Protocol
HINWEIS: Alle Experiment Protokolle wurden von der Französisch Tierversuche und Ethik-Kommission genehmigt und vom "Service Protection et Santé Animales, Environnement" mit der Nummer A-75-2065 validiert. Probengrößen werden so gewählt, um die Reproduzierbarkeit der Experimente zu gewährleisten und nach dem 3R tierischen Ethik Regulierung.
1. Herstellung der Mäuse
- Anästhesie
- Für kurze Zeit der Bildgebung (weniger als 1 Stunde), betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 200 ul einer Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg).
- Alternativ kann für längere Zeitabbildung (bis zu 4 h), anaesthetize der Maus bei einer Inhalation von Isofluran 2,5% in einer 70/30 Mischung von O 2 / N 2 O, verdampft durch eine angepasste Maske.
- HINWEIS: Auf diese Weise sorgt für stabilere Bewusstlosigkeit und vermeidet Serien intraperitoneale Injektion von Drogen. Sobald die Maus betäubt, überprüfen Bewusstlosigkeit durch Stimulation der Fußsohle mit Zangen.
- Gefäßfärbung / zusätzliche Färbung
- Für vaskuläre Färbung: intravenös injizieren in die Schwanzvene wurden 200 ul Rhodamin-Dextran (2 MDa, 10 mg / ml in Kochsalzpuffer).
- Für Neutrophilen-Färbung: injizieren 2 ug Ly6G-PE (Klon 1A8) in 100 ul Kochsalzlösung, intravenös in die Schwanzvene.
- Immobilisierung
- Zur Immobilisierung, verwenden Sie eine maßgeschneiderte stereotaktischen Halterung an das Mikroskop und mit dem Narkosegas Inhalator angepasst.
HINWEIS: Die stereotaktische Halter ist ein Metallträger mit zwei Metallplatte Klammern, von denen einer fest und der andere Wechsel und anpassungsfähig, um den Kopf des Tieres fest. - Installieren Sie den Kopf der Maus zwischen den Halteplatten isoliert von Atembewegungen zu gewährleisten. Ziehen Sie die Ohren zwischen Halteplatten und den Kopf auf die sk streckenin. Prüfen Sie für die Stabilität und die Atmung Wohlbefinden der Tiere.
- Zur Immobilisierung, verwenden Sie eine maßgeschneiderte stereotaktischen Halterung an das Mikroskop und mit dem Narkosegas Inhalator angepasst.
- Entfernen Sie die Kopfhaut
- Vorsichtig mit 70% igem Ethanol, um das Haar von der Kopfhaut mit einem sterilen Applikators benetzen, Vermeidung von Kontakt mit den Augen.
- Schneiden Sie die Haut mit einer sterilen Schere und Zange, die Kopfhaut von der Rückwärts des Scheitelbein vollständig zu entfernen, um das Stirnbein. Fernhalten von bis zu 3 mm von Augen und Ohren, um umfangreiche Blutungen zu verhindern. Entfernen Sie die Abdeckung des Schädels (Knochenhaut) lockerem Bindegewebe. Waschen Sie die restlichen Haare mit warmem PBS getränkten Papiertuch.
- Immersion-System einrichten
- Fügen Sie einen Gummiring von 18 mm Durchmesser mit chirurgischer Kleber direkt auf den Schädel mit einer kleinen Nadel zu Verteilung zu steuern. Kleben den gesamten Umfang des Gummirings, um das Auslaufen zu verhindern (30 & mgr; l ausreichend sein).
- Reinigen Sie den Schädel unter dem Ring ein letztes Mal mit PBS-getränkten Papiertuch und fügen Sie dann 37 ° C PBS für ein vollständiges Eintauchen derSchädel. Fügen Sie einen Tropfen 0,9% NaCl-Lösung oder bestimmte Augensalbe auf jedem Auge der Maus an Augentrockenheit zu vermeiden. Ziehen Sie den stereotaktischen Halterung im Rahmen des Ziels.
- Etwa positionieren Sie den Bereich mit dem Mikroskop Okular durch direkte Übertragung.
2. Zwei-Photonen-Imaging Acquisition
- Verwenden einer Multiphotonen-Mikroskop in Verbindung mit einem Ti: Saphir-Kristall-Laser, der Impulse von 140fs NIR-Licht enthält, selektiv abstimmbar von 680 bis 1.080 nm und einen akusto-optischen Modulator für die Laserleistungssteuerung. Verwenden Sie eine Konfiguration mit 3 externen nichtdescannten Detektoren (NDD) mit einer Kombination von zwei dichroitischen Spiegel (565 nm und 690 nm), 565/610 und 500/550 Bandpassfilter (die gleichzeitige Aufnahme von 3 Fluoreszenzkanäle zu ermöglichen), und einen 485 Kurzpassfilter, mit einem Plan Achromat × 20 (NA = 1) Wasserimmersionsobjektiv.
- Stellen Sie den Heizraum, gute homeothermy der ANAES ermöglichenthetized Maus.,
HINWEIS: Temperatur vielleicht 1 Stunde eingestellt werden, bevor die Abbildung Sitzung für eine bessere Stabilität. In unserem Fall 32 ° C wurde gewählt, um eine optimale Körpertemperatur des anästhesierten Maus (36-37 ° C) erhalten und ist für bis zu 4 h gehalten. Diese Temperatur kann mit dem System verwendet (digital Sonde kann verwendet werden, um diesen Punkt zu überprüfen) angepasst werden. Darüber hinaus ist das verwendete Heizkammer dunkel / schwarz und deckt einen Teil des Systems (Ziele und motorisierten Platte) fremdlicht Kontamination zu vermeiden. - Schalten Sie das System
- Einschalten des Ti: Saphir-Laser, dann das gesamte Mikroskopsystem. Starten Sie die Erfassungssoftware. Stellen Sie den Laser-Wellenlängenbereich um 870 nm. Wählen Sie die entsprechende NDD für die Aufnahme.
HINWEIS: In unserem Fall sind Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) 19 und cyan fluoreszierende Protein (ECFP) durch die NDD nach 485 Kurzpassfilter detektiert. ECFP wird auch durch die NDD detektiert, nachdem die 500/550 Bandpaßfilter und Rhodamin-Dextran wird durch t detektierter NDD nach dem 565/610 Bandpassfilter.
- Einschalten des Ti: Saphir-Laser, dann das gesamte Mikroskopsystem. Starten Sie die Erfassungssoftware. Stellen Sie den Laser-Wellenlängenbereich um 870 nm. Wählen Sie die entsprechende NDD für die Aufnahme.
- Passen Akquisition Einstellungen
- Verwenden Sie die "Live-Akquisition" Imaging-Befehl der Software und mit dem Mikroskop Wege, stellen Sie den Fokus auf eine Region mit ECFP und Rhodamin-Signal. Eingestellt, die Laserleistung auf ein Minimum, um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei minimalen Photoschäden zu erhalten.
HINWEIS: Die Leistungseinstellung variiert je nach der Tiefe der Bereich von Interesse. Typischerweise werden die AOM-Einstellungen werden rund 20%, die eine Laserleistung über das Ziel um 15 mW repräsentiert gesetzt. Es ist besser, Gewinn Macht auf den PMTs erhöhen für jeden NDD an Photobleaching und Foto-Schaden zu reduzieren. Typische Erfassungseinstellungen einzigen Abtastung mit einem Pixelverweilzeit von 1,58 & mgr; s und einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln mit einer 1,5 Vergrößerung.
- Verwenden Sie die "Live-Akquisition" Imaging-Befehl der Software und mit dem Mikroskop Wege, stellen Sie den Fokus auf eine Region mit ECFP und Rhodamin-Signal. Eingestellt, die Laserleistung auf ein Minimum, um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei minimalen Photoschäden zu erhalten.
- Wählen Sie die Regionen von Interesse
- Sobald die Aufnahme Parameter eingestellt sind, verwenden Sie erneut die "live" Erwerb Befehl,und Erhebung des Gewebes, um eine gewünschte (x, y, z) der Wert in Echtzeit überwacht werden soll.
HINWEIS: In der Regel haben wir uns für ein Feld sowohl vaskuläre und parenchymale Bereichen. - Registrieren Sie das Feld mit der "Position" Softwarebefehl.
ANMERKUNG: Dieser Befehl speichert x, y, z-Koordinaten der verschiedenen entfernten Bereichen. - Wählen und registrieren zusätzliche Felder von Interesse (bis zu 3) nach dem gleichen Verfahren.
- Festlegen eines 3D-Z-Stapel mit dem "Z-Stapel" Softwarebefehl auf der ersten gespeicherten Position entsprechend der gewünschten Lautstärke mit gewählten Vergrößerung. Merken tieferen Position zuerst, und dann die höchste Position. Normalisieren Laserleistung mit der Tiefe.
HINWEIS: Bei mehreren gleichzeitigen Feldabbildung, so erwerben wir 5 Scheiben von 3 & mgr; z-Schritte für jedes Feld getrennt werden, um ein Volumen von 12 & mgr; m Dicke zu erwerben. Diese Einstellungen werden auf die Art der Zelle untersucht angepasst werden.
- Sobald die Aufnahme Parameter eingestellt sind, verwenden Sie erneut die "live" Erwerb Befehl,und Erhebung des Gewebes, um eine gewünschte (x, y, z) der Wert in Echtzeit überwacht werden soll.
- Starten Erwerb
- Wählen Sie das220, Reihe "Software-Befehl und wählen Sie die Dauer des Zeitintervalls und die Anzahl der Zyklen der Zeit. Beginnen Sie Zeitraffer-Bildgebung nach dem Zeitablauf und Dauer, indem Sie die "Start-Experiment" Software-Befehl erforderlich.
HINWEIS: In unserem Fall haben wir ein Volumen jeweils 30 s bei 60 Hz entspricht 30 min Echtzeit zu erwerben. Kleinere Zeitablauf durchgeführt, um schnelle Zellvoll in das Blutgefäß zu verfolgen. In diesem Fall dünner z-Stapels und nicht mehr als 2 verschiedenen Felder können gleichzeitig aufgezeichnet werden. - Eine regelmäßige Überwachung der Einrichtung.
- Immer überwachen das Tier, um sicherzustellen, sie bewusstlos ist.
HINWEIS: Schütteln der Whisker oder Beine des Tieres sind Indikatoren für die Wiederbelebung. Im Falle des Tieres Atmung ruckartig, kann die Menge von Isofluran leicht reduziert werden. Starke Gewebedrift während Akquisition ist ein Indikator für Maus Revival. - Stellen Sie sicher, das Ziel richtig eingetaucht. Erneuern 37ºC PBS between zwei Akquisitionen (30 min).
HINWEIS: Progressive Verschwinden des Signals während der Erfassung ist Indikator für die PBS Leckage.
- Immer überwachen das Tier, um sicherzustellen, sie bewusstlos ist.
- Wählen Sie das220, Reihe "Software-Befehl und wählen Sie die Dauer des Zeitintervalls und die Anzahl der Zyklen der Zeit. Beginnen Sie Zeitraffer-Bildgebung nach dem Zeitablauf und Dauer, indem Sie die "Start-Experiment" Software-Befehl erforderlich.
- Ende der Prozedur
- Wenn die benötigten Videos aufgezeichnet werden, das Tier einschläfern durch Genickbruch schnell vor Reanimation.
HINWEIS: Wundheilung führt zur Bildung einer Kruste in 24 bis 48 h, was die Möglichkeit zur Längs- Bildgebung auszuführen begrenzt.
- Wenn die benötigten Videos aufgezeichnet werden, das Tier einschläfern durch Genickbruch schnell vor Reanimation.
3. Datenanalyse
- Driftkorrektur
- Verwenden Imaris Bitplane Software für 3D-automatische Verfolgung.
- Öffnen Sie die 3D-Bildfolge auf Imaris. Wählen Sie "Spot" Befehl ein, und erzeugen eine manuelle Spur (Mausklick + Shift) für alle Zeitpunkte für mindestens 4 verschiedene Ankerpunkte, möglichst homogen im Feld verteilt.
- Übernehmen Sie die Driftkorrektur mit dem Befehl "richtigen Drift" im Register "Bearbeitungsspur".
- Prüfen Sie, ob ter Qualität der Korrektur in x, y und z, um vor allem in Artefakt Schwanken zu vermeiden.
HINWEIS: Wenn die Korrektur nicht zufrieden stellend, versuchen andere Ankerpunkte oder ausschließen das Video von der Analyse.
- Zellverfolgung
- Verwenden Sie "add new spots" Befehl und wählen Sie "Spur-Spots im Laufe der Zeit" Algorithmus-Einstellung. Zum nächsten Schritt.
- Bewerben automatischen Zelltrackingverfahren entweder auf der gesamten interessierenden Kanal mit "Quellkanal" -Befehl. Gruppenobjekte (dh Zellen) Durchmesser bis 10 um. Zum nächsten Schritt.
HINWEIS: Die Wahl wird auf die Unterscheidung zwischen Objekten und Spezifität des Messsignals abhängen. Kurz gesagt, ist die automatische Verfolgung im ganzen Kanal nur möglich, wenn erfasste Signal spezifisch für das Objekt von Interesse ist. Da sowohl SHG und ECFP werden von der NDD nach 485 Kurzpassfilter erkannt wird, wird Tracking präziser und effizienter mit dem ECFP Signals durch die NDD nach der 5 aufgenommen sein00/550 Bandpassfilter. Gruppierten oder dichtgepackten Objekte manuelle Auswahl der ähnlich wie in Schritt 3.1.2 einzelne Objekte erfordern. - Wählen Sie "Qualität" Filtertyp können Sie den Schwellwert auf Verfolgung von unspezifischen Objekte ausschließen. Zum nächsten Schritt.
- Wählen Sie "Brownschen Algorithmus Motion" mit genauen Parameter "Max Abstand" und "Gap Größe" zwischen zwei Punkten. Bestätigen Track Generation.
- Sobald Spuren werden automatisch berechnet, "Spurdauer" Filtertyp auswählen, stellen Sie den Schwellenwert auf Spuren zu beseitigen kürzer als 120 Sekunden (die 4 Zeitpunkte).
- Obligatorisch: Nach dem automatischen Verfolgung, prüfen Sie die Qualität der Tracks.
- Rollen Sie die Zeitleiste, um zu überprüfen, dass die Objekte folgen Bahnverläufe. Wenn nicht, verwenden Sie die Optionen der Spur Punktkorrektur in der Registerkarte "Bearbeiten": Löschen Sie falsche oder unsachgemäße Spuren mit "Löschen" -Befehl (löschen jede Spur point einzeln mit dem Befehl "Trennen"). Wenn Track-Pfad unterbrochen ist, fügen fehlenden Zeitpunkten (Mausklick + Shift), wählen Sie alle Punkte auf einer bestimmten Spur, und verwenden Sie den Befehl "Verbinden" auf der Registerkarte "Track bearbeiten".
- Quantifizierung Parameter
- Wählen Sie die Registerkarte "Statistik" im Befehl "Einstellungen", wählen Sie die dynamischen Parameter von Interesse in der Liste. Wählen Sie "Exportieren Sie alle Statistiken in Datei" Befehl und speichern Sie die Excel-Datei erzeugt.
HINWEIS: Mehrere dynamische Parameter werden direkt aus der Software erhalten, wie Bahnlängen, momentane Geschwindigkeit, mittlere Geschwindigkeit und verfolgen Geradheit. Motilität Koeffizienten 6, 20 ermittelt werden kann, ist jedoch nicht direkt durch die Software zur Verfügung gestellt. - Für jede Zelle berechnet den Mittelwert der Verschiebungen für jeden Zeitraum (& dgr; t) (bei einem 30 Sek Zeitrafferfilm, wird & dgr; t 30, 60, 90 Sekunden, usw. sein).Zur Erstellung der Mittelwert der quadratischen Verschiebung als eine Funktion des Zeitintervalls. Erhalten Motilität Koeffizienten durch Berechnen der Steigung des linearen Teils der Kurve.
- Wählen Sie die Registerkarte "Statistik" im Befehl "Einstellungen", wählen Sie die dynamischen Parameter von Interesse in der Liste. Wählen Sie "Exportieren Sie alle Statistiken in Datei" Befehl und speichern Sie die Excel-Datei erzeugt.
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Representative Results
Mäuseschädelstruktur bietet eine gute Gelegenheit, die Knochenmark Physiologie von Intravital Imaging studieren. Der Knochen dünn um den vorderen Scheitelbereich, ist es möglich, Zugang zur Mark Nischen ohne Abrieb des Knochens zu erhalten. 1 stellt eine breite 2D Bereich des Schädels eines MacBlue transgenen Maus. Die Knochenmatrix wird hauptsächlich aus Kollagen I leicht durch SHG 19 feststellbar. Injektion von Rhodamin-Dextran färbt die Gefäßnetz des Knochenmarks und ermöglicht die Identifizierung von parenchymalen Knochenmark Nischen zwischen der Knochenmatrix und die Gefäße 14. ECFP Zellen werden in den beiden Kammern des Knochenmarks wird, aber fehlen in der Knochenmatrix. Monozyten werden manuell nach ihrer Lage im Gewebe klassifiziert. Gefäß Monozyten wird definiert, wenn die gesamte Zelle ist innerhalb des Gefäßsystems, ungeachtet der Größe des Behälters. Nur große Sammeln Venolen werden von unserem a ausgeschlossennalyse. Parenchymalen Monozyten wird definiert, wenn die Zelle zwischen der Vaskulatur und der Knochenmatrix befindet.
Zeitraffer-Bildgebung von spezifischen Interessenbereich (Ergänzungs Video 1 und 2) ermöglicht die Berechnung der einzelnen Zell Trajektorie über die Zeit für entweder Gefäß (2A) oder parenchymalen (2B) Monozyten. Die Streckenlänge zeigt, dass parenchymale Monozyten Display reduziert Verschiebung im Vergleich zu Gefäß Monozyten. Analyse der Verschiebung über die Zeit vergleicht die Durchschnittsgeschwindigkeit von Monozyten in beiden Abteilen (2C). Die mittlere quadratische Verschiebung als eine Funktion der Zeit ist ein Maß für die räumliche Ausdehnung der Zufallsbewegung. Motilität Koeffizient wird durch die Steigung des linearen Teils der Kurve bestimmt und stellt eine bessere Vorstellung von der Zelle Verschiebung (siehe Diskussion Abschnitt). Die Motilität Koeffizienten Gefäß Monozyten (MC = 71μm² / s) höher als der Motilität coefficient parenchymaler Monozyten (MC = 4.4μm² / s).
Die Zeitauflösung der Erfassungs müssen der durchschnittliche Zellgeschwindigkeit angepasst werden. Rollgefäß Monozyten können wichtige Verschiebung innerhalb einer kurzen Zeitverzögerung zu machen. Für eine genauere Zellverfolgung ist die Verringerung der Zeitspanne der Übernahme bevorzugt. Figur 3 zeigt eine Darstellung der Monozyten Verfolgung mit zwei verschiedenen Zeitauflösungen. Ein 30 Sekunden Zeitintervall verringert, verglichen mit 10 Sekunden Zeitintervall die Genauigkeit als auch die Länge der Bahnen (grün gestrichelte Linie).
Schließlich zeigt 4 die Möglichkeit, eine andere Zellenteilsatz gleichzeitig an Monozyten zu untersuchen. Ly6G ist ein spezifischer Marker für reife Maus-Neutrophilen. Die Injektion von Anti-Ly6G kombiniert mit einem Fluorochrom (in diesem Fall Phyco-Erythrin) 5 min vor der Bildgebungssequenz Flecken Neutrophilen direkt in vivo. Dieser Ansatz bietet eine zusätzliche dimension der Analyse und der Möglichkeit, das Verhalten der verschiedenen Zelluntergruppen zu vergleichen. Ein solches Vorgehen könnte verwendet werden, um Teilmengen in den Monozyten Fächer definieren.
Abbildung 1. Breites Feld der Schädelknochenmark-Organisation. In vivo Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie Bild des Schädels stationären Knochenmark aus MacBlue Maus. Gefäßsystem (in rot) wird durch Schwanz vergeblich Injektion 2MDa Rhodamin-Dextran-5 min vor Bildgebungssitzung gefärbt. Der Knochen wird durch die Erzeugung der zweiten Harmonischen (blau) sichtbar gemacht. ECFP + Monozyten (Cyan) innerhalb parenchymal Nischen (dunkle Bereiche zwischen Gefäßen und Knochen) und in den Gefäßen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Echtzeit-Tracking-Zelle. Vertreter Spurwege entlang Zeit von Monozyten in (A) des Gefäßsystems und (B) das Parenchym. Tracks (grüne Linie) für jede Zelle werden von der Software automatisch generiert. Rote Flecken stellen die Massenschwerpunkt verfolgt Zellen. (C) mittlere Geschwindigkeit Vergleich zwischen vaskulären und parenchymale Monozyten. Mann-Whitney statistischer Analyse durchgeführt worden ist, stellt *** p <0,001. (D) Mittlere quadratische Verschiebung (msd) als eine Funktion der Zeit für die vaskuläre und parenchymale Monozyten repräsentiert. Asymptotische Kurve zeigt die eingeschränkte Bewegung der Zellen über die Zeit, wohingegen lineare Kurve zeigt Random Walk in einer nicht-eingeschränkten Umgebung. Motilität Koeffizienten zeigt das Ausmaß der Zell Verschiebung und wird von der Neigung der c bestimmt urve durch lineare Regression berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Zeitintervall Auflösung bei der Untersuchung von Roll Monozyten. Vertreter Bildsequenzen zeigen, dass eine erhöhte zeitliche Auflösung verbessert die Genauigkeit der Rollbahn-Zelle. (Up) Bildfolge mit 10 Sekunden Zeitintervalle. (Down) Bildfolge mit 30 Sekunden Zeitintervalle. Die Qualität des Spurbahn wird verbessert und das Risiko der Berücksichtigung zwei verschiedene Zellen für die gleiche oder die entgegengesetzte reduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. In vivo Colokalisierung medullären Neutrophilen und Monozyten. Diese Figur zeigt die Möglichkeit, eine andere Zell-Untergruppe in vivo gleichzeitig mit Monozyten erkennen, durch Injizieren spezifischer monoklonaler Antikörper in Kombination mit einem Fluorochrom. 2 ug Ly6G-PE-Antikörper wurde 5 min vor Schädelknochenmark-Bildgebung des MacBlue Maus intravenös injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Ergänzende Video 1. Zugverhalten parenchymal Monozyten. In-vivo-3D-Bildgebung des stationären Migrationsaktivität von Monozyten in der Schädelknochenmark Parenchym eines MacBlue Maus. Die ECFP + Signal in Cyan. Migrationspfade für jede Zelle (roter Punkt) erscheint in grün.
Ergänzende Video 2. Migrationsverhalten von Gefäß Monozyten. In-vivo-3D-Bildgebung des stationären Migrationsaktivität von Monozyten in der Schädelknochenmark Gefäßsystem eines MacBlue Maus. Die ECFP + Signal in Cyan. (2M Da) Rhodamin-Dextran wurde vor der Bildgebungssitzung injiziert, um die Knochenmark Vaskulatur (rot) zu unterscheiden. Migrationspfade für jede Zelle (roter Punkt) erscheint in grün.
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Discussion
Die kritischen Punkte der in vivo Bildgebung Methodik, um die Stabilität der Ausrichtung, um die Dauer der Bildgebung zu maximieren und das Risiko einer bakteriellen Kontamination und Entzündungen, die die Dynamik der entzündlichen Zellen auswirken können, zu minimieren gewährleisten. Imaging Schädelknochenmark folgt diese Ziele auf die Operation durchgeführt, um Zugang zu dem Knochenmark zu erhalten, ist minimal. Die Verwendung von sterilem Material und Antiseptika ist wichtig, um das Risiko von Infektion, die Störung in Zellhomöostasie induzieren könnten, zu begrenzen.
Die Entwicklung der stereotaktischen Halter könnte eine Herausforderung sein und erfordert spezifische Anpassung für jedes System (Abstand zwischen Objektiv und Motortisch des Mikroskops, die Verwendung von Gas Inhalator für Anästhesie). Es ist wichtig, den Kopf der Maus möglichst horizontal für eine größere Bildfläche Zugang zu erhalten. Sobald das Tier angeordnet ist, ist es wahrscheinlich, dass einige Minuten kann requir seined um eine gute Stabilität der Fokusebene zu erhalten. Daher empfiehlt es sich, für die Gewebe Drift überprüfen vor dem Start der Akquisition Aufnahme. Da dieser Prozess mit der Auswahl der Regionen von Interesse kann eine Weile dauern, wird auch empfohlen, regelmäßig zu überprüfen, dass das Tier bewusstlos wenn Ketamin / Xylazin verwendet worden sind, und um die richtige Eintauchen des Ziels zum Auslaufen oder Verdunstung kann überprüfen auftreten.
Die gute Positionierung der Gummiring auf dem Schädel ist ein weiterer kritischer Schritt in dem Prozeß. Sekundenkleber liefert gute Ergebnisse in Bezug auf Stabilität und Dichtung, aber man braucht, um eine übermäßige Belastung der Klebstoff, der den Schädel und den Zugriff auf den interessierenden Bereich des Gewebes zu decken könnten. Der Vorteil der direkten Eintauchen des Schädels ohne Deckglas ist es, den Zugang zu tieferen Regionen des Knochens zu erhalten. Zusätzlich kann, da der Schädel ist keine ebene Fläche, es wird nicht die Bilderzeugungsfläche zum con begrenzenKontaktfläche zwischen dem Schädel und dem Deckglas, so dass ein breites Bildfeld, wie in Abbildung 1 dargestellt.
Für alle bildgebenden Verfahren ist die Wahl zwischen Aufnahmegeschwindigkeit und Auflösung Qualitäts ein Kompromiss. Somit kann die Anzahl und die Qualität der Bilder pro Zeiteinheit begrenzt sind, und die Wahl hängt von der wissenschaftlichen Fragestellung gerichtet. Typischerweise werden Gefäß Monozyten schnell roll Zellen, während parenchymal Monozyten sind langsam bewegliche oder festsitzende. Eine genaue Überwachung des rollenden Zellen erfordert eine höhere zeitliche Auflösung der Akquisition, wie in Abbildung 2 dargestellt. Hohe Bildrate für festsitzenden Zellen ist nutzlos und Hoch x, y, z-Auflösung können vorgezogen, vorstehenden Tätigkeit von Dendriten zum Beispiel analysieren. Schnelle Zellen dicker Band, um eine längere Verfolgung ihrer Verschiebung in z zu erfordern.
Die mittlere quadratische Verschiebung als Funktion der Zeit wird durch die Software nicht Imaris vorgesehen. Die principle von dieser Darstellung auf der Grundlage der Tatsache, dass für ein Objekt ballis können sie ohne Zusammenstoß oder strukturelle Verengung, die Distanz gereist wäre proportional zu dem Zeitintervall (Figur 2D). Somit Linearität der Steigung zeigt eine Zufallsbewegung in einem nicht-eingeschränkten Umgebung. Im Gegensatz dazu würde asymptotische Form der Kurve eine erzwungene Verschiebung über die Zeit der Zellpopulation zu reflektieren. Der zweite Vorteil dieser Berechnung ist, daß die Geschwindigkeit wird manchmal durch artefactual Verschiebung des Massenmittelschätzt. Dies ist besonders wichtig für langsame bewegliche Zelle mit vorspringenden Aktivität. Somit Berechnung der Motilität Koeffizienten durch die Neigung der durch lineare Regression berechnet Kurve zeigt eine echte Verschiebung des cellover Zeit 21.
Ly6G Färbung in vivo veranschaulicht die Möglichkeit, eine neue Analysegröße während des Abbildungsprozesses hinzuzufügen (Abbildung 3 et al in press) beobachtet. Obwohl mehr als 98% des Gefäß Neutrophilen ordnungsgemäß gekennzeichnet, ist das Färben von Knochenmark Neutrophilen weniger effizient, und die mittlere Fluoreszenzintensität stark reduziert wird, was auf den geringeren Zugang des Antikörpers in Richtung des Knochenmark Parenchym (Daten nicht gezeigt). Rhodamin Dextran, Quantenpunkte oder andere spezifische Farbstoffe der apoptotischen oder nekrotischen Zellen, wie DAPI Propidiumiodid SYTOX 22 oder fluoreszierenden Reporter für die Zellfunktionen, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies 23 kann intravenös durch die Schwanzvene während der Bilderzeugung gegeben werden Prozess und bieten eine gute Gelegenheit, um funktionale Eigenschaften wie Zelltod, Phagozytose und Neutrophilen extrazellulären Falle zu quantifizieren. Mazo et al 12 schön verwendet zwei verschiedene Gefäß Farbstoffemit niedrigem und hohem Molekulargewicht, um einen besseren Kontrast Parenchym und Gefäßsystem. Die Wahl der Fluoreszenzfarbstoff ist für die gleichzeitige Erfassung der verschiedenen fluoreszierenden Reportern ermöglichen. Tatsächlich wird die Anregungswellenlänge entsprechend ausgewählt werden, um den besten Kompromiss zwischen allen verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe zu erhalten.
Die hier verwendete Protokoll ist es möglich, in vivo Analyse der biologischen Aktivität eines Zellkammer, Studie, von denen war bislang schwierig. Die histologische Analyse der Knochenmarksgewebe erfordert in der Regel eine lange Vorbereitung Knochenentkalkung zu Dünnschnitt zu ermöglichen, und es gibt nur eine statische Sicht des Gewebes. Die dynamische Sicht unterstreicht die Rate der Zellaustausch zwischen dem Parenchym und die Knochenmarksinuskurven. Dieses schnelle Verfahren ist ein entscheidender Schritt, um ein besseres Verständnis der Zellmobilisierung Mechanismus bei entzündlichen Signal 5 oder Präkonditionierung myeloaplasive Chemotherapie entziffernregimen 6. Wir haben Falle Zelle intravasation 6 angegeben, aber dieses Verfahren ist aufgrund der niedrigen Frequenz im stationären Zustand kaum nachweisbar. Es ist jedoch wahrscheinlich auf entzündliche Signalisierung verstärkt werden. Chemokinrezeptoren wie CCR2, CX3CR1 oder CXCR4 sind stark in den Prozess der intravasation gebracht, damit die Verwendung von genetischen Invalidierung dieser Rezeptoren sollten neue grundlegende Einsichten in die Wege der Zellmigration bereitzustellen
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Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Anne Daron und Pierre Louis Loyher für redaktionelle Unterstützung danken, die Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) für die Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskop und das Tier Facility "NAC" und Camille Baudesson für Mäuse züchten Unterstützung. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr 304.810 - RAIDs und Nr 241.440-EndoStem von Inserm, der Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", von la" Ligue contre le cancer ", von" Association pour la Recherche sur le Cancer "und von" Agence Nationale de la Recherche "Programm Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH wurde von la "Ligue contre le cancer" unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
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