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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/56767
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

Summary

Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen (STS). Dieses Modell könnte uns helfen, besser zu verstehen, die molekularen Hintergründe und pharmakologischen Profil von diesen seltenen Tumoren und könnte einen Ausgangspunkt für die weitere Forschung zur Verbesserung der STS Management darstellen.

Abstract

Weichgewebe Sarkome (STS) decken ein Spektrum von heterogenen Tumoren mit einer schwierigen Diagnose, Klassifikation und Management. Bis heute wurden mehr als 50 histologische Subtypen dieser seltenen soliden Tumoren identifiziert. So ist unser Verständnis für die Biologie dieser Tumoren aufgrund ihrer außerordentlichen Vielfalt und niedrige Inzidenz, noch begrenzt. Patienten-abgeleiteten Kulturen repräsentieren die ideale Plattform, STS-Pathophysiologie und Pharmakologie zu studieren. Wir entwickelt somit ein menschliches Präklinisches Modell STS ab Tumor Proben von Patienten, die eine chirurgische Resektion geerntet. Patienten abgeleitet STS Zellkulturen wurden aus der chirurgischen Proben von Kollagenase Verdauung und isoliert durch Filtration. Zellen wurden gezählt, ausgesät, und Links für 14 Tage in standard Monolayer-Kulturen und dann durch nachgeschaltete Analyse verarbeitet. Bevor Sie Molekulare oder pharmazeutische Analysen durchführen, die Einrichtung von STS Primärkulturen wurde bestätigt durch die Evaluierung zytomorphologischen Merkmale und, wenn vorhanden, immunhistochemischen Marker. Diese Methode stellt ein nützliches Werkzeug (1), die Naturgeschichte dieser schlecht erforschten maligner Erkrankungen zu studieren und 2) so testen Sie die Auswirkungen von verschiedenen Drogen in einer Bemühung, mehr über ihre Wirkmechanismen zu erfahren.

Introduction

Weichgewebe Sarkome (STS) umfassen ein Spektrum von heterogenen Läsionen des mesenchymaler Herkunft einen Anteil von 1 % aller soliden Tumoren1,2, und die neue Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) erkennt das Vorhandensein von mehr als 50 Subtypen3. Unter diesen sind die am häufigsten verwendeten Histotypes Adipocyte Sarkom oder Liposarcoma und Leiomyosarcoma, einem Anteil von 15 % und 11 % aller Erwachsenen m., jeweils4,5. Obwohl STS in verschiedenen Teilen des Körpers entwickeln können, sind die Extremitäten und Retroperitoneum die häufigsten Lokalisationen, in 60 % und 20 % der Fälle, bzw.6auftreten.

Die Eckpfeiler der Therapie für die lokalisierten Krankheit ist Breite chirurgische Resektion, während die Vorteile der adjuvanten und neoadjuvanten Chemotherapie noch unklar sind und nur in ausgewählten Fällen7 gelten. In der metastasierten Einstellung Chemotherapie ist die Standardbehandlung zeigt aber begrenzte Ergebnisse8. Ein besseres Verständnis der molekularen Biologie der STS würde dazu beitragen, verbessern die aktuellen Differentialdiagnose, die verfügbaren Behandlungen zu optimieren und neue Ziele für die Therapie zu identifizieren.

In diesem Zusammenhang wurde die Krebsforschung seit vielen Jahren mit verewigt Zelle Linien9durchgeführt. Diese experimentelle Modelle sind normalerweise in standard Monolage unterstützt kultiviert oder eingepflanzt immungeschwächte Nagetiere, in Vivo Xenograft10Modelle zu etablieren. Immortalisierte Zelllinien repräsentieren eine überschaubare und einfach zu speichern Material, mit der zahlreiche Forschung Experimente durchgeführt werden kann. Sie sind in der Tat, die am wenigsten teuer und am weitesten verbreitete Tool in präklinischen Studien11.

Jedoch Zelllinie basierte Krebs Modelle haben auch einige Einschränkungen, z.B. verlängerte Kultur in einem Monolayer-System zusammen mit einer zunehmenden Anzahl von Passagen induziert phänotypischen und Gendrift, machen Zellen weniger wahrscheinlich zu wichtigen Tumor rekapitulieren Funktionen. Darüber hinaus fehl Linie Zellkulturen, die Zell-Zell-Interaktion und Signalisierung Molekül Übersprechen, die das biologische Verhalten von Tumoren zu imitieren und zu charakterisieren, der Tumor Mikroumgebung zu reproduzieren. Diese Fragen bilden die Grundlage des Spaltes zwischen präklinischer und klinischer Ergebnisse12.

Angesichts des oben genannten, stieg das Interesse an Patienten abgeleitet Primärkulturen13. In der Tat reduziert die Exzision von bösartigen und normalen Gewebe das Risiko von Krebs Zelle Phänotyp und Heterogenität, bietet somit Ausgangsmaterial, die repräsentativ für die Tumor-Mikroumgebung zu verlieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von frischen Tumor Proben von Patienten, die eine chirurgische Resektion geerntet uns einzelne Tumoren untersuchen und vergleichen Sie verschiedene Läsionen aus dem gleichen Teil des Patienten Körper14. Aus den genannten Gründen Gewebe abgeleitet Zellkulturen zur Verfügung stellen eines wertvollen Materials um Tumor Pathophysiologie und Pharmakologie15,16,17, vor allem im STS in die im Handel erhältlichen Sarkom-Zelllinien zu studieren sind nur18. Wir optimieren damit eine Methode, um einen Patienten abgeleitet STS Primärzelle ab chirurgisch besteuerte Tumor Gewebe13,19,20zu etablieren. Unsere Methode besteht aus disaggregieren der Tumor-Probe in kleinen gewebefragmente gefolgt von Übernachtung enzymatische Gewebe Dissoziation, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Am nächsten Tag die enzymatische Verdauung wird durch Zugabe von frischen Nährmedien gestoppt und die erhaltene Suspension wird gefiltert, um gewebefragmente, Zelle-Aggregate und überschüssige Matrixmaterial oder Fremdkörper zu entfernen. Zu guter Letzt ist ein Bruchteil von isolierten Tumorzellen Cytospinned auf Objektträger fixiert und für nachgelagerte Analyse bestätigt die Gründung des STS Primärkultur abzielen, durch zytomorphologischen, immunhistochemische und molekularen zytogenetische Auswertung gespeichert (z.B. FISH-Analyse von MDM2 Verstärkung steht für den standard Differentialdiagnose für eine gut differenzierte Liposarcoma und dedifferentiated Liposarcoma) 4. die verbleibenden Zellen in eine standard Monolayer Kultur für profiling und pharmakologischen genexpressionsstudien ausgesät werden. Alles, was die Experimente durchgeführt werden mit niedrigen Durchgang Primärkulturen, die Auswahl der spezifischen Krebs-Subclones zu vermeiden und durch einen erfahrenen Sarkom Pathologen analysiert. Damit haben wir ein vollständig humaner STS Ex-Vivo Modell13,19,20geschaffen. Dieser vielseitig, einfach zu Griff Modell könnte ein nützliches Werkzeug für verschiedene Arten von präklinischen Forschung, z.B. um neue molekulare Marker für die Diagnose und Prognose zu identifizieren oder um ein tieferes Verständnis für die Aktivität und Mechanismen zu gewinnen stellen Wirkung von Standard- und neue Medikamente bei der Verwaltung von STS.

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Protocol

STS-Zellen sind isoliert von einem Tumor Masse chirurgisch herausgeschnitten von Patienten mit STS. Das Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt und erfolgt nach den Leitlinien zur guten klinischen Praxis und der Deklaration von Helsinki. Alle Patienten gaben schriftliche Einwilligungserklärung, an der Studie teilzunehmen. Die chirurgische Exemplare sind durch einen erfahrenen Sarkom Pathologen analysiert und verarbeitet innerhalb 3 Stunden nach der Operation.

1. Tumor Probengewinnung und Verarbeitung:

  1. Sammeln Sie Tumor Proben mit Hilfe von einem Sarkom Pathologen in einem 100 mL sterilen Urin-Behälter mit 50 mL DMEM niedrige Glukose Medium mit einer Paraffin-Folie versiegelt.
  2. Speichern Sie die Proben bei 4 ° C für maximal 3 h nach der Tumor-Resektion.
  3. Führen Sie die folgenden Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Haube.
    1. Sterilisieren Sie die Haube mit 70 % Ethanol und tragen Sie sterile Handschuhe zu.
    2. Stahl Inox Pinzette mit 70 % igem Ethanol (verwenden Sie ein steriler Gaze) zu sterilisieren.
    3. Paraffin-Film aus dem Urin-Behälter entfernen und entsorgen.
    4. Aussenansicht des Behälters Urin mit 70 % Ethanol zu waschen.
    5. Öffnen Sie eine quadratische Petrischale.
    6. Öffnen Sie den Urin-Container und übertragen Sie die Tumor-Exemplare in die quadratische Petrischale mit der sterilisierten Stahl Inox Pinzette.
  4. Zweimal waschen Sie die Tumor Proben mit PBS.
  5. Öffnen Sie einen sterilen chirurgischen Skalpell.
    1. Zerkleinern Sie fein die Tumor-Exemplare in 1 – 2 mm3 Stücke.
    2. Sammeln Sie ein Viertel der gesamten Stichprobe in der 2-mL-Tube.
    3. Fügen Sie 1 mL Trizol Reagenz (gekauft), um das Rohr und sofort Einfrieren bei-80 ° C (im Beispiel wird in der nachfolgenden Analyse für die Ausdrucksauswertung STS gen verwendet werden).
  6. Sammeln Sie den Rest der das fein zerkleinerte tumormaterial in eine 15-mL-Tube.
    1. Fügen Sie 4 mL Kollagenase Typ-I-Lösung (Kollagenase Typ ich aufgelöst in PBS, bei einer Konzentration von 4 µg/mL).
    2. Verdünnen Sie die Kollagenase Typ-I-Lösung mit 4 mL DMEM hohe Nährmedien (Endkonzentration von Kollagenase Typ I ist 2 µg/mL).
    3. Das 15-mL-Röhrchen verschließen und Abdichten mit Paraffin Film.
    4. Setzen Sie die 15-mL-Tube in einem sanften Shaker im Brutschrank bei 37 ° C unter Rühren Bedingungen für 15 min um die Verdauung zu aktivieren.
    5. Bewahren Sie nach 15 min das Rohr in den rollenden Shaker unter Rühren Bedingungen bei Raumtemperatur über Nacht auf.
  7. Am folgende Tag legte der 15-mL-Tube unter der sterilen Haube.
  8. Filtern Sie sanft die Zellsuspension durch eine 100 µm Sterilfilter an der Oberseite einen 50-mL-Tube befestigt.
  9. Waschen Sie den Filter mit DMEM hohe Nährmedien mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
  10. Entsorgen Sie die 100 µm Sterilfilter, schließen Sie die 50-mL-Tube und Zentrifuge bei 225 X g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  11. Verwerfen des Überstands durch das Rohr zu invertieren.
  12. Aussetzen Sie die Zellen mit 1-2 mL DMEM hohe Nährmedien mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wieder.
    Hinweis: Die Lautstärke hängt die Höhe der tumorprobe verarbeitet.
  13. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer.
    1. Verdünnen Sie die Probe 1:2 in Trypan blau und verwenden Sie 10 µL der Verdünnung, um Zellen zu zählen.
    2. Zählen Sie mindestens zweimal und berechnen Sie den Mittelwert der Wiederholungen zu wissen, die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen gesammelt.
  14. Platte Zellen in einer standard Monolayer Kultur bei einer Dichte von 80.000 Zellen/cm2.
    Hinweis: Immer enthalten Sie Steuerelemente in Experimenten. Führen Sie mindestens 3 Technische Wiederholungen für jede Bedingung. Führen Sie mindestens 2 biologische repliziert. Für präklinische Pharmakologie, Genexpression und Protein-Expressionsanalysen sollte innerhalb von 30-45 Tagen der Zelle Aussaat zu verlieren Krebs Zelle Phänotypen Experimente mit einer geringen Anzahl von Kultur Passagen durchgeführt.
  15. Zytologische Probenvorbereitung.
    1. Sammeln Sie 100.000 Zellen in 200 µL DMEM hohe Nährmedien mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
    2. Pipette die Lösung (200 µL Pipette) in einen Einweg-Trichter mit einem Filter ausgestattet und mit einem Objektträger montiert.
    3. Öffnen Sie die Cytocentrifuge und legen Sie die Proben.
    4. Laufen Sie die Cytocentrifuge bei 18,6 x g für 20 min.
    5. Verwerfen Sie den Trichter mit Filter ausgestattet.
    6. Befestigen Sie die Folien in Aceton für 10 min, gefolgt von Chloroform für 5 min.
    7. Speichern Sie die Folien bei-20 ° C.
      Hinweis: Auftauen und Hydrat die Proben vor der Färbung und führen die Färbung nach den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie mindestens 3 Technische repliziert.

(2) STS Zellkulturen:

  1. Wechseln Sie Medium einmal pro Woche (DMEM hohe Nährmedien mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt).
    1. Entsorgen Sie das Kulturmedium mit einer 200-1.000 µL Pipette.
    2. Fügen Sie neue frisches Medium mit einer 200-1.000 µL Pipette.
    3. Zelle Passage:
      1. Zellen zu trennen, wenn die Mündung rund 90 %:
        Hinweis: STS Zelle Kultur Verstärkung sollte einmal wöchentlich auf der Grundlage der Kultur durchgeführt werden.
      2. Medium zu verwerfen, mit PBS waschen und 2-3 mL Trypsin 1 X mit PBS-Puffer
        Hinweis: Das Volumen von Trypsin verwendet hängt von der kultivierten Zellen erhalten.
      3. Inkubieren Sie Zellen für 3-5 min bei 37 ° c
      4. Sammeln Sie freistehende Zellen von der Platte mit einer 200-1.000 µL Pipette.
      5. Pipette die freistehenden Zellen in ein 15-mL-Röhrchen und 4 mL DMEM hohe Kultur Medien ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin, die enzymatische Reaktion zu stoppen.
      6. Zentrifugieren Sie bei 225 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
      7. Verwerfen Sie den überstand.
      8. Wieder aussetzen der Zelle Pellet durch Zugabe von 1 mL DMEM hohe Nährmedien mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
      9. Samen der Zellen in eine neue Kultur-Platte oder eine Flasche mit einem Endvolumen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
        Hinweis: Nicht teilen Sie, Zellen mehr als 1:3.

(3) nachgeschalteten Analysen:

Hinweis: Eine Vielzahl von verschiedenen Experimenten kann mit Hilfe dieses Modells (siehe unten) durchgeführt werden. Deshalb ist es wichtig, während der Design-Phase der Studie entscheiden, welche Untersuchungen durchgeführt werden werden, so dass eine ausreichende Anzahl von Proben und Wiederholungen vorbereitet werden kann.

  1. Verbreitung-Assays wie MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid
  2. Apoptotische Assays wie terminal Deoxynucleotidyl-Transferase (TdT) nick Ende Kennzeichnung (TUNEL) assay
  3. Immunhistochemische Analysen
  4. Genanalyse Ausdruck
  5. Western-Blot Analyse
  6. ELISA-assay
  7. Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Analyse
  8. In Vivo Xenograft-Modell

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Representative Results

Wir haben eine einfache Methode, um zu erhalten die Errichtung einer Primärkultur von Weichteilsarkomen Patienten abgeleitet und Berichten hier ein Beispiel für Ergebnisse, die auf einem bestimmten STS Histotype13entwickelt. Das Protokoll wurde für die Errichtung von Primärkulturen von verschiedenen STS Histotypes einschließlich gut differenzierte Liposarcoma, entdifferenzierten myxoid Liposarcoma, pleomorphes Liposarcoma, Liposarcoma, Myxofibrosarcoma, undifferenzierten pleomorphes Sarkom, GIST und Desmoid Ledderhose.

Die Erfolgsquote für die Einrichtung von Primärkulturen war 54 % (13 Primärkulturen von 24 STS chirurgische Proben) für chirurgische Proben von Patienten mit Chemotherapie, Strahlentherapie behandelt oder nicht behandelt abgeleitet. Umgekehrt war es 72 % (13 Primärkulturen von 18 STS chirurgische Proben) für chirurgische Proben nur aus unbehandelten Patienten abgeleitet.

Tumorzellen wurden isoliert von einem gut differentiated/entdifferenzierten Liposarcoma (ALT/DDLPS) von einem 54 Jahre alten Patienten operativ entfernt. MDM2 Verstärkung Analyse, derzeit für die standard Differentialdiagnose von ALT/DDLPS durchgeführt und durch einen erfahrenen Sarkom Pathologe überprüft war positiv, bestätigt das Vorhandensein von einer ALT/DDLPS Läsion (Abb. 1A). Zytologische Analyse von MDM2 Verstärkung in isolierten Tumorzellen bestätigt die Gründung eines Patienten abgeleitet ALT/DDLPS Primärkultur (94,6 % der kultivierten Zellen waren positiv für MDM2 Verstärkung) (Abbildung 1B). Die Primärkultur weiterhin nach Passagen in standard Monolayer-Kulturen zu vermehren und Zellviabilität wurde von MTT und Tunel überwacht Assay.

Dieses Modell ermöglicht uns, testen Sie die Empfindlichkeit der ALT/DDLPS Primärkultur, verschiedene Medikamente, die derzeit verwendet oder unter klinischen Auswertung für die Behandlung von ALT/DDLPS wie Ifosfamid (IFO), Epirubicin (EPI), die Kombination IFO + EPI, Trabectedin (TRABE), und Eribulin (ERI), mit dem MTT-Assay durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Empfindlichkeit der Kulturen zur Chemotherapie (Abb. 2A). Die aktivste Behandlung war IFO + EPI, eine First-Line-Therapie bei fortgeschrittenem oder metastasiertem ALT/DDLPS verwendet. Darüber hinaus wurde die Zellmorphologie nach Arzneimittelexposition, führt zu Ighlighting morphologische Veränderungen in der primären Kultur in Bezug auf die Kontrolle und den Erkenntnissen der zytotoxischen Assay (Abbildung 2B) untersucht. Wie im Protokoll erwähnt, können mit diesem Modell mehrere nachgeschaltete Analysen durchgeführt werden. Abbildung 3 enthält eine schematische Darstellung der Methode und eine Zeitleiste, innerhalb, die derer die Experimente durchgeführt werden sollte, um translationale Ergebnisse zu erzielen.

Figure 1
Abbildung 1 . Gründung des Patienten abgeleitet Primärkultur von ALT/DDLPS. (A) In Situ Hybridisierung (FISH) durchgeführt, um MDM2 Verstärkung in einem Patienten Gewebeprobe (100 X Bild) zu erkennen. B) In Situ Hybridisierung (FISH) durchgeführt, um MDM2 Verstärkung in einem Primärkultur (100 X Vergrößerung) zu erkennen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Chemotherapie in einer Primärkultur ALT/DDLPS. (A) die Zellen wurden mit behandelt: Ifosfamid (IFO), Epirubicin (EPI), IFO + EPI Trabectedin (TRABE) und Eribulin (ERI). Drei unabhängige Wiederholungen wurden für jedes Experiment durchgeführt. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler (SE), präsentiert wie angegeben, mit n die Anzahl der Wiederholungen angibt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden anhand einer zweiseitigen Student t-test, * p < 0,05. B) Bilder von ALT/DDLPS Primärkultur nach Arzneimittelexposition (2 X Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : STS Primärkultur Modell. Schematische Darstellung der präklinischen Modell der STS Primärkultur einschließlich der Timeline und den möglichen nachgeschalteten Analysen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Gut definierte präklinische Modellen genügen, um den molekularen Hintergrund von Tumoren zu erhellen, schlechten Prognose Vorhersagen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, für Krebspatienten. Dies ist besonders wichtig für seltene Tumoren wie STS, deren hohe Heterogenität in Bezug auf die Morphologie, aggressives Potenzial und klinischen Verhalten fordert unser Verständnis von STS-Biologie und Patientenmanagement21. Darüber hinaus einige kommerzielle Sarkom-Zell-Linien zur Verfügung präklinische Untersuchungen zu dieser Gruppe von mesenchymalen Tumoren18begrenzt. Ex-Vivo -Modelle stellen somit eine wertvolle Ressource für STS dar. Wir entwickelten ein vollständig humaner in Vitro -Modell der STS ab chirurgisch reseziertem Tumor-Gewebe (Abbildung 3). Bei der Optimierung der Methode wurden mehrere kritische Probleme angegangen und gelöst. Das erste Problem betrifft den zeitlichen Abstand zwischen chirurgische Behandlung und Probenverarbeitung. Zunächst als Tumor Proben in unserem Labor Biowissenschaften nach einer gewissen Zeit ankamen, waren sie über Nacht bei 4 ° C gelagert und am nächsten Tag bearbeitet. Die STS-Zellen isoliert aus diesen Proben geringen Verbreitung Aktivität und schlechte Rentabilität im standard Monolayer Kultur ausgestellt. Dies kann teilweise darauf zurückgeführt werden, dass ganze Tumor Probe bleibt für einen längeren Zeitraum hinweg im Urin Container vor der Verarbeitung. Wir modifiziert damit die Startzeit der Probe Verarbeitung auf maximal 3 Stunden nach der Operation zu gewährleisten, dass die Primärkultur weiterhin vermehren sich in standard Monolayer Kultur und gute Tragfähigkeit aufweisen. Wir auch die Disaggregation zellprozess optimiert: kleine homogene gewebefragmente sind notwendig, um die enzymatische Verdauung zu erleichtern, und dies wurde mit einem Skalpell. Darüber hinaus, obwohl das Protokoll mit Proben verschiedener Größen gearbeitet, begrenzt die Errichtung einer Primärkultur Exemplare ab Größe (< 2 cm) ist schwieriger zu erreichen. Die Kollagenase-Konzentration war ein weiteres wichtiges Thema, weil zu hoch Anenzyme Konzentration zellulärer Stress, führt zu phänotypischen Veränderungen in der STS Primärkultur oder eine Abnahme der Tumor Zelle überleben führen kann. Enzymatische Verdauung ist erforderlich, um Zellen von Matrix-Material und Schutt zu trennen. Wir haben schließlich die Enzym-Konzentration in der Verdauung Phase verwenden optimiert. Darüber hinaus wieder zur Einschränkung der zellulären Stresses und liefern Nährstoffe für STS-Zellen bei der Isolierung haben wir eingestellt das Enzym in Kulturmedien anstelle von anderen Reagenzien wie PBS. Schließlich offenbart einige Experimente auf verschiedenen STS Primärkulturen wie Liposarcoma und Myxofibrosarcoma Veränderungen in der Genexpression im Zeitablauf und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapie13,20. Diese Erkenntnisse sind in einem Monolayer-System zusammen mit einer zunehmenden Anzahl von Passagen, sowohl die phänotypische induzieren und Gendrift auf die längere Kultur des Patienten abgeleitet STS Zellen zurückzuführen. Die abnehmende Zuverlässigkeit dieses Kultur-Systems im Laufe der Zeit zu rekapitulieren Tumorgewebe, wie oben gezeigt, stellt eine der wichtigsten Einschränkungen der ex Vivo Modelle22,23. Wir optimiert damit das Protokoll durch die Verringerung der Zeit, in der Experimente (innerhalb von 30-45 Tagen der Tumorzelle Aussaat) durchführen und durch niedrigen Durchgang Kulturen um zu translationale und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus die Primärkulturen können eingefroren werden, aber ihre spätere Lebensfähigkeit ist abhängig von mehreren Faktoren, einschließlich Tumor Lage, STS Histotype, chirurgische Probe und Anzahl der Kultur Passagen durchgeführt.

Unser System hat eine Reihe von Vorteilen, d. h. es ist ein vollständig humaner präklinischen Modell, im Gegensatz zu anderen Murine-basierte Sarkom Zelle Linie Modelle24,25,26,27. Obwohl die Bestätigung der Einrichtung von STS Primärkulturen, erreicht durch zytomorphologischen, immunhistochemische und molekularen zytogenetische Auswertung, mit der Unterstützung von einem erfahrenen Sarkom ist Pathologe, übrigens in unserem Protokoll obligatorisch , dies ist nicht immer der Fall für andere STS Primärkultur Modelle. In einigen Zeitungen wurde nachgelagerte Analyse der Zellen von chirurgischen Exemplare erholt durchgeführt, ohne Bestätigung den Diagnose der STS Zelle Prozentsatz in der Primärkulturen28. Unser System ist auch vielseitig, reproduzierbar und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Experimenten durchführen. Darüber hinaus können Cell seeding und äußere Reize geändert werden, um bestimmte Funktionen und Reaktionen zu studieren. Die Entwicklung dieses Modells ermöglicht uns zu untersuchen, die Empfindlichkeit des Patienten abgeleitet STS Zellen verschiedene Medikamente, die derzeit verwendet oder unter klinischen Auswertung für die Behandlung von STS. Dieses Modell, daher stellt ein wichtiges Präklinisches Instrument für die Vorhersage des Ansprechens auf die Therapie und wenn weiter optimiert, möglicherweise werden verwendet, um personalisierte Therapie zu verbessern. Es könnte auch verwendet werden, um diagnostische oder prognostische molekulare Marker, besonders wichtig bei STS zu identifizieren, wo einige spezifische Biomarker zur Verfügung stehen. Eine Einschränkung des Protokolls ist die relativ kurze Zeit zur Verfügung, um nachgeschaltete Analyse nach der Gründung der Primärkultur durchführen. Das Protokoll könnte verbessert werden, durch Gene Expression profiling und Cluster-Analyse für Tumor und Primärkulturen abgeleitet vom selben Patienten im Laufe der Zeit zu beurteilen, die Fähigkeit der primären Kultur um die Heterogenität des Tumorgewebes zu imitieren, vor allem für die STS-Histotypes für die diagnostische Marker nicht verfügbar ist. Solche Analysen würde auch helfen, um weiter zu charakterisieren, wie die Zellen in der erhaltenen Kultur unterscheiden sich von denen direkt von tumorproben abgeleitet.

Zusammenfassend ist die Einrichtung von robusten präklinischen Modellen unabdingbar für unser Verständnis von Tumor Pathologie. Wir glauben, dass unser Modell hilft, die molekularen Mechanismen aufzudecken, die sind verantwortlich für die schlechte Prognose der STS und wird dazu beitragen, die Identifikation von neuen therapeutischen Strategien.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

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De Vita, A., Mercatali, L.,… More

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).

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