Summary
Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.
Introduction
Embriyonik kök hücreler (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreler (hPSCs), yaygın olarak tüm hücre soyları halinde nedeniyle farklılaşma potansiyeli, normal ve hastalıklı organogenez deneysel modelleme gibi rejeneratif tıpta istismar üç germ katmanları 1,2. HPSCs farklılaşması kaderi fiziksel ipuçları 3-5 aracılık ettiği otokrin veya 1 sinyal parakrin yanı sıra mechanotransduction süreçleri modüle yerel çevresel faktörlere karşı oldukça duyarlıdır. Hücre micropatterning mekansal, hücre-hücre etkileşimleri 6 ve hücre-matris etkileşimlerinin 3 gibi, yerel hücresel mikro-kontrol etmek için bir araç olarak bir hücre popülasyonunun geometrisi ve konumu düzenlemek için geliştirilmiş tekniklerin bir dizi kapsar. hPSCs bağlamında, hücre micropatterning niş bağlıdır nasıl hakkında önemli bilgiler elde etmek için istihdam edilmiştirKBB otokrin sinyalizasyon erken embriyonik farklılaşma kalıpları 6 içine HESC Pluripotency-farklılaşma kararları 7 ve organizasyon düzenler. 2D ve 3D micropatterned hPSCs sırayla üç germ 8,9 içine farklılaşma kararları etkilemiş çok hücreli desen, koloni boyutunu denetlemek için kullanılmıştır. Bu integrin E-kadherin karışma hücre kaderi heterojen 10 çıkmasına neden olabilir araştırmak üzere bir hPSC koloni içindeki hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin ölçüde modüle edilmesi için çok-hPSC micropatterns kullanmışlardır. Doku veya organ gelişimi sırasında büyüme faktörleri ve hormonların etkisini araştırmak için gelişimsel hastalıklar 11, ilaç toksisitesi taraması için deneysel model olarak hPSCs ve çok hücreli micropatterns uygulanması yönünde yukarıdaki raporlar açık yeni caddeleri gösteriler ve oluşumunu çözülmeye doku desenleri.
Hücre micropatter bir sayısızFalconnet diğerleri tarafından gözden olarak ning teknikler geliştirilmiştir. ark. 12 ancak böyle mikro temas 7,8,13 yazdırma gibi sadece bir avuç, Mikro kültürü 14,15, photopatterning 6 ve microstencils 16 başarıyla hPSCs ile hayata geçirilmiştir. micropatterning hPSCs Challenge etkilenmeleri ve hücre eki ve hayatta kalma için spesifik hücre dışı matris (ECM) ve büyüme koşullarının sıkı bir gereksinimi bulunmaktadır. 2D hPSC kalıpları için, mikro-kontak baskı doku kültürü ve cam yüzeylerde 13 hPSC micropatterns oluşturmak için en yaygın yöntemlerden biridir. yöntem, Matrigel olarak laminin ve bazal zar matris, aşağıdakileri içeren hPSC kültür, kullanılan model yaygın ECM için kullanılabilir. Bununla birlikte, tipik olarak poli-D-lizin ile destekli iki aşamalı bir kaplama işlemini gerektirir ve hPSCs 6,13 üzerine takmak için stabil ECM micropatterns yapmak için özel bir atıl atmosfer ve nem koşulları ihtiyacı. Her micropatterning yönteminin en önemli husus çevreleyen bölgelere belirsiz hücre eki en aza indirirken yüzey modifikasyonu rejimi istenilen geometrik çözünürlükte hPSC yapışkanlı ECM desenleri üretebilir olup olmadığıdır.
Burada, hPSCs üzerinde takmak için önce yapışkan ECM desen nesil ek yüzey modifikasyon adımlar olmadan hPSC micropatterns oluşturmak için basit bir yöntem olarak şablon micropatterning kullandığını rapor etmiştir. Hücre şablonun içinden delikler fiziksel ECM kaplamalar ve daha sonra ekilmiş hPSCs içeren bir hücre kültür substrat üzerine sızdırmaz boyutu milimetre mikron olan ince bir zar, örneğin, polidimetilsiloksan (PDMS) tabakanın içerir. şablon desenlendirme fiziksel hPSC yatan ECM kaplı yüzeye doğrudan erişim ve ekleyebilirsiniz konumu frenleyici çalışır gibi, bu yöntem hPSC kültürleri destekleyen çeşitli yüzeylerde ile uyumludur. sadece requiremenT Şablon malzeme seçimi alt-tabaka ile bir tersinir bir yalıtım oluşturmak olabilir. Bu alt-tabakalar, geleneksel doku kültür polistiren (TCPS) 17, ligand konjuge tabakaları 18, hem de ayarlanabilir sertlik elastomer tabakaları kapsar (örn., PDMS) 19. Bu yöntem, aynı zamanda, uygun bağlanma ve hPSCs farklılaşması için izin verilmesi için, vitronektin (veya VTN protein), laminin ve bazal membran matris (örneğin, Matrigel ve Geltrax) gibi farklı ECM'nin kaplama sağlar. Belirli hPSC hattı Bu nedenle, optimum aktarım için ECM alt-tabaka konfigürasyonları uygun hücre-matris yapışma, hayatta kalma ve farklılaşması için micropatterning şablona. Son zamanlarda, benzer bir yöntem, aynı zamanda, poli (metil metakrilat) ile micropatterning HESC (PMMA), mikro-Şablon dizileri 16 hepatik farklılaşma doğrudan bildirilmiştir.
Hücre şablonlar, farklı malzemelerden imal edilebilir araya dahilALS 20,21, poli (p-ksilen) polimerler 22,23, PMMA 16 ve en çok PDMS 24-28. Silisyum ve poli (p-ksilen) polimerler şablonlar biyolojik kullanıcılara kendi sınırları erişilebilirlik özel ekipman 20-23 ile geçiş delikleri doğrudan aşındırma gerektirir. PDMS şablonlar tipik olarak 3 um 2,000 um 11,26-29 aralığındadır istenen bir özellik boyutuna bağlı olarak farklı yöntemler ile imal edilebilir. Küçük özellikler istenirse, ince stenciling levhalar micropatterns 28 kabartmaları içeren bir microfabricated silikon şablona basın kalıplama PDMS pre-polimer üretilebilir. Özellikler> 1,000 mikron, bir CO2 lazer kesici doğrudan şablon imalat sırasında önceden döküm PDMS kağıda desenleri kesmek için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. PDMS şablon geri dönüşümlü da yeterli tutarlılık ile deneylerini yapmak için onları maliyet-etkin hale getirir.
10 sonuçlanan araştırmak üzere E-kadherin uyumlu bir HESC koloni içinde yapışıklıklar aracılı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol PDMS şablon kullanarak HESC hattının lazer kesim ve micropatterning, H9 tarafından 1000 mikron desenleri ile PDMS şablonun yapımını anlatmaktadır.
1. Tasarım ve micropatterning için PDMS şablonun Fabrikasyon
- İstenilen geometri ve boyut (örneğin, 1,000 mikron daireler) ve bilgisayar destekli tasarım yazılımı 10 kullanarak şablon conta geçiş delikleri ile stenciling sayfasını tasarlayın.
- 120-150 mikron ve kalın polidimetilsiloksan (PDMS) yaprak sırasıyla CO2 lazer kesici 10 kullanılarak 2 mm stenciling levha ve conta Lazerle kesilmiş.
- micropatterning PDMS şablonu elde etmek için 3-4 saat boyunca 60 ° C'de, sıvı sertleşmemiş PDMS ve fırında kullanarak PDMS şablonundaki sayfası ile PDMS conta Bond.
- Kullanmadan önce, bir fırın içinde, 30 dakika ve kurutma 120 ° C de otoklavlama PDMS şablon sterilize edin.
2. hESC AnaBakým
- Kültür HESC 37 ° C'de 1 x HESC nitelikli bazal membran matrisi kaplanmış hücre kültür plakaları bir besleme içermeyen muhafaza edici ortam içinde hatları ve% 5 CO2.
- Geçiş yaklaşık olarak% 70 dispaz tedavisi ile 37 ° C 'de 3 dakika inkübasyon ile birleşik ve mekanik 100-200 um kümelerine HESC koloniler ayrışan olan HESC. 6 bölme: 1 oranındaki bazal membran matris kaplı doku kültür polistiren üzerinde büyüme alanı 9.6 cm2 başına 30-50 kümeleri yoğunluğunda HESC topaklar Plate.
İnsan Embriyonik Kök Hücreleri 3. Stencil micropatterning
- Desenlendirme hücre önce Hazırlık
- Petri kabı içine ultra saf su içinde 700 ul% 70 analitik dereceli etanol dağıtım ve üstüne şablon koyarak bir 60 mm Petri kabı üzerine PDMS şablon Seal.
- t gecede izin biyogüvenlik kabini içinde Petri kabı yerleştirinO kuru etanol.
- hiçbir kabarcık şablon Petri kabı ile iyi bir sızdırmazlık oluşturur emin olmak için şablon altında bulunmaktadır edin. Bu ECM kaplama solüsyonu sızıntılarını önler. hücre tohumlama için hazır olana kadar steril koşullar altında Petri kabı ve mağaza kapatılmalıdır.
- Analiz Sertifikalarını göre hESC nitelikli bazal membran matris hacimde hazırlayın. Besin Karışımı, F-12 (DMEM / F12) üreticinin ürün sayfasına göre: her bir sıvı bölüntü verimleri 1 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde, 25 ml içinde seyreltilmiş x HESC nitelikli bazal membran matrisi çözeltisi emin olun.
- 1.5 × hESC nitelikli bazal membran matris çözümü yapmak için DMEM / F12 16.7 ml hESC nitelikli bazal membran matris bir kısım ekleyerek ECM kaplama çözeltisi hazırlayın. jelleşme önlemek için buz üzerinde tüm ECM kaplama çözümü tutun.
- 10 uM ROCK inhibitörü (Y27632) ile HESC bakım ortamı Supplement.
- 90 saniye boyunca 100 plazma 2 WO Petri kabı davranın. sterilite sağlamak için, yalnızca öncesinde plazma işlemine plazma odasının içine Petri kabı kapağını açın ve hızlı bir şekilde tedavinin tamamlanmasından sonra Petri kabı arka kapak. Bu yüzey ıslanmasını kolaylaştırır ve ECM kaplama çözeltisinin ilave edilmesi sırasında geçiş delikleri mikrodesenlerle hava kabarcığı oluşmasını engeller.
- Bütün şablon kapsayacak şekilde 1.5 × hESC nitelikli bazal membran matris solüsyon 450 ul ekleyin. Örneğin Parafilm olarak öz kapatılabilen film ile Petri Seal kurumasını önlemek için bir çözüm ve kullanımdan önce 37 ° C de 5 saat inkübe edilir.
- Stenciled alt tabaka üzerine Tohum HESC
- Yuvarlak, sıkı Packe tipik HESC morfolojisi kaybını gösteren farklılaşmış hücre alanları belirlemek için 6-çukurlu plaka içindeki HESC koloniler incelenmesi (örneğin, kayıpd epitel morfoloji, belirgin nükleol yüksek çekirdek / sitoplazma oranı). Bir vakum aspiratörü kullanarak farklı bölgeleri çıkarın.
- oyuk başına 2 ml DMEM / F12 ile iki kez yıkanır.
- 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu, örneğin Accutase olarak sindirim enzimleri, 1 ml ilave edilir ve 8 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. alt tabakadan tüm kolonileri ayırmak için hafifçe plaka dokunun.
- Sindirim enzimlerinin 1 ml başına DMEM / F12 içinde en az 4 ml de her durulama ve 15 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu toplanır.
- Oda sıcaklığında 3 dakika 200 x g'da hücre süspansiyonu santrifüj.
- Aspire süpernatant kaldırmak ve hücrelerin yeniden askıya ROCK inhibitörü (Rocki) ile desteklenmiş HESC bakım ortamı 400 ul ekleyin. Hücre süspansiyonu yukarı Pipet ve yavaşça aşağı 3 kez tek hücre içine kümeleri kırmak için.
- tek bir hücre süspansiyonu iyice karıştırın ve DMEM / F12 (1:20 seyreltme) 190 ul içine hücre örneklerinin 10 ul sulandırmak. Bir hemocytome kullanınter stok hücre süspansiyonu hücre yoğunluğu belirlemek için.
- Belirli bir şablon için gerekli olan hücre tohum yoğunluğu hesaplanır.
Not: Örneğin, deneysel olarak tek hücreler konfluent tek tabaka yaklaşık / mm2 4,444 hücreleri elde etmek için, hücre tohum yoğunluğu saptadık. Bu durumda, bir 450 mm 2 alanına ve 400 ul tohumlama hacmi ile bir şablon 2.000.000 hücre / 400 ul bir yoğunlukta olduğu, bir hücre süspansiyonu gerektirecektir. - Rocki ile desteklenmiş HESC kültür ortamı ile gerekli tohumlama yoğunluğu (adım 3.3.8 NOT bakınız) stok hücre süspansiyonu seyreltilir.
- Her şablonun içine hücrelerin gerekli sayıda içeren hücre süspansiyonu belirlenen hacim ekleme ve hücreler yerleşmek için izin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kaputu rahatsız Petri kabı bırakın.
- inkübatör içine Petri kabı aktarın ve hücre yapışmasını sağlamak üzere 1 saat boyunca inkübe edilir. sırasında Petri kabı seviyede tutmak için özenHücreler şablonun bir tek tabakalı olarak kalması, böylece süreci aktarın.
- Şablon çıkarma ve desensiz substratın pasivasyon
- hücrelerin düzgün alttaki tabaka üzerine takılı olup olmadığını kontrol etmek için mikroskop altında Petri kabı inceleyin.
- şablonun hücre süspansiyonu uzak aspire.
- şablon çevreleyen alana DMEM / F12 içinde% 0.5 Hücre kültürü uyumlu iyonik olmayan yüzey aktif madde 2 ml / tabak ekleyin.
- yavaşça şablon kalkmasına otoklavlanmış forseps bir çift kullanın. Şablon kurumasını hücreleri önlemek için sıyrılır gibi iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi etrafında dönme. Görme Petri kabındaki micropatterned hücreleri gözlemlemek.
- 37 ° C'de 10 dakika süre ile% 0.5, iyonik olmayan yüzey aktif madde DMEM / F12 çözeltisi içinde micropatterned hücreleri inkübe edin.
- uzaklıkta aspire iyonik olmayan yüzey aktif madde DMEM / F12 çözeltisi. 2 ml / DMEM / F12 çanak ile 3 kere yıkayın.
- hESC 2 ml / tabak eklemebakım ortamı Rocki ile takviye edilmiş ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, Rocki ile takviye aspirat HESC bakım ortamı, DMEM / F12 ile bir kez yıkanır ve 2 ml / 100 ng / ml Aktivin, 25 ng / ml BMP4 ve 10 ng / ml FGF2'nin ile takviye farklılaştırma ortamının çanak ekleyerek mesoendoderm farklılaşmasını teşvik .
- Faz kontrast görüntüleme kullanılarak micropatterns değerlendirin ve daha önce 8 açıklandığı gibi, her model için ortalama Brachyury (T) yoğunluk profilleri hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda 1000 mikron özellikleri üretmek için bir lazer kesici kullanarak bir hücre şablonun imalat açıklar. şablon 2 bölümden oluşmaktadır: ince stenciling sayfası geçiş delikleri mikrodesenlerle içeren (kalın yaklaşık 100-200 mikron) ve ECM kaplama çözeltisi veya hücre süspansiyonu içeren bir PDMS conta. Burada, 127 um ve 2 mm kalınlığında, ticari olarak temin PDMS sayfaları, sırasıyla delikli kalıpla baskı tabakası ve conta olarak kullanılmıştır. Bu tür yan kaplama olarak kontrol kalınlığı PDMS yaprak hazırlanması için diğer yöntemler de parça imal etmek için de kullanılabilir. Iki bileşen, bir yapıştırıcı ya da plazma bağı sıvı vulkanize edilmemiş PDMS ön-polimer-çapraz bağlayıcı karışımı kullanılarak birbirine bağlanmış ve 3-4 saat boyunca 60 ° C (Şek. 1) en pişirilmiştir.
stenciling sac malzeme hücre kültürü s seçimine dayalı olarak seçildiubstrate. Kültür alt-tabaka, geleneksel doku kültür polistiren (TCPS) kullanıldığında, PDMS şablonlar katı TCPS (E = 3 GPa) (Şek. 2A) ile birlikte iyi bir sızdırmazlık oluşturacak PDMS Neticede tabakanın uygun yana kullanılabilir. Böyle bir 5 kPa'dan 30 MPa ile 2, sert Neticede malzemeleri kullanılabilir arasında ayarlanabilir bir sertlik aralığı elastomerik PDMS alt-tabakalar olarak yumuşak hücre kültür alt-tabakalar üzerinde, kök hücre kaderin mekansal heterojen araştırmak için istediği deney tasarımlarda. Bir örnek olarak, ~ 5 kPa (Şek. 2B) içindeki bir sıkılığa sahip olan 1 mm yumuşak PDMS alt-tabaka üzerinde Micropatterned hPSC koloniler oluşturmak için bir polietilen tereftalat (PET) şablonun (E = 2 GPa) kullanımını göstermektedir. PET şablonundaki (Şek. 2B, ek), ticari olarak temin edilebilen PET filmleri yapılmış bir delikli kalıpla baskı levhası üzerine PDMS conta yapıştırılması ile imal edilmiştir. Biz unutmayın micropatterning sırasında gerekli hücre eki zamanıişlem daha uzun geleneksel TCPS substratlara kıyasla sertlik ~ 5 kPa'dan daha yumuşak PDMS alt-tabaka üzerinde (~ 3 saat).
Yapabiliriz desen erken mesoendoderm farklılaşma hücre yapışması aracılı mekanik kuvvetlerin bu mekansal heterojenlik göstermek için şablon micropatterned hESC koloniler kullanılmaktadır. Daha önce H9 HESC koloni çevresinde Aktivin, BMP4 ve FGF2'nin 31 (Şek neden olduğunda Brachyury (T) -pozitif mesoendoderm hücrelere rüçhan farklılaşma sonuçlanan koloni iç hücrelerin, daha yüksek integrin adezyonları deneyimli göstermiştir. 3A ). Hücreler sabit koloni alanında farklı geometriye (daire, kare, dikdörtgen ve yarı dairesel yay) içine desenli edildiğinde, integrin aracılı çekiş güçleri yerel konsantrasyonuna yol açtı kareler, dikdörtgenler ve dışbükey eğriliklerin köşelerinde geometrik anizotropi ve yükseltilmiş mesoend sonuçlandıoderm farklılaşma 32,33. Nitekim, tek bir koloni içinde farklı yerlerde de haritalama T ifadesi yoğunluğu, biz mesoendoderm indüksiyon ölçüde Şek (kare ve dikdörtgen koloniler (Şek. 3B) keskin köşeleri ve yarı dairesel yay dışbükey eğrilikleri daha yüksek olduğu bulunmuştur . bir anizotropik geometri 32,33 bildirilen yüksek integrin aracılı stres bölgelerine karşılık gelen 3C). Bu nedenle, takip eden micropatterning farklılaşma sürecine kontrol etmek için bir araç olarak dokunulmamış hPSC koloni içindeki hücre yapışması aracılı mekanik kuvvetlerin dağılımını modüle etmek için de kullanılabilir.
Micropatterning için PDMS şablon Şekil 1. Nesil. Şematik (A) şablon üretiminde kritik adımları temsil ediyor. A 127 mikron kalınlığında PDMS levha la oldutasarlanmış desenleri üretmek için ser-kesilmiş ve başka 2 mm kalınlığında PDMS sac conta üretmek için lazer kesildi. Bu iki bileşen şablon monte sertleşmemiş PDMS ile birbirine bağlanmış bulundu. (B) Görüntüler deliklerden 1 mm genelge ile bir PDMS şablon oluşturmak için bileşenlerin montaj gösteren. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklı kültür yüzeylerde Şekil 2. Micropatterned HESC koloni (1.000 mikron daireler). HESC mikrodesenlerle koloninin mikroskobik resimler hemen sert yüzeylerde, ilgili HESC micropatterns üretmek için kullanılan (A) PDMS şablonlar (ek) çıkarılmasından sonra, örneğin, sertlik TCPS ~ 2 GPa ve (B) PET şablonlar (ek), Örneğin yumuşak yüzeylerde, üzerinde micropatterns oluşturmak için kullanılan, sertlik ~ 5 kPa PDMS. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Onların mesoendoderm farklılaşma 8 farklı geometrik şekillerin HESC micropatterns Şekil 3. Etkisi. (A) farklı geometrik şekillerde ama aynı koloni alanı PDMS şablonlar kullanılarak oluşturulan edildi HESC micropatterns. Mesoendoderm farklılaşma 24 saat sonra T ifadesi (alt panel) Faz görüntüleri (üst panel) ve yoğunluk haritaları. (B) Ortalama T yoğunluk profilleri (beyaz noktalı çizgiler boyunca (A)) izometrik dairesel koloniler veya anizometrik kare ve dikdörtgen kolonilerinde . Tüm koloniler aynı alan ex vardı koloni alanının yarısı vardı% 50 daire. (C) yarı dairesel bir yay içinde koloni içine içbükey veya dışbükey kenarları ortalama T yoğunluk profilleri, beyaz noktalı çizgiler (A) ile belirtildiği gibi cept. her yoğunluk profili (BC) 4 koloni elde 16 yoğunluğu profilleri bir ortalamasıdır. Görüntüler Toh et izni ile yeniden basılmıştır. al., 8. Ölçek çubuğu = 200 mikron ve RFU göreceli floresan birimidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. hESC koloniler mikrodesenlerle ve farklılaşmasını teşvik etmek iş akışının şematik gösterimi. HESC micropatterns başarılı bir nesil için anahtar adımlar gri kutular vurgulanır..com / files / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Micropatterning şablon imalatı
Elek micropatterning niş aracılı farklılaşma model oluşturmanın araştırmak için hPSC micropatterns oluşturmak için ideal bir yöntem sağlar. Böyle microcontact baskı ve photopatterning gibi diğer micropatterning teknikleri üzerinde şablon desen önemli avantajı, yüzey modifikasyonu gerektirmez ve geleneksel TCPS yüzeylerde uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, farklı hPSC hatları için optimize edilmiş kültür ortamı ECM kaplamalar kolaylıkla micropatterning şablona aktarılabilir.
İyi micropatterns üretimine katkıda hücre şablonun imalat sırasında önemli adımlar vardır. hPSC micropatterns tasarlanan geometrileri üreyen vefa stenciling sayfasında kalite ve through-hole fabrikasyon kıvamına bağlıdır. Çok hücreli micropat içeren çalışmalar için> 1000 um terns, geçiş delikleri ile doğrudan ön döküm PDMS kağıda lazer kesimi suretiyle imal edilebilir. Lazer kesimi çözünürlüğü, lazer ışınının bir noktada boyutu ve lazer ışınının yolu kontrol mekanik aşamasının hassas bağlıdır. Geleneksel CO2 lazer kesiciler için, biz (örn., Kare) dairesel veya kavisli iyi sadakat ile özellikleri değil keskin köşeli geometrileri üretebilir bulundu. Küçük ya da kesici özelliklere arzu edildiği uygulamalarda, geçiş delikleri Neticede levha micropatterns 28 kabartma ihtiva eden bir mikrofabrike silikon şablonunu PDMS kalıplanmasıyla imal edilebilir. kalıplama yöntemi meydan geçiş delikleri silikon şablon kabartmalar üzerinde hiçbir kalıntı PDMS ile ince PDMS levha mikro-boyutu üretmektir. Li ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi çeşitli stratejiler, bu sorunu çözmek için geliştirilmiştir. ark. 28
olarak sırasındaonel stenciling levha ve hücre şablon üretmek için conta, bir stenciling sac şablonundaki sızıntılarını önlemek için bağlanma işlemi esnasında düz ve tozsuz olmasını sağlamalıdır. Yapıştırma işlemi sırasında stenciling levha Burkulma ECM ve hücre çözümleri geçiş delikleri mikrodesenlerle sızmasına neden kültür alt tabakaya şablonun sızdırmazlık tehlikeye atabilir. Şablon otoklavda (120 ° C, 30 dakika) ile sterilize edilmesi gerekir ve iyice kültür substratı ile iyi bir sızdırmazlık oluşturan sağlamak için bir fırın içinde kurutulabilmektedir.
Bir diğer önemli faktör Neticede tabaka malzemenin seçimidir. PDMS şablonundaki ~ 2 GPa bir sertliğe sahip örneğin TCPS gibi katı bir kültür alt tabakalar üzerine micropatterning hPSCs için idealdir. Ancak, böyle bir yaygın ayar hücre alt tabaka sertlik 34, bir PDMS uyum için kullanılan PDMS yüzeylerde olduğu gibi yumuşak yüzeylerde hPSCs, mikrodesenlerle istersestenciling levha zor bu nedenle hPSC micropatterns yok, hücre ekim işleminden sonra şablon kalkmasına yapacaktır. Bu durumda, şablonun Neticede tabaka için malzeme seçimi bu kültür substratı olan bir zarflama oluşturamazsa, ancak kolaylıkla sıyrılır şekildedir seçilmelidir.
Yaratma hPSC micropatterns
Burada sunulan bir PDMS şablon kullanarak TCPS yüzeyler üzerine H9 hESC micropatterning için protokol iyi hücre canlılığı ve desenleme sadakat ile birleşen koloni elde etmek için optimize edilmiştir. HPSCs bir geometri bağımlı faktör farklılaşma kaderi nasıl etkilediğini araştırmak böylece micropatterns ile tanımlanan belirli bir geometri mekansal hapsi içinde uygun hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini oluşturması şarttır. Biz başarıyla hPSC micropatterns oluşturmak için bir kaç kritik adımlar tespit ettik (Şekil. 4)aşağıdaki gibi ve onlar tartışılır.
İlk olarak, hPSC kültür kalitesi önemli. Farklılaşmış alanlar çıkarırken farklılaşmamış hPSC morfoloji gösteren kolonilerin çoğunluğu ile,% 70-80 izdiham hPSC koloniler hasat önemlidir. Aşırı birleşik hPSC kültürleri genellikle spontan farklılaşma neden ve farklılaşmış alanlar hücre tohumlama önce çıkarılmalıdır değilse, farklılaşmış hücreler normal farklılaşma desen oluşumunu bozacak.
Bu genellikle hücreleri başlangıçta ekleme bile gece boyunca inkübe edildikten sonra hücre ölümü ile sonuçlanan, çünkü İkinci olarak, sindirim enzimleri ile aşırı tedavi kaçınarak, tek hücre süspansiyonuna hPSC koloniler hasat zaman önemlidir. Biz enzimatik tedavi 8 dakika laboratuarımızda kültüre H9 hESC hattı için en uygun olduğunu buldum; Biz hücre dekolmanı tedavi süresi farklı hücre hatları için ayrı ayrı optimize edilmesi gerektiğini tavsiye rağmen.
Son olarak, çoğalan ya mikrodesenlerle olan hücrelere farklılaşan sınırlamak amacıyla olmayan hücreli yapışkan moleküllerle hPSC micropatterns substrata pasifleştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Bu hPSC mikrodesenlerle doğruluğunu korumak için gereklidir ve sırayla, farklılaşma modelleri için biyokimyasal ve mekanik çevre degrade geliştirmektir. Pluronic F-127 hücre kültürü uyumlu iyonik olmayan yüzey aktif maddeler, bir etkinsizleştirme maddesi olarak kullanılabilir. yüzey aktif maddeler ile pasifleştirme sırasında, tedavi süresi ve yoğunluğu nedeniyle, uzun maruz Surfaktan en sitotoksisite için optimize edilmelidir. Yukarıda bahsedildiği gibi, sunulan protokol PDMS şablon kullanarak hPSCs mikrodesenlerle için ayrıntılı bir kılavuz sağlar, ancak özellikle yukarıda kritik adımlar için bu protokol, optimizasyonu su teşvik edilirccessfully hPSC micropatterns oluşturur.
Şablon micropatterning bir sınırlaması, 100-1,500 um arasında değişen büyük micropatterns üretilmesi için daha uygun olmasıdır. Daha önce de belirtildiği gibi tek bir hücre desenlendirme yönelik çok küçük özellikleri, <50 mikron geçiş delikleri ile stenciling yaprak imalat üretmek için çok zor. Bu nedenle, biz şablon micropatterned hPSCs kullanımı farklı gelişim süreçleri (örneğin, neuroepithelium katlama veya endoderm desenlendirme) sırasında çok hücreli doku desen oluşumunu araştırmak için uygundur bekliyoruz.
Geometrik bir hPSC nüfusu sınırlandırmak micropatterning kullanarak, hücre yapışması kontrol ve sonuç farklılaşma kaderi mekansal organizasyonunu anlamak için mekanik 10 ve parakrin sinyal renk geçişlerini 6 aracılı kurabilir. uzaysal olarak düzenlenen differentiatio olan bu micropatterned hPSC modellerin da konjenital doğum kusurları için insana özgü bir hastalık veya teratojen tarama modelleri 11 tercüme edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma ödeneği başlatın NUS tarafından (R-397-000-192-133) ve ETPL Gap Fonu (R-397-000-198-592) desteklenir. GS NUS Araştırma bilginidir. Yazarlar, hücre micropatterning onu teknik destek için Dr. Jiangwa Xing teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
