve 4 gece boyunca terk ° C'ye parafilm kapağı
- Üç kez, 20 dakika, her zaman oda sıcaklığında yıkama çözeltisi içinde slaytlar yıkayın.
- 1:200 konsantrasyonda yıkama çözümleri sekonder antikor Alexa Fluor 488, 568, 350 sulandırmak. Çekirdekleri leke Hoechst 1:3,000 veya TO-PRO-3 1:500 kullanın. Slayt başına 150 ul, ışıktan koruyarak, nemlendirilmiş bir odasında, oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
- Yıkama solüsyonu tw slaytlar yıkayıno zaman, oda sıcaklığında 30 dakika, her zaman.
- Dağı 24 saat içinde Altın anti-solmaya reaktif ve görünüm uzatmak% 80 kayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada E8.5 fare neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri ex vivo canlı görüntüleme yapılır. Tek tek hücrelerin etiketlemek için, rekombinasyon 5,6 (Şekil 3A) üzerine dsRed dile bir Cre muhabir satır içeren bir hücre alt grubunda Cre recombinase bağlı. Böylece, 48 saat sonra biz ex vivo görüntüleme (Şekil 4A-D) sırasında tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek mümkün. 1-3; etiketli hücreleri BAC transgenik Olig2-eGFP hattı (Şekil 4G-N Şekil 3C-D) modifiye Sus transkripsiyonel muhabiri dahil ederek Sus-duyarlı olunca eş zamanlı olarak, biz takip. Kirpikler oluşumunu gözlemlemek biz kültüründe embriyo bulaştırmak için Sstr3-GFP lentivirüs oluşturulan (Şekil 3B, Şekil 4A-D) 4. İmmünofloresan in vivo sonuçları (Şekil 4E-F) olarak teyit amacıyla yapılmıştır.
Zaman-turOlig2-eGFP ifade ya da in vitro kültür sırasında Sstr3-GFP lentivirüs ile enfekte dsRedCre muhabiri embriyoların E konfokal görüntüleme gözlem Şekil 5 10'da gösterilmektedir. Biz kirpikler görselleştirmek için kullandığınız Sstr3-GFP ifade altta yatan herhangi bir biyolojik süreci ile müdahale değildi emin olmak için, biz sabit vahşi tip embriyo bölümleri ile canlı görüntüleme verileri teyit. Biz kirpikler oluşumu ve Sus yanıt olarak asenkroni aynı oranda bulundu Çünkü, bu SSTR3-GFP virüs bu süreçlerin (Şekil 5A) etkisi yoktu gösterir.
Şekil 1. Fare neuroepithelium kullanarak ex vivo canlı görüntüleme işleminin akış şeması. Son fare çapraz ve tamoxifen tedavi tüm fare embriyo kültür metodu takip tasvir edilmektedir. Floresan etiketli proteinlerin ifade Embriyolar seçilen ve canlı görüntüleme için hazırlanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Canlı görüntüleme için nöral tüp dilim hazırlık. A) hücre gruplarının çifti ilk görünümü ile E8.5 çevrilmemiş embriyo. B) önceden ısıtılmış orta disseke Nöral tüp bir mikro-bıçak kullanarak. C) Nöral tüp dilim üzerinde ventral yüzü aşağı monte edilir nöral tüp etrafında uygulanan ve yavaşça bir na kapsamında vazelin ve balmumu yapılmış bir karışımın poli-L-lisin kaplı cam alt tabak. D) az miktardacam lamel RROW parçası. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Konfokal mikroskobu ile nöral tüp canlı hücrelerinde floresan etiketli proteinlerin görselleştirme. A) DsRed etiketleri tek tek hücreleri. Onlar formu (sarı ok başları) gibi birincil kirpikler olarak ifade B) SSTR3-GFP lentivirüs. CD) Olig2-GFP taşıyan E8.5 embriyo neuroepithelium içinde GFP ifade gösterir. Barı 30 um (A, B), 15 mikron olan (B) ve 1.5 um (° C).
Şekil 4. Bölünme geçiren gelişmekte olan nöral tüp hücreler bölünerek izleme kirpikler oluşumu ve Sus sinyal. MS) Tek DsRed pozitif hücre önce diğer hücre (C, beyaz ok) bir kızı hücrede bir kirpik formları gösterir. Film her 10 dakikada bir kare oranında görüntülendi. EF) İmmünofloresan yeşil TTT (DsRed soy izleme için) ve kırmızı Arl13b (kirpikler için) karşı antikorlar kullanarak. Hoechst (F). GN) olmadan kutulu alanı (E), büyümesi DsRed pozitif hücre bölünmesi (IM) uğrar. Olig2-GFP yalnızca bir kız (J, K) olarak ifade edilir. Kayıt bir kare her 10 dk bir oranda görüntülendi. Bar 5 mikron (AD), 50 mikron (F), 25 mikron (GN) 'dir.
Şekil 5,. Kirpikler ve Şşş görünümü ile DsRed pozitif hücre sayımı. Bölümü ve kirpikler lokalizasyonu geçiren DsRed hücre) sayısı. Canlı görüntüleme kirpikler oluşumu eşzamanlı oldu tarafından Sembol * anlamına gelir. B) DsRed ve bölünme ve Sus sinyalizasyon geçiren Olig2-GFP pozitif hücre sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim ex vivo sistem bize doğrudan gerçek zamanlı olarak gelişmekte neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek sağlar. Örnek olarak fare embriyonik nöral tüp içinde hücre bölünmeleri incelenmiş ve kirpik oluşumu veya Sus yanıt ya izlenir. Biz teknik fizyolojik ilgili verileri sağlar gösteren sabit bölümleri (n = 178) sonuçları ile uyumlu idi bizim görüntüleme sonuçları (n = 24) doğruladı.
Bizim teknik tamoksifen dozu kesin olmalıdır kadar Cre indüksiyon hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı olmak dayanır. Biz tek hücre etiketleme için dozaj çalıştım. Biz tamoksifen 6 için bir doza bağlı cevap gösterdi CAGGcreER çizgi, ilk analizine dayalı doz hafif bir artış ile hücrelerin küçük klonlar etiket kolay olacağına inanıyorum. Koşullar kapalı ise anormal gelişimi oluşur Buna ek olarak, embriyo kültür koşulları, kritik öneme sahiptir.Biz geliştirme en az 36 saat 11 için çalıştığı biliniyor kullandığımız kültür koşulları altında normal devam doğruladı.
Kullandığımız indüklenebilir Cre ve Cre muhabiri hatları kamuya mevcuttur kadar kolay sorular çeşitli araştırmacılar için bu tekniği oldukça uyarlanabilir hale elde edilebilir. Bizim teknik gerçek gücü genetik olarak tek hücre etiketleme, bizim yaklaşım birçok mevcut ve gelecekteki mutant fare hatları tek hücre davranışını sorgulamak için kullanılabilir olmasıdır. Bu gerçekten gelişimi sırasında memeli embriyo içindeki hücrelerin doğrudan gözlem olarak bu satırları çok yanlış gidiyor kapsamlı incelenmiş değil ne anlamada önemli olacaktır. Düşük lazer gücü ile parlaklık tespit etmek için genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Bizim incorporaton bu gözlem için gerçek bir avantaj sağlar. Bu özel hücre organelleri işaretleme floresan etiketli proteinlerin veya diğer tr tahmin etmek zor değilanscriptional gazetecilere gelecekte entegre olma.
Biz birincil kirpik oluşumu ve bir bölme hücrenin kızı hücrelerinde Sus yanıt göreli zamanlama ilgilenmişlerdir. Ancak, bize Şşş yanıt izlemek için etkin transgenik hat aynı hücre birincil kirpik, Sstr3-GFP işaretleyici görmemizi engelleyen, sitoplazma boyunca Olig2-eGFP dile getirdi. Böylece, büyük bir nükleer kısıtlı Olig2-eGFP veya spektral ayrı Sstr3 floresan proteini füzyon ya yararlanmış olacaktı.
Hedefli ve transjenik kullanılmasına ek olarak, bizim tekniği viral yapıları kullanılarak adapte ve kültür epitele bulaşmasını yararlı veri sağladığı edilebilir olduğunu gösterdi. Bu genetik olarak değiştirilmiş bir fare hattı üretimi daha hızlı bir yöntem sağlayan araştırmacılar için yararlı olacaktır. Ayrıca, yaklaşım, bir hattın nesil doğrulamak için, gerçekten, bizim veri bir trans iddiaSstr3-GFP ifade genic hattı alanına büyük kullanım olacaktır.
Bizim yöntemi alanında daha hemen hücre davranışlarını izlemek hangi ile araçlar sağlar. Fare mutantlar zengin kaynaklara birleştiğinde bu yöntemi yerinde hücresel davranışları bir dizi inceleyerek özellikle güçlü olmasını bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma projesi bir ARRA Ek, 5 R01 NS056380 tarafından desteklenmiştir. Ek destek Viral vektör Core ve Emory Nörobilim NINDS Çekirdek Hizmetleri hibe, P30NS055077 en Mikroskopi Çekirdek ile sağlanmıştır. Istikrarlı SSTR3-GFP IMCD3 hücre hattı için Greg Pazour,, Biz GENSAT gelen fare hattı türetmek için Emory Transgenik Fare ve Gen Hedefleme Çekirdek teşekkür ve Sstr3-GFP lentiviral için Bradley Yoder inşa. Monoklonal antikorlar NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından muhafaza edildi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
