Summary
אנו מתארים את התפתחות מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי במבחנה זה מאפשר לנו לבדוק הסטנדרטי העכשווי של משטרי טיפול ניסיוני עבור הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים בשורות תאים, מכוון הערכת טיפול רגישות והתנגדות על ראשי תאים אנושיים דגימות בעתיד.
Abstract
אפשרויות הטיפול הנוכחי עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר (HNSCC) ואחראי מתקדם, חוזרים ונשנים לתחום הקרינה וגישות קרינה-כימותרפיה עם או בלי ניתוח. בעוד משטרי כימותרפיה פלטינה מבוססי כיום מייצגים את תקן זהב במונחים של יעילות, ניתנות ברוב המכריע של המקרים, משטרי כימותרפיה חדשה, כלומר חיסוני מתגלים. עם זאת, שיעורי ההיענות ואת מנגנוני ההתנגדות טיפול או משטר כימותרפיה קשים לחזות ולהישאר מובן דיו. וריאציות רחבה של טיפולים כימותרפיים, והקרנות מנגנוני ההתנגדות ידועים עד כה. מחקר זה מתאר את התפתחות assay מתוקננת, תפוקה גבוהה במבחנה כדי להעריך את התגובה של HNSCC תא קו על משטרי הטיפול השונים, ובתקווה בתאי העיקרי של חולים בודדים ככלי בעתיד לגידול אישית טיפול. וזמינותו נועד להיות משולב לתוך האלגוריתם תקן איכות שבשליטת לחולים HNSCC במרכז שלנו טיפול שלישוני; עם זאת, זה יהיה הנושא של מחקרים עתידיים. הישימות הטכנית נראה מבטיח עבור ראשי תאים מן הגידול ביופסיות מחולים בפועל. דגימות מועברים אל המעבדה. ביופסיות מכנית מופרדים שהופעלו על ידי עיכול אנזימטי. תאים ואז מתורבתים ב אדהזיה נמוך במיוחד תא תרבות בקבוקונים לקדם היווצרות ספונטנית, מתוקננת הדירים תלת מימדי, בצורת ספרואיד תא וקונצרנים. Spheroids מוכנים ואז ייחשפו הפרוטוקולים כימותרפיה-קרינה ופרוטוקולים חיסוני כנדרש. גודל הכדאיות ואת ספרואיד התא האחרון אינדיקטורים של טיפול הרגישות, ולכן יכול להיות נמשך בחשבון בעתיד כדי להעריך את התגובה לטיפול סביר המטופלים. מודל זה יכול להיות כלי רב ערך חסכוניים לקראת טיפול מותאם אישית עבור סרטן הראש והצוואר.
Introduction
הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) הוא הסרטן השישי בשכיחותו ברחבי העולם עם שיעור העולה של הרירית הפפילומה האנושי (HPV) זיהום-הקשורים פתוגנזה, ליד רוב המקרים הנגרמת על ידי עודף ניקוטין ואלכוהול צריכת 1,2. בעוד גידולים קטנים יותר ושלבים פולשנית מראש הם בדרך כלל מאוד לטפל בה היטב עם כריתה כירורגית, בדרך כלל בשילוב עם לנתיחה הלימפה הצווארי, טיפול HNSCC בשלב מתקדם, חוזרים ונשנים נותר מאתגר עקב הגידול אגרסיבי פלישה עם התפשטות גרורתית, עמידות בפני קרינה וכימותרפיה פרוטוקולים3,4,5,6,7,8. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים השתנות גבוהה של פנוטיפ הסלולר, ואפיון תת לאומיים, תאים סרטניים המופץ החלה9,10. האמונה קודמת של גידול מוצק, אחיד המוני היה צריך להיות מתוקן לאור מחקרים שנעשו לאחרונה בעבר שנים11,12,13,14. לגישות עבור גידול אפיון וזיהוי של מוטציות מפתח יכול לזהות מספר גנים נראים להיות מזוהה עם עמידות לטיפול אך נשארים בגישה עלות עתירי. יתר על כן, הידע של גנוטיפ אינה מאפשרת בהכרח חיזוי אמין של פנוטיפ והתגובה לטיפול שלו.
היו כמה התקדמות בשיפור ההישרדות הכללית ללא מחלה של מחלה בשלב מתקדם, חוזרים ונשנים. ניקוטין - כמו גם וירוס-הקשורים קרצינומה, אפשרויות הטיפול הנוכחי מלבד ניתוח לתחום משטרי כימותרפיה מבוסס פלטינה של קרינת אגרסיבי. היו השלכות על שיעורי ההיענות שונה בין HPV שלילי וחיובי קרצינומה; עם זאת, זה עדיין לא תוביל לשינוי באופן כללי הנחיות טיפול. ההתנגדות לקראת הקרנות וכימותרפיה היא תופעה נפוצה בכל שלבי הגידול, קיימת עבור פלטינה מבוססי כימותרפיה כמו גם לגבי טיפול ממוקד (Anti-EGFR; קולטן גורם הגדילה באפידרמיס) לאחרונה המתעוררים עיכוב במחסום15. יעילות הקרנות וכימותרפיה לבוא בעלות גבוהה של תחלואה משמעותית המטופל מבחינת בבליעה, mucositis, יובש בפה, סיכון של ירידה של תפקוד כליות או לב בין היתר. ניחוש תרפיה תגובה מוקדמת ההחלטה של המושג טיפול כללי עבור כל מטופל בודדים נראה המטרה מכריע, למנוע טיפול מיותר מושגים, תופעות לוואי ועלויות.
אנחנו ביקשו להקים מודל כדי לבדוק את הרגישות טיפול הפרט החולה לכיוון הנוכחי תקן הכימותרפיה קרינה-זה יכול להיות משולב לתוך האלגוריתם רגיל ומבוקר על-ידי איכות הטיפול oncologic מנקודה טכנית עומד. המטרה רחוק היה להשתמש במודל ללא שימוש שורות תאים שהשתנו בכבדות בגילאי, כפי שהם מייצגים לקוי תאים סרטניים אנושיים בפועל ללא השתנות שלהם הטרוגניות כפי שאנו יודעים, תוך הקמת בפרוטוקול נעשתה בשורות תאים שונים. . להיות עצמאי רק שורות תאים זמינים מסחרית, לאחרונה בהצלחה יצרנו קו תא ביניים הנקרא "פיקה" מתאי HNSCC העיקרי של דגימות הגידול האנושי עם סמנים הסלולר שנשמרת על הקטעים שלה-משטח ומוגבל 16. שורת התאים פיקה זו צריך לשמש כהכנה הפיתוח של המודל על הכביש כדי ואז מאוחר יותר בעקבות ניסויים עם תאים סרטניים אנושיים טריים מן הגידול ביופסיות. הוכח כי תאים תאים תלת מימדי התרבויות מגיבים באופן שונה, יותר ויוו-כמו למינהל של תרופות סרטן מאלו גדל monolayers17,18,19,20 ,21, בעיקר בזכות השימור של הנדידה בידול תת מאפיינים מסוימים תא קבוצות משנה22,23,24. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול של מודל מבוסס ספרואיד, תלת מימדי של שורות תאים ביניים ולשלב העיקרי האנושי קרצינומה של תאים קשקשיים תאים ודרכים איך כזה מודל טיפול בסרטן הראש והצוואר מנתח, אונקולוג ( איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים שמוצג בכתב היד, כלומר השימוש של דגימות הגידול אנושי, מוגנים תחת ותוך הסכמה עם החלטות קודמות של האוניברסיטה לרפואה של מיינץ (mainz) / האוניברסיטה של ועדת האתיקה מרכז רפואי מינכן. חולים נתנו הסכמה מדעת לפי הנחיות משפטיות לאומי להסכים השימוש המדעי של חומר ביולוגי עודף שהושגו במהלך הטיפול שלהם. המחקר בוצע בהתאם כל הנחיות מוסדיים, לאומיים ובינלאומיים לרווחת האדם.
1. לקיחת ביופסיה של הגידול הראש ו קרצינומה של תאים קשקשיים האק
- לבצע הכללי (propofol ו/או sevoflurane, הסוכן מרגיע שרירים) או חדירה מקומי (2% ultracaine, אדרנלין) / משטח הרדמה (כדי להרדים) על כיסא הבדיקה לחדר ניתוח או אף אוזן גרון. לדמיין את המסה הגידול בחלקים חלל/הלוע/גרון/אחרים אוראלי של מערכת העיכול, מערכת הנשימה העליונה עם תקן הפעלה כלי נגינה, ובמידת הצורך, תחת המיקרוסקופ.
- לקחת ביופסיה של הגידול טריים מן הפריפריה של הנגע סרטניים עם מכשירים בוטה או חיתוך. הימנע במרכז הנגע עקב נמק בשפע באזור זה. לשים את הרקמה שהושג במיכל סטרילי עם פתרון מול נתרן כלורי.
- לאחר הביופסיה, לבצע hemostasis כנדרש, למשל., עם מכשיר דו קוטבית או monopolar קרישה תוך ניצול של חומרים vasoconstrictive.
- להביא את הביופסיה הגידול נועד לשמש לניסויים התרבות התא ישירות אל מערכת מעבדה סמוכים. לשלוח אחרים ביופסיות הגידול הפתולוג כרגיל כדי לשלול סרטן.
- ודא כי טכנאי מעבדה הוא מוכן לעבד את הדגימה ישירות.
2. עיבוד הדגימה הגידול
- הנח את הדגימה הגידול על משטח מתאים וסטרילי, לחתוך אותו ביסודיות עם איזמל חד-פעמי סטרילי לחתיכות מעט ככל האפשר.
התראה: ודא כי המצב של מחלות זיהומיות נישא בדם מתועדת הטכנאי תשומת לב של המוסדות תקן פרוטוקולים כדי למנוע מחט מקל או פציעה חיתוך עם פוטנציאל חומר המטופל הביולוגי ו פרוטוקולים לעקוב אחרי פציעה. - לאחר ההפרדה מכני מספיק של הרקמה העיקרית, לשים את הרקמה לתוך בקבוקון המכיל Collagenase אני / II דגירה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. ניפוי דרך מסננת תא 70 מיקרומטר בז ולשטוף את הבולם עם פתרון מאוזן מלח הנקס (HBSS).
-
לאחר ההפרדה המוצלחת, כביסה עוקבות, למקם את המתלים המכיל 1-2 × 106 תאים לתוך T75 תא תרבות מבחנות (75 ס מ2) לגדול sub-confluency-5% CO2 ו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שלב זה עשוי להימשך עד 10 ימים.
- שימוש תקין מיוחד תרבות בינוני המורכב הבאות: 125 מ של Dulbecco המתואמת של הנשרים בינוני (DMEM), 250 מ של תקין השלים בינונית (medium המלווים בהיקף של 500 מ"ל תקין SF בינוני, 15 מ ג של יותרת המוח שור תמצית (BPE), 2.5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין, 150 ng רקומביננטי אפיתל גדילה הגורם האנושי (EGF), 516 µL של 300 מ"מ CaCl2, תמהיל מניות להיות מוכנים מראש), 125 מ של מיקס מזין F12, 10 מ ג של BPE (0.75 מ ל), 75 ng EGF האנושי רקומביננטי (2 µL) , 3.75 מ ל-200 מ מ L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (טבלה של חומרים).
3. זריעת את התאים נמוך במיוחד אדהזיה תא תרבות לוחות
- לאשר תא הגידול במיקרוסקופ. לספור את התאים בתרבות (ראשי או תרבית תאים) ואת זרע תאי הגידול העיקרי 5,000 או 1,000-2,000 תאים של שורת התאים ביניים / בקו התא השני ב- 200-300 µL של המדיה (שלב 3.2.) לתוך צלחת אדהזיה נמוך במיוחד עם קעורה, לעגל תחתית (96-ובכן).
-
התרבות התאים ב- 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס, בחלקים שווים DMEM ואת דרכי הנשימה תאים אפיתל בינוני (BEGM), סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן הכרחיות של 1%, 1%-גלוטמין (שלב 2.3.). אם שורות תאים משמשות, התקשורת על בסיס DMEM מספיקה.
- לבצע שינויים מדיה בכל יום אחר. שים לב לא לרוקן את ספרואיד עם פיפטה במהלך שינויים מדיה. תרבות של spheroids עד הרמה של צמיחה כמו descibed ב 3.3 הגיע (כ 7-10 ימים).
- לאשר היווצרות ספונטנית ספרואיד תחת המיקרוסקופ על ידי מחפש תלת מימדי, בצורת ספרואיד תא וקונצרנים. הכללת הבארות לא סדיר ו/או היווצרות ספרואיד מרובים מלחקירה נוספת.
הערה: Spheroids צריך להיות גלוי בעין בלתי מזוינת, גם להקל על עיבוד נוסף של שינויים מדיה כמפורט להלן.
4. חשיפת Spheroids לטיפול גידול רגילה או ניסיוני עם מודאלים מרובים
- בחר את משטר הטיפול הרצוי. עיצוב קבוצות הבקרה גדול מספיק לאפשר השוואות של טיפולים spheroids שלא טופלו או spheroids מקבל רק טיפול חלקי משטרי, למשל. קרינה לבד. הגודל של קבוצות שליטה תלוי בעיצוב ניסיוני קבוצה, לא יכול להיות מוגדר באופן אוניברסלי.
- להחליף את המדיה מדיה עם תוספים, משמעות מדיה עם chemotherapeutics ו/או נוגדנים חד-שבטיים בריכוזים הרצויים. להוסיף ציספלטין בכל הריכוזים של 2.5/5/10 מיקרומטר או 5-fluoruracil (5FU)-30 מיקרומטר.
הערה: עבור תפוקה גבוהה ניסויים או מספר גדלים/גדול קבוצה גדולה של קבוצות, אחת יכולים להשתמש רובוט pipetting אוטומטית אנחנו מקימים עוד יותר בניסויים. - לחלופין, להקרין צלחות התרבות תאים עם spheroids ב 2 Gy בעזרת מתקן קרינה מתאים.
התראה: לכבד את הפרוטוקולים של המוסד בדבר מניעת קרינה מזיקה חשיפה של העובדים. לעבוד רק עם טכנאים המיועד ולמדו בהתאם להנחיות הגנה מפני קרינה. אם רצונך בכך, להוסיף chemotherapeutics כמתואר תחת 4.2. לאחר מכן. - דגירה את התאים עבור 24 שעות בתנאים שתוארו תרבות (37 מעלות צלזיוס, שלב 3.2).
- לאחר הדגירה, להמשיך את התרבות התא לפחות 6 ימים עם שינויים מדיה בכל יום אחר.
5. הערכה של גודל ספרואיד ומידת התפשטות הסלולר עבור Assay Read-out
- למדוד ספרואיד גודל מבחינת האזור לאחר תמונה דיגיטלית לתיעוד ביום 6 (יום 10, יום 16) עם תוכנה גרפית (פרמטר 1).
- לאחר צנטריפוגה ב g 520 x 2.5 דקות של הצלחת, הסר את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים עם כמות מספקת של 1-PBS וצנטריפוגה שהצלחת שוב כמתואר, ואחריו הסרת את תגובת שיקוע (PBS).
- להוסיף 100 µL של התא אנזימטי ניתוק פתרון לכל מבחנה כדי לאפשר את spheroids להתמוסס. דגירה את הצלחת. בשביל 8 דקות ב 37 º C.
- בדוק המסת מוצלח של ספרואיד מתחת למיקרוסקופ. להוסיף 100 µL של DMEM. Centrifuge הצלחת-520 x g עבור 2.5 מינימלית להסיר את תגובת שיקוע, להשעות את התאים µL 100 של DMEM.
- ביצוע וזמינותו של התפשטות ערכי צבע מוחלטים זמינים מסחרית, דוגמה assay wst, מרץ-8 על כל בקבוקון לפי הוראות היצרן25. קרא את וזמינותו בקורא assay (אליסה) מקושרים-אנזים immunosorbent (פרמטר 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצלחנו לייצר reproducibly spheroids של תא בודד המתלים, תחילה שורות תאים שונים כולל קניינית פיקה תא השורה, מאוחר יותר מתאי סרטן אנושי ראשוני נגזר הגידול טריים ביופסיות כפי שמתואר Hagemann ואח . 26. הערכנו שתי שיטות הוקמה לדור ספרואיד; השניים להיות התליה כביכול ירידה שיטה (HD) ובשיטת אדהזיה נמוך במיוחד (אולה), האחרון להיות בטוח ויעיל יותר. הצלחנו להדגיש את היתרונות של שיטת אולה בהשוואה ל- HD, כולל ספרואיד צמיחה מהירה יותר, פחות בעיות עם הצלחת הטיפול, שהמחיקה לא תגרום לאובדן spheroids עם ויברציות כבד, גידול ספרואיד לשחזור יותר אחידות ( איור 2). המופע של spheroids מרובים לכל מבחנה היתה שכיחה יותר בקרב בשיטת HD. בדקנו עבור אפיון ברורים יותר של ספרואיד מורפולוגיה. איור 3 מראה של נוגדנים צביעת עבור Ki67, סמן הפצה, של ספרואיד מתאי פיקה. כפי שמתואר בספרות, spheroids מורכב פחות מתרבים הליבה לשכבה החיצונית proliferating, מחקה אזורים שונים של התפשטות HNSCC מלא בבני אדם. חוץ גופית בתוך כמו ויוו, זו נגרמת כביכול על-ידי מעבר הדרגתי של חומרים מזינים וחמצן המסופקים על ידי התקשורת התרבות התא וגורם ירידה מהפריפריה אל המרכז של הגידול.
אז ניסינו להראות כי וזמינותו הוא מסוגל לזהות וריאציות בגודל ספרואיד לאחר הדגירה עם תרופות כימותרפיות או חשיפה לקרינה מייננת,. מייצגים שני משטרי הטיפול הסטנדרטי נפוצות עבור HNSCC. לפני יכול להיות שילוב וזמינותו לתוך שיגרה קדם טיפול, האימות של הרגישות של וזמינותו יהיה תנאי הכרחי. שני פרמטרים היו זמינות בתור נקודות הקצה של וזמינותו: גודל ספרואיד (אזור; פרמטר 1 מ שלב 5.1.) והתפשטות (ראה פרמטר 2 משלב 5.4.), להיות סמן הפונדקאית תא הכדאיות ופוטנציאל צמיחה, אחרי טיפול. התוצאות של המחקרים טיפול עם קומון כימותרפיות ופרוטוקולים כימותרפיה-קרינה מוצגים באיור4. חשיפה דגירה של spheroids עם ציספלטין או 5FU הובילו ירידה משמעותית מהירות הצמיחה לאורך זמן בהשוואה לקבוצת הבקרה ללא טיפול (p< 0.001). קרינה עם 2Gy היה מסוגל להפחית את מהירות הגדילה באופן משמעותי (p< 0.01). וזמינותו להישרדות (wst, מרץ-8) היה מסוגל לזהות ערך נוסף, משמעותי של קרינה-כימותרפיה עם ציספלטין בהשוואה לקרינה לבד (p = 0.017), בעבר מבלי שיבחינו ההבדל הערכה של גודל ספרואיד. זה מדגיש את חשיבותו עבור וזמינותו בכללותה, משלים את הרגישות שלה עבור שינויים קטנים תרפיה תגובה.
איור 1: תפיסת מודל בדרך טיפול אישי עתידי. חולים עם רקע או זיהום HPV הרירית ו/או היסטוריה של התעללות טבק ואלכוהול הנוכחי שלנו מרכז טיפול שלישוני הפנייה לאבחון חשד לסרטן הראש והצוואר. ביופסיות של אזורים הרירית חשוד או ההמונים גידול מאקרוסקופית נלקחים בהרדמה כדי לאבטח את האבחנה. בנוסף, אנחנו לוקחים את הגידול ביופסיות ליצירת תרביות תאים תלת-ממדי בצורת ספרואיד במעבדה. הגדילה מספיקות של התא העיקרי מבוסס spheroids, אנחנו חושפים אותם בפני משטרי הטיפול הסטנדרטי או ניסיוני הנוכחי כדי לבדוק את התגובה טיפול פרטני. ניתוח נוסף של וריאציות גנטיות או מולקולרית ניתן להוסיף לאחר ניתוח של תוצאות הטיפול. טיפול התוצאות במבחנה ניתן להסיק בחשבון עבור התהליך של תכנון טיפול מושגים עבור המטופל. איור זה מודפס של Hagemann, ג'יי. et al. 26, בעלי הרשאה שהוענקה על ידי מחברים ויומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: כל הקווים תא יכול לייצר spheroids אמין; הבדלי גודל ושעת read-out הם על פי איור 1. בניסויים ראשוניים, ראשי תאים לא יוצרים spheroids לשחזור ב- HD אבל אולה צלחות (משמאל למטה). מחקרים נוספים הם להתבצע כדי להעריך ספרואיד מאפייני צמיחה מתאי הראשי. מספר התאים בצד הימין הוא המספר הראשוני של תאים לשים בבקבוקון לטופס ספרואיד. איור זה מודפס של Hagemann, ג'יי. et al. 26, בעלי הרשאה שהוענקה על ידי מחברים ויומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Ki67 נוגדנים מכתים של חתיכה ספרואיד (פיקה). הפריפריה של התרבות מציג את שיעור התפשטות גבוה יותר מאשר תאים המרכזי, מחקה הפצה מזין בגידולים מוצקים הרירית המציגים לעיתים קרובות ליבות עם נמק. איור זה מודפס של Hagemann, ג'יי. et al. 26, בעלי הרשאה שהוענקה על ידי מחברים ויומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לימודי תרפיה. (א) פיקה התאים היו מעובדים ליצירת spheroids (n = 12 לכל קבוצה) באולה צלחות. התאים היו מגורה לפי הפרוטוקול עם PBS או כפי שליטה, ציספלטין ב 5 מיקרומטר או 5FU ב 30 מיקרומטר. בגדלים spheroids היו נחושים ביום 6, 10 ו- 16 לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. ציספלטין ו- 5FU טיפול הובילה ירידה משמעותית בגודל (p-ערכים מקבלים בחלק התחתון השמאלי בסעיף תכנון ניסויים זהים (B) כמו (A) (n = 12), אבל עם קרינה נוספים של 2Gy. (ג) מגרש מציג כשלוש דקות מקסימום. על פי המשנה p-ערכים (C), קרינה הקודם עם 2Gy הובילה ירידה משמעותית בגודל ספרואיד בקבוצת הביקורת, מחקה את הקרנות ומציגות רגישות לקרינה של תאים פיקה. קרינה בשילוב עם טיפול ציספלטין לא הובלת כדי ירידה משמעותית נוספת לגודל ספרואיד (p> 0.05). העלילה מציגה את מינימום מקסימום. (ג) לחשב p-ערכים מ- 2-way ANOVA ניתוח של ניסויים א' וב' (ד) WST8 assay לבצע יום 16 כחלופה לניתוח planimetric (אזור) של spheroids. ניתוחים WST8 הצליחו לזהות ירידה משמעותית בתאים חיים לאחר כימותרפיה-קרינה (2Gy קרינה, ציספלטין) לעומת ציספלטין לבד (p = 0.017), ומכאן מציג את היתרון של שילוב של ניתוח planimetric וגם WST8 assay ערכי צבע מוחלטים בזמנו של assay read-out. העלילה מציגה כשלוש דקות מקסימום. איור זה מודפס של Hagemann, ג'יי. et al. 26, בעלי הרשאה שהוענקה על ידי מחברים ויומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצלחנו ליצור פרוטוקול כדי ליצור spheroids לשחזור מתוך תא המתלים, עבור שתי שורות תאים, בניסויים ראשוניים, תאים סרטניים אנושיים העיקרי. אנו קודם העריך שתי השיטות שתוארו, זיהה את השיטה-אולה, שיטה שבו משמשים תרבות צלחות במשטחים אדהזיה נמוך במיוחד, כדי להיות בטוח יותר ואמין יותר לדור של spheroids תלת מימדי אחיד. על ידי שילוב שתי שיטות נפרד read-out assay (גודל/שטח ותא הכדאיות), זו assay עם מודאלים מרובים הוא רגיש מספיק כדי לזהות הבדלים קטנים בין קבוצות. זהו הצעד הראשון לקראת הוכחת היתכנות טכנית עבור שילוב מאוחר יותר וזמינותו מסלול קליני במרכז שלנו טיפול שלישוני. בעתיד, זה יכול לשמש כדי (i) להעריך את הרגישות גידול בודדים נפוצות הראשון או על השני/שלישי-קו טיפול פרוטוקולים (ריאגנטים כימותרפיה, קרינה), טיפול ניסיוני פרוטוקולים, (ii) נוספת לאפיין את תאי הגידול של דגימות טריות לתאם מולקולרית דפוסי פני שטח או cytoplasmic תרפיה תגובה. Spheroids של דגימות מגיע localizations גידול שונים, למשל, יסודי, גרורות הצומת לימפה, הן שניתן להעלות על הדעת.
במהלך הקמת הפרוטוקול ואת שיטת, השתמשנו שורות תאים ידוע אחר, להיות כמה וותיקה במשך עשרות שנים. עידן גרידא של הקווים תא מעלה את הספק של החיבור שלהם comparability על תאים סרטניים אנושיים בפועל הנוכחי, כביכול איבדה מספר מאפיינים של הולמרק סמנים מולקולריים. תוצאות של ניסויים במבחנה היו קשה לשחזר ניסויים של האדם או ויוו -27. לכן התמקדנו קו תא לאחרונה שנוצר מתאי הגידול העיקרי האנושי במתקן שלנו זה טוב מאופיין16. עם הקו הזה תא פיקה, אנו הצליחו לערוך טיפול ניסויים בקנה מידה גדול יותר, אישר את הציפיות בטיפול הנוכחי. זה תומך את התיאוריה כי תאים פיקה לשקף התנהגות בפועל גידול אנושי יותר שורות תאים אחרים, יותר בגילאי, passaged שעברו קטעים רבים. תאים עשוי לעבור הבחירה הלא-פיזיולוגיים עקב תנאי במבחנה לטווח ארוך אולי הטיה רגישות קרינה-כימותרפיה. בניסויים האחרונות, אישרנו את הכדאיות עם ראשי תאים לגבי היווצרות ספרואיד אמין; אולם, ניסויים נוספים, גדולים יותר יש שיש לבצע לפני שהוא יוכל ליישם וזמינותו לשגרה קליניים.
ההנחה היא כי spheroids ותרבות תלת ממדי התא באופן כללי מגיבים באופן שונה בהשוואה 2D קונבנציונלי-תרבות כאשר הם נחשפים תרופות כימותרפיות או קרינה 28. הארכיטקטורה של spheroids מוביל שיפוע של מסירת החמצן ותזונה מן השטח החיצוני הליבה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גם משלוח סמים לחלקים שונים של האשכול תלת ממדי התא אינה אחידה29. יתר על כן, תאים בתרבות ספרואיד נראה לשמר מסוימים ג'ין תבניות ביטוי המשויכים עמידות לתרופות של בעל חיים מודלים 30. אנו ממליצים כי גם קרינה כביכול ההתנגדות, תכונה אשר נקשר לסרטן הראש והצוואר בחולים רבים, הוא תוצאה של אינטראקציה תא-תא, microenvironments ברורים שמוביל וריאציות אספקת החמצן ובפעילות מטבולית. תופעה זו יכולה להיות חיקה ב spheroids עקב פונקציונליות מוגברת ויוו . לסיכום, השימוש העיקרי תאים ודור spheroids עלולה לאפשר לנו לשמר רבות ככל האפשר מאפייני ויוו צמיחת הגידול בשילוב assay חסכוניים ללמוד טיפול פרטני התגובה.
בהחלט קיימות מגבלות את הגישה. עד היום לא ידוע כמה תאים חולים בודדים שונים יבצע וזמינותו נחשפים הגידול, וזמינותו חזוי איך הוא מבחינת קורלציה עם תוצאות טיפול מאוחר יותר. מחקרים מופרז נחוצים פשוט להשוות את הביצועים במבחנה לעומת הקורס הקליני. בין היתר, כלומר שני גורמים תורמים אי ודאות זו: גידול הטרוגניות וחוסר תרבות משותפת עם תאי סטרומה ואת המערכת החיסונית. הגידול הטרוגניות היא תופעה לא מובן לחלוטין וקיים בין אתרים שונים משנה הפריימריז, וגם בין ראשי ולא גרורתי לוקליזציה12. מאז, מחקרים שנעשו לאחרונה יש שלישי באתר איפה שונות מאוד, תאים סרטניים מיוחדים יכולים להתקיים ולגבור בתוך נישות: מח עצם ודם מסוגלים הבית במחזור, המופץ גידול תאים9,10. חוסר של סוגי תאים אחרים כמו תאי סטרומה ואת תאי-T (כנציג של המערכת החיסונית) בתרבות תא אינה מוגבלת וזמינותו, אך חיסרון חוקי של רוב במבחנה מבחני הלומדים גידול טיפול הרגישות. לאור האחרונות סמים ואישורים מחקרים מתמשכים המשפיעים על התגובה T-cell, ניסויים עתידיים לגילוי סמים להתבצע בשילוב של מבחני שונים ושיטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי מענק של אוניברסיטת מינכן (FöFoLe פרוייקט-מס: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
