Protocol
注：所有实验的协议批准了法国动物实验伦理委员会和一些A-75-2065验证了“服务保障等桑特阿尼马莱斯，环境公司”。样本大小被选择以确保该实验的再现性，并根据动物伦理规章的3R。
1.制备的小鼠
- 麻醉
- 用于成像的短时间（少于1小时），麻醉的小鼠腹膜内注射200微升含氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）盐水溶液。
- 可替代地，用于成像的较长时间（达4小时），麻醉的小鼠用异氟烷2.5％汽化在O 2 / N 2 O，70/30混合物通过一个适于掩模吸入。
- 注：此方法提供了更稳定的无意识，避免了连续腹腔注射药物。 一旦老鼠被麻醉，检查无意识通过脚踏垫钳刺激。
- 血管染色/额外的染色
- 血管染色：在尾静脉静脉内注射，将200μl罗丹明 - 葡聚糖（2-丙二醛，10毫克/毫升在盐水缓冲液）。
- 对于嗜中性粒细胞染色：注射2微克Ly6G-PE在100微升生理盐水溶液静脉内的尾部静脉（克隆1A8）。
- 固定
- 用于固定的，可使用适用于显微镜和麻醉气体吸入一定制立体支架。
注：立体定位支架是金属支撑具有两个金属板支架，1被固定，而另一个可移动的和适应性强，收紧动物的头。 - 安装在保持板之间的鼠标的头部，以确保从呼吸运动隔离。拧紧固定板和头部伸展SK之间的耳朵英寸检查的稳定性和动物的呼吸福利。
- 用于固定的，可使用适用于显微镜和麻醉气体吸入一定制立体支架。
- 去除头皮
- 小心用70％乙醇润湿的头皮头发用无菌涂布器，避免与眼睛接触。
- 切割用无菌剪刀和镊子取下皮肤完全消除来自后方的顶骨的头皮额骨。远离长达3毫米的眼睛和耳朵，以防止大量出血。取出疏松结缔组织覆盖在颅骨（骨膜）。洗出剩余的头发用温水PBS浸湿的纸巾。
- 浸没系统设置
- 上直接使用小规格针，以控制分配颅骨粘贴直径18mm与手术胶水的橡胶环。胶的橡胶圈的整个周边，以防止泄漏（30微升应该足够）。
- 与PBS浸泡过的纸巾下擂台清洁骷髅最后一次，然后加入37℃的PBS的完全浸入头骨。添加下降0.9％生理盐水溶液或特定眼药膏对鼠标的每只眼睛，避免眼睛干涩。拖动立体支架下的目标。
- 通过直接传输采用显微镜目镜约定位领域。
2.双光子成像采集
- 使用多光子显微镜加上的Ti：蓝宝石激光晶体，它提供了近红外光的140fs脉冲，选择性地调谐从680至1080纳米，和一个声光调制器，用于激光功率控制。使用包括3个外部非退扫描探测器（NDD）（即能够同时记录第3荧光通道）中的2分色镜（565纳米和690纳米），610分之565和500/550的带通滤波器的组合的结构，并且一485短通滤波器，并计划复消色差透镜×20（NA = 1）水浸泡的目的。
- 设置在加热腔室，以允许anaes良好homeothermythetized鼠标。，
注：温度可能设置1小时成像会话更好的稳定性之前。在我们的情况下，32℃下已被选定，以获得麻醉小鼠的最佳体温（36-37℃）和被保持长达4小时。该温度可以适合于该系统中使用（数字探针可用于检查这点）。此外，所使用的加热室是暗/黑和覆盖系统（目标和机动板），以避免外界的光污染的一部分。 - 打开系统
- 打开钛：蓝宝石激光，那么整个显微镜系统。启动采集软件。激光的波长范围设定为870纳米。记录选择合适的NDD。
注：在本例中，二次谐波（SHG）19和青色荧光蛋白（ECFP）的485短通滤波器后的NDD检测。 ECFP也由NDD检测的500/550带通滤波器和罗丹明 - 葡聚糖为t检测后他NDD后610分之565带通滤波器。
- 打开钛：蓝宝石激光，那么整个显微镜系统。启动采集软件。激光的波长范围设定为870纳米。记录选择合适的NDD。
- 调整收购设置
- 使用该软件的“实时采集”成像命令，并使用显微镜方向控制，调整焦距与ECFP和罗丹明信号的区域。设置激光功率为最小，以获得最佳的信噪比以最小的光损伤。
注：所用的功率设置根据感兴趣的区域的深度而变化。通常AOM的设置被设置在20％左右，这代表一个激光功率超过约15毫瓦的目标。这是更好地提高功率增益的光电倍增管的每个NDD，以减少光漂白和光损伤。典型的收购设置与1.58μs的像素停留时间的单扫描，以及512×512像素，1.5倍的分辨率。
- 使用该软件的“实时采集”成像命令，并使用显微镜方向控制，调整焦距与ECFP和罗丹明信号的区域。设置激光功率为最小，以获得最佳的信噪比以最小的光损伤。
- 感兴趣选择地区
- 一旦记录参数设定，再次使用“活”收购指令，和调查的组织，以选择所期望的（X，Y，Z）场中实时进行监控。
注意：通常情况下，我们选择了包括血管和脑实质的区域的字段。 - 寄存器字段用“位置”的软件命令。
注：此命令记忆的x，y，不同的远野Z坐标。 - 选择并注册的兴趣（最多3）使用相同的步骤附加字段。
- 根据与所选择的放大倍率所需要的卷上的第一个记忆的位置设置了3D Z堆栈与“Z堆栈”的软件命令。记忆更深的位置，然后再在最高位置。正常化激光功率与深度。
注：对于多个伴随场成像，我们获得了5片由3微米的z步骤分离为每个字段获得的12微米厚的体积。这些设置可以适于研究细胞的类型。
- 一旦记录参数设定，再次使用“活”收购指令，和调查的组织，以选择所期望的（X，Y，Z）场中实时进行监控。
- 启动收购
- 选择220;时间序列“软件命令，并选择时间间隔的持续时间和周期数。根据通过选择“开始实验”软件的命令所要求的时间流逝和持续时间开始的时间推移成像。
注：在本例中，我们在60次代表30分钟的实时采集一个卷各30秒。较小的时间推移可被执行以在血管跟踪高速小区轧制。在这种情况下更薄的Z堆叠并且不超过2个不同的字段可以记录在同一时间。 - 定期监测的设置。
- 随时监控动物，以确保它是无意识的。
注意：摇晃晶须或腿的动物是复苏的指标。在情况下，动物的呼吸是生涩，异氟醚的量可以稍微降低。采集过程中强有力的组织漂移鼠标复兴的一个指标。 - 确保目标是正确的浸泡。更新37℃PBS between两个收购（30分钟）。
注：信号的采集过程中逐步消失是PBS泄漏指标。
- 随时监控动物，以确保它是无意识的。
- 选择220;时间序列“软件命令，并选择时间间隔的持续时间和周期数。根据通过选择“开始实验”软件的命令所要求的时间流逝和持续时间开始的时间推移成像。
- 程序结束
- 一旦所需的视频被记录，快速复苏之前安乐死的动物通过颈椎脱位。
注：伤口愈合导致痂在24至48小时，这限制了进行纵向成像的可能性的形成。
- 一旦所需的视频被记录，快速复苏之前安乐死的动物通过颈椎脱位。
3.数据分析
- 漂移校正
- 使用了Imaris位平面软件，三维自动跟踪。
- 上打开了Imaris 3D图像序列。选择“点”的命令，和用于最小的4个不同的定位点产生手动跟踪（鼠标点击+偏移）的所有时间点，如果有可能均匀地分布在该领域。
- 在“编辑曲目”选项卡中的“正确漂”命令应用漂移校正。
- 检查吨他修正在x，y和特别是在z与质量，以避免假象游移。
注意：如果修正不理想，尝试其他锚点或从分析中排除的视频。
- 细胞追踪
- 使用“添加新景点”命令，然后选择“跟踪点随着时间的推移”算法设置。进入下一步骤。
- 应用自动细胞跟踪过程无论是在关注使用“源通道”命令，整个通道。对象集（即，小区）直径10微米。进入下一步骤。
注：选择将取决于对象的测定信号和特异性之间的区别。总之，在整个信道的自动跟踪是可能的，只有检测到的信号是特定的感兴趣对象。因为无论SHG和ECFP由NDD 485短通滤波器后发现，跟踪将更加具体和有效的使用后5记录的NDD的ECFP信号00/550带通滤波器。群集或密集的包装对象将需要手动选择类似于步骤3.1.2单个对象。 - 选择“质量”过滤器类型，设置门槛，以排除非特异性的对象跟踪。进入下一步骤。
- 选择“布朗运动算法”两个点之间的“最大间距”和“间隙尺寸”的准确参数。验证轨迹生成。
- 一旦轨道被自动计算，选择“跟踪时间”过滤器类型，设置门槛，以消除轨道小于120秒（相当于4个时间点）。
- 强制性：经过自动跟踪，检查铁轨的质量。
- 展开时间条来检查对象跟随光道路径。如果没有，使用跟踪点校正的可用选项中的“编辑”选项卡：删除虚假或不正当的轨道与“删除”命令（删除任何轨迹Point单独使用“断开连接”命令）。如果跟踪路径是不连续的，加上缺少时间点（鼠标点击+移动），选择一个特定的轨道上的所有点，并使用“编辑曲目”选项卡“连接”命令。
- 量化参数
- 选择“首选项”命令中的“统计”选项卡中，选择列表中的权益的动态参数。选择“导出所有提交的统计数据”命令并保存生成的Excel文件。
注意：几个动态参数是直接从软件获得，例如轨道的长度，瞬时速度，平均速度，和跟踪直度。运动系数6,20可以被确定，但是不直接由软件提供。 - 对于每个小区，计算出位移为每个周期的时间（ΔT）的平均值（对于30秒的时间间隔的电影，ΔT为30，60，90秒，等等）。绘制方位移的平均值作为时间间隔的函数。通过计算该曲线的线性部分的斜率获得的蠕动系数。
- 选择“首选项”命令中的“统计”选项卡中，选择列表中的权益的动态参数。选择“导出所有提交的统计数据”命令并保存生成的Excel文件。
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Representative Results
鼠标的头骨结构提供了活体成像研究骨髓生理学的好机会。骨可绕前顶区薄，能够获得访问骨髓龛未经骨的磨损。 图1表示一个MacBlue转基因小鼠的头骨的宽2D场。骨基质主要是由胶原蛋白的我很容易被SHG 19检测。注射罗丹明-葡聚糖的污渍骨髓的血管网并允许对骨基质和容器14之间实质骨髓龛的鉴定。 ECFP细胞分布于骨髓的两个隔室，但是从骨基质缺席。单核细胞是根据组织内的位置手动分类。血管单核细胞被定义时，全细胞是血管内，不论该容器的尺寸。只有大收集静脉被排除在我们的一nalysis。实质的单核细胞被定义为当细胞所在脉管和骨基质之间。
感兴趣（补充视频1和2）的特定区域的延时成像允许单个细胞的轨迹的计算时间的推移对任一血管（ 图2A）或实质（ 图2B）的单核细胞。这条赛道的长度显示，实质单核细胞显示降低排量相比，血管单核细胞。的位移随时间的分析比较了两个室（ 图2C）的单核细胞的平均速度。均方位移作为时间的函数是随机运动的空间范围的量度。运动系数由该曲线的线性部分的斜率确定，并提供了一个更好的主意的小区位移（见讨论部分）。血管单核细胞（MC =71μm²/秒）的运动系数比所述蠕动coefficie更高实质单核细胞新台币（MC =4.4μm²/秒）。
采集的时间分辨率必须适应平均气泡速度。滚石血管单核细胞可以在很短的时间延迟做出重要的位移。为更精确的细胞跟踪，减小采集的时间间隔是优选的。 图3示出的单核细胞的跟踪与两个不同的时间分辨率的图示。将30秒的时间间隔减少了相比于10秒的时间间隔的精确度，以及该路径的长度（以绿色虚线）。
最后， 图4示出了伴随分析另一小区的子集，以单核细胞的可能性。 Ly6G是成熟的中性粒细胞小鼠的特异性指标。抗Ly6G的注入结合荧光染料（在这种情况Phyco-erythrin）成像序列染色嗜中性粒细胞，直接在体内之前5分钟。这种方法提供了一个额外的暗淡分析和可能性的ension比较不同细胞亚群的行为。这样的方法可以被用来定义在单核细胞区室的子集。
颅骨骨髓组织的图1的宽视野。颅骨稳态骨髓MacBlue小鼠体内的双光子激光扫描显微图像。血管（红色）是由尾静脉注射2MDa罗丹明葡聚糖5分钟成像会议之前染色。骨是由二次谐波生成（蓝色）可视化。 ECFP +单核细胞（青色）位于实质龛（血管和骨之间的暗区）内的血管内。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.实时跟踪的细胞。在（A）的血管和（B）的实质以及单核细胞时代表曲目路径。轨道（绿线）为每个小区都通过软件自动生成的。红色斑点表示跟踪细胞的质量中心。血管和实质的单核细胞之间（C）的平均流速的比较。曼-惠特尼的统计分析被执行，***表示P <0001。（D）的平均平方位移（MSD）作为时间的函数被表示为血管和实质的单核细胞。渐近曲线表示细胞随时间的约束的位移，而线性曲线表示随机游动的一个非约束的环境。运动系数表明细胞位移的程度，由C的斜率确定 urve通过线性回归计算。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.时间间隔分辨率滚动单核细胞的研究。代表性的图像序列显示，增加的时间分辨率提高精密滚动细胞轨迹。 （上）用10秒的时间间隔的图像序列。 （下）用30秒的时间间隔的图像序列。轨道路径的质量得到改善，考虑两种不同的细胞相同或相反的风险降低。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.体内共定位髓质嗜中性粒细胞和单核细胞的。该图显示以检测体内另一小区子集与之同时单核细胞，通过注入特异性单克隆抗体结合的荧光染料的可能性。 2微克Ly6G-PE抗体已经静脉注射前5分钟MacBlue鼠标头骨骨髓成像。 请点击此处查看该图的放大版本。
实质的单核细胞的补充视频1.洄游行为。 在体内三维成像在MacBlue小鼠的颅骨骨髓实质的单核细胞的稳态迁移活性的。该ECFP +信号是青色。每个单元（红点）的迁徙路径显示为绿色。
血管单核细胞的补充视频2.洄游行为。 在体内三维成像在MacBlue小鼠的颅骨骨髓血管单核细胞的稳态迁移活性的。该ECFP +信号是青色。 （2M DA）罗丹明 - 葡聚糖被成像会话之前注入以区分骨髓脉管（红色）。每个单元（红点）的迁徙路径显示为绿色。
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Discussion
体内成像方法的关键点是，以确保以最大限度成像的持续时间，并尽量减少细菌污染和炎症，这可能会影响炎性细胞的动力学的风险的焦点的稳定性。颅骨骨髓成像如下这些目标为手术执行以访问骨髓是最小的。利用无菌材料和防腐剂的必须限制感染可能诱导扰动在细胞稳态的风险。
立体定向持有人的发展可能是具有挑战性的，并要求（客观的和机动阶段显微镜，使用煤气气雾的麻醉之间的距离）为每个系统特定的定制。以获得鼠标的头部尽可能的水平为更广泛的成像表面接触，它是重要的。一旦动物被定位，它很可能是几分钟即可requir编得到焦平面的良好的稳定性。因此，建议在启动采集记录之前检查组织漂移。由于此过程连同感兴趣区域的选择可以持续一段时间，还建议定期检查该动物是无意识的，如果氯胺酮/赛拉嗪已被使用，并检查是否有客观的正确的浸泡漏和蒸发罐发生。
头骨上的橡胶圈的良好的定位表示在此过程中的另一关键步骤。氰基丙烯酸酯胶提供了稳定性和密封方面良好的结果，但是人们需要防止过载的胶，其可涵盖颅骨和块获得的组织的感兴趣区域。颅骨直接浸渍的无玻璃盖玻片的优点是可以访问的骨的更深区域。另外，由于该头骨的是不是一个普通的表面上，这将不会对成像区域限制到CON颅骨和盖玻片之间圆通表面，允许一个宽摄像视场，如显示在图1中。
对于所有的成像技术，采集速度和分辨率质量之间的选择是一种妥协。因此，数量和单位时间内的图像的质量是有限的，并且选择取决于处理的科学问题。通常情况下，血管单核细胞快速滚动细胞，而单核细胞实质是缓慢游动或无蒂。轧制单元的准确的跟踪要求获取更高的时间分辨率， 如图2。最高成像速度为固着细胞是无用的，高的x，y和z分辨率可以优选以分析树突例如凸活性。快速单元将需要更厚的体积让他们流离失所较长跟踪Z轴。
不提供软件了Imaris均方位移作为时间的函数。该princip这种表示基于这样的事实的文件，对于一个物体弹道行进而没有任何遭遇或结构收缩，其移动的距离将是成比例的时间间隔（ 图2D）。因而斜率线性表示随机游动的一个非约束的环境。与此相反，该曲线的渐近形状将反映在细胞群的时间约束的位移。这一计算的第二个优点是速度有时由质量中心的假象位移高估。这是用于与凸活性缓慢游动细胞尤为重要。因此，通过线性回归计算出的曲线的斜率的运动系数的计算表明的cellover时间21真实位移。
Ly6G染色体内示出的可能性，以在成像过程中添加的分析一个新的参数（ 图3中 等 ）。尽管98％以上的血管嗜中性粒细胞的适当标记，骨髓嗜中性粒细胞的染色效率较低，平均荧光强度大大减少，这表明朝向骨髓实质抗体的减少存取（数据未示出）。罗丹明葡聚糖，量子点，或细胞凋亡或坏死的细胞如大埤，碘化丙啶的其它特定染料，SYTOX 22，或荧光报道细胞的功能，如生产活性氧23，可以通过静脉内，通过尾静脉成像过程中加入流程并提供一个很好的机会来量化的功能特性，如细胞死亡，吞噬和中性粒细胞胞外陷阱。梅佐等 12很好地使用了两种不同的血管染料具有低分子量和高分子量，以更好的对比度实质和脉管。荧光染料的选择是关键的，以允许伴随采集不同荧光报告的。的确，激发波长将被相应地选择，以获得所有的荧光染料之间的最佳折衷。
这里所用的协议，能够在体内分析细胞室，其研究难以迄今的生物活性。骨髓组织的组织学分析通常需要很长的准备骨脱钙的，以允许薄膜部，并且仅提供了组织的静态视图。动态视图突出的实质和骨髓血窦之间的细胞交换的速度。这种快速的过程，才能有对炎症信号5或预处理化疗myeloaplasive更好地了解细胞动员机制，破译了关键的一步保养法6。我们已经报道细胞血管内6的事件，但是这个过程是几乎检测不到由于在稳定状态下的低频率。然而，很可能在炎症信号得到加强。趋化因子受体，如CCR2，CX3CR1或CXCR4高度牵连在血管内的过程中，因此，使用这些受体应提供在细胞迁移的途径新颖基本见解的遗传无效的
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Acknowledgments
作者要感谢安妮·达龙和皮埃尔路易斯Loyher为编辑的协助下，PLATEFORME Imagerie萨伯特慈善（PICPS）与双光子显微镜和动物基金“NAC”和卡米尔Baudesson小鼠繁殖援助援助。这项研究导致这些结果已收到的资金来自欧盟第七框架计划（FP7 / 2007至2013年）根据赠款协议N°304810 - 的RAID和n°241440-Endostem，从INSERM，从UNIVERSITE皮埃尔与玛丽·居里“崛起“从LA”法甲驳乐毒瘤“，从”协会倒拉RECHERCHE河畔乐癌症“和”法新社国立德拉RECHERCHE“计划诞生日（ANR-EMMA-050）。 PH由LA“法甲驳乐癌症”的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
