Etablering af en primær kultur af Patient-afledte bløddelssarkom
Summary
Følgende protokol fokuserer på oprettelsen af en primær kultur af patient-afledte bløddelssarkom (STS). Denne model kan hjælpe os til bedre at forstå de molekylære baggrund og farmakologisk profil af disse sjældne maligne sygdomme og kunne udgøre et udgangspunkt for yderligere forskning med henblik på forbedring af forvaltningen af STS.
Abstract
Bløddelssarkomer (STS) repræsenterer et spektrum af heterogene maligniteter med en vanskelig diagnose, klassificering og ledelse. Til dato, er blevet identificeret mere end 50 histologiske undertyper af disse sjældne solide tumorer. Således, på grund af deres ekstraordinære mangfoldighed og lav forekomst, vores forståelse af biologi af disse tumorer er stadig begrænset. Patient-afledte kulturer repræsenterer den ideelle platform til at studere STS Patofysiologi og farmakologi. Vi har således udviklet en menneskelig prækliniske model af STS startende fra tumor prøver høstet fra patienter, som gennemgår kirurgisk resektion. Patient-afledte STS cellekulturer hidrører fra de kirurgiske enheder af collagenase fordøjelse og isoleret ved filtrering. Celler var tælles, seedet, og forlod i 14 dage i standard éncellelag kulturer og derefter behandles af downstream analyse. Før du udfører molekylære eller farmaceutiske analyser, etablering af STS primære kulturer var bekræftet gennem evalueringen af cytomorphologic funktioner, og når de er tilgængelige, immunhistokemiske markører. Denne metode repræsenterer en nyttig værktøj 1) til at studere disse dårligt udforskede maligniteter naturhistorie og 2) at afprøve virkningerne af forskellige stoffer i et forsøg på at lære mere om deres virkningsmekanismer.
Introduction
Bløddelssarkomer (STS) omfatter et spektrum af heterogene læsioner af mesenchymale oprindelse udgør 1% af alle solide tumorer1,2, og den nye World Health Organization klassificering anerkender tilstedeværelsen af mere end 50 forskellige undertyper3. Blandt disse er de mest almindelige histotypes adipocyt sarkom eller liposarcoma og leiomyosarcoma, tegner sig for 15% og 11% af alle voksne STS, henholdsvis4,5. Selv om STS kan udvikle sig i forskellige dele af kroppen, er ekstremiteter og retroperitoneum de mest almindelige steder, forekommer hos 60% og 20% af tilfældene, henholdsvis6.
Hjørnestenen i behandling af lokaliseret sygdom er bredt kirurgisk resektion, hvorimod fordelene ved adjuvans og neoadjuverende kemoterapi er stadig uklart og betragtes kun i udvalgte tilfælde7. I indstillingen metastatisk kemoterapi er standard for pleje men viser begrænsede resultater8. En bedre forståelse af Molekylærbiologi af STS ville bidrage til at forbedre den nuværende differentialdiagnosticering, optimere de tilgængelige behandlinger, og identificere nye mål for terapi.
I denne sammenhæng, er blevet udført forskning i kræft i mange år ved hjælp af udødeliggjort celle linjer9. Disse eksperimentelle modeller er normalt dyrkes i standard éncellelag understøtter eller implanteres i immundefekte rotter at etablere i vivo xenograft modeller10. Udødeliggjort cellelinjer repræsenterer en overskuelig og let-at-store materiale som en rigelig række forskning eksperimenter kan udføres. De er faktisk den billigste og udbredte mest værktøj i prækliniske studier11.
Dog cellelinie baseret kræftmodeller har også nogle begrænsninger, fx langvarig kultur i et éncellelag system sammen med et stigende antal passager inducerer fænotypisk og genetisk drift, making celler mindre tilbøjelige til at sammenfatte vigtige tumor funktioner. Derudover undlader linje cellekulturer at gengive celle til celle interaktion og signalfunktion molekyle krydstale, der efterligner den biologiske opførsel af tumorer og karakterisere tumor mikromiljø. Spørgsmålene danner grundlag for kløften mellem prækliniske og kliniske resultater12.
I betragtning af ovenstående er interesse i patienten-afledte primære kulturer steget13. Faktisk reducerer excision af ondartede og normale væv risikoen for at miste kræft celle fænotype og heterogenitet, dermed tilbyder råvare, der er mere repræsentativ for tumor mikromiljø. Desuden brug af friske tumor prøver høstet fra patienter, som gennemgår kirurgisk resektion giver os mulighed for at undersøge enkelt tumorer og sammenligne forskellige læsioner fra den samme del af en patients krop14. Af ovennævnte grunde giver væv-afledte cellekulturer et værdifuldt materiale for at studere tumor Patofysiologi og farmakologi15,16,17, især i STS i hvilke kommercielt tilgængelige sarkom cellelinjer er begrænset18. Vi optimeret således en metode til at etablere en patient-afledte STS primære cellekultur fra kirurgisk skåret tumor væv13,19,20. Vores metode består af disaggregating tumor modellen i lille væv fragmenter efterfulgt af overnight enzymatisk væv dissociation at opnå en enkelt cellesuspension. Den følgende dag, den enzymatiske fordøjelsen stoppes ved at tilføje friske dyrkningsmedier og opnåede suspensionen er filtreret for at fjerne væv fragmenter, celle-aggregater, og overskydende matrix materiale eller snavs. Endelig, en brøkdel af isolerede tumorceller er cytospinned på glas dias, fast og gemt for downstream analyse sigter bekræfter oprettelsen af STS primære kultur af cytomorphological, immunhistokemisk og molekylær cytogenetisk evaluering (fx fisk analyse af MDM2 forstærkning repræsenterer den standard differentialdiagnosticering for et godt differentieret liposarcoma og den dedifferentiated liposarcoma) 4. de resterende celler er seedet til en standard éncellelag kultur for gen expression profilering og farmakologiske undersøgelser. Alle eksperimenterne, der udføres ved hjælp af lav passage primære kulturer at undgå udvalg af specifikke kræft subclones, og analyseret af en erfaren sarkom patolog. Vi har således skabt et fuldt humane STS ex-vivo model13,19,20. Denne meget alsidigt, let at håndtere model kunne udgøre et nyttigt værktøj til forskellige typer af prækliniske forskning, fx til at identificere nye molekylære markører for diagnose og prognose eller at få en dybere forståelse af aktiviteten og mekanismer for handling af standard og nye lægemidler, der anvendes i forvaltningen af STS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veldefinerede prækliniske modeller er nødvendige for at belyse de molekylære baggrund af tumorer, forudsige dårlig prognose og udvikle nye terapeutiske strategier for kræftpatienter. Dette er især vigtigt for sjældne tumorer såsom STS hvis høje heterogenitet i morfologi, aggressive potentielle og klinisk adfærd udfordrer vores forståelse af STS biologi og patienthåndtering21. Desuden begrænser de par kommercielle sarkom cellelinier til rådighed prækliniske undersøgelser af denne gr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Gráinne Tierney for redaktionelle bistand.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours – an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
