Summary
Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.
Abstract
De zebravis is een algemeen gebruikte modelorganisme voor de ziekte en fenotype-based drug Discovery. De zebravis genereert veel nakomelingen, heeft transparante embryo's en een snelle externe ontwikkeling. Zebravis embryo's kunnen daarom ook worden gebruikt voor de snelle evaluatie van de toxiciteit van de geneesmiddelen die kostbaar zijn en in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het efficiënt screenen van de toxiciteit van chemische verbindingen met 1-5-Day Post fertilisatie embryo's. De embryo's worden gecontroleerd door stereomicroscoop om de fenotypische defecten te onderzoeken die worden veroorzaakt door de blootstelling aan verschillende concentraties van verbindingen. Half-maximale dodelijke concentraties (LC50) van de verbindingen worden ook bepaald. De huidige studie vereiste 3-6 mg van een verbinding van de remmer, en het hele experiment duurt ongeveer 8-10 h worden voltooid door een individu in een laboratorium met basisvoorzieningen. Het huidige protocol is geschikt voor het testen van een verbinding om onverdraaglijke toxische of off-target effecten van de compound in de vroege fase van de opsporing van geneesmiddelen te identificeren en om subtiele toxische effecten te detecteren die kunnen worden gemist in de celkweek of andere diermodellen. De methode vermindert de procedurele vertragingen en de kosten van de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
De ontwikkeling van geneesmiddelen is een kostbaar proces. Voordat een enkele chemische verbinding wordt goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) enkele duizend verbindingen worden gescreend tegen een kostprijs van meer dan 1.000.000.000 dollar1. Tijdens de preklinische ontwikkeling is het grootste deel van deze kosten vereist voor de dierproeven2. Om de kosten te beperken, hebben onderzoekers op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling alternatieve modellen nodig voor de veiligheids screening van chemische verbindingen3. Daarom, in de vroege fase van de ontwikkeling van het geneesmiddel, het zou zeer gunstig zijn voor het gebruik van een methode die snel de veiligheid en de toxiciteit van de verbindingen in een geschikt model kan evalueren. Er zijn verschillende protocollen die zijn gebruikt voor de toxiciteits screening van chemische verbindingen waarbij dier-en celkweek modellen zijn betrokken, maar er is geen enkel protocol dat wordt gevalideerd en dat gemeenschappelijk wordt gebruikt4,5. Bestaande protocollen die zebravis gebruiken, variëren in lengte en zijn gebruikt door individuele onderzoekers die de toxiciteit hebben geëvalueerd aan de hand van hun gemak vereiste6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
In het recente verleden is de zebravis naar voren gekomen als een handig model voor de evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen tijdens de embryonale ontwikkeling op6,7. De zebravis heeft veel ingebouwde voordelen voor de evaluatie van chemische verbindingen13. Zelfs grootschalige experimenten zijn vatbaar, omdat een zebravis-vrouw batches van 200-300 eieren kan leggen, die snel ex vivoontwikkelen, geen externe voeding nodig hebben voor maximaal een week en transparant zijn. De verbindingen kunnen direct in het water worden toegevoegd, waar ze kunnen (afhankelijk van de aard van de compound) diffuus door de chorion, en na het uitkomen, door de huid, kieuwen en de mond van larven. De experimenten vereisen geen overvloedige hoeveelheden chemische verbindingen14 vanwege de geringe omvang van het embryo. Het ontwikkelen van zebravis embryo's Express de meeste eiwitten die nodig zijn om het normale ontwikkelings resultaat te bereiken. Daarom is een zebravis embryo een gevoelig model om te beoordelen of een potentieel medicijn de functie van een eiwit of signalerings molecuul dat ontwikkelend significant is, kan verstoren. De organen van de zebravis worden functioneel tussen 2-5 DPF15, en verbindingen die giftig zijn tijdens deze gevoelige periode van embryonale ontwikkeling induceren fenotypische defecten in zebravis larven. Deze fenotypische veranderingen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met behulp van een eenvoudige Microscoop zonder invasieve technieken11. Zebravis embryo's worden veel gebruikt in toxicologisch onderzoek vanwege hun veel grotere biologische complexiteit in vergelijking met in vitro geneesmiddelen screening met behulp van celkweek modellen16,17. Als gewervelde is de genetische en fysiologische make-up van zebravis vergelijkbaar met de mens en daarom zijn de toxiciteiten van chemische verbindingen vergelijkbaar tussen zebravis en mensen8,18,19, 20 , 21 , 22. zebravis is dus een waardevol hulpmiddel in de vroege fase van de geneesmiddelen ontdekking voor de beoordeling van de toxiciteit en de veiligheid van de chemische verbindingen.
In dit artikel geven we een gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt voor het evalueren van de veiligheid en de toxiciteit van koolzuuranhydrase (CA) remmer-verbindingen met behulp van 1-5-Day Post fertilisatie (DPF) zebravis-embryo's door een enkele onderzoeker. Het protocol omvat het blootstellen van zebravis embryo's aan verschillende concentraties van chemische remmer verbindingen en het bestuderen van de sterfte en fenotypische veranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de blootstelling aan de chemische verbindingen wordt de LC50 dosis van de chemische stof bepaald. De methode stelt een individu in staat om efficiënte screening van 1-5 test verbindingen uit te voeren en duurt ongeveer 8-10 uur, afhankelijk van de ervaring van de persoon met de methode (Figuur 1). Elk van de stappen die nodig zijn om de toxiciteit van de verbindingen te beoordelen, wordt beschreven in Figuur 2. De beoordeling van de toxiciteit van CA-remmers vereist 8 dagen, en omvat het instellen van parings paren (dag 1); inzameling van embryo's uit kweek tanks, reiniging en overbrenging naar een broedplaats van 28,5 °C (dag 2); verdeling van de embryo's in de putjes van een 24-putplaat en toevoeging van verdunde CA-remmer verbindingen (dag 3); Fenotypische analyse en beeldvorming van larven (dag 4-8), en bepaling van LC50 dosis (day8). Deze methode is snel en efficiënt, vereist een kleine hoeveelheid van de chemische verbinding en alleen basisvoorzieningen van het laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De kern faciliteit van zebravis aan de Universiteit van Tampere heeft een vestigingsvergunning verleend door de National Animal experiment Board (esavi/7975/04.10.05/2016). Alle experimenten met behulp van zebravis embryo's werden uitgevoerd volgens de provinciale overheid van Oost-Finland, sociale en gezondheidsafdeling van Tampere Regional Service Unit protocol # LSLH-2007-7254/YM-23.
1. opzetten van overnight zebravis parings tanks
- Plaats 2-5 volwassen mannelijke zebravis en 3-5 volwassen vrouwelijke zebravis in paren tanks 's nachts. (Fokken wordt opgewekt in de ochtend door automatische donkere en lichte cyclus 's nachts).
- Stel verschillende kruisen in om voldoende embryo's te verkrijgen voor de beoordeling van de toxiciteit van meer dan twee chemische verbindingen. Voor de beoordeling van de toxiciteit heeft elke concentratie minimaal 20 embryo's23nodig.
- Om te voorkomen dat de dieren omgaan met stress, laat u de dieren 2 weken rusten voordat u dezelfde individuen voor de fokkerij gebruikt.
2. inzameling van embryo's en bereiding van platen voor blootstelling aan de chemische verbindingen
- Verzamel de embryo's, de volgende dag voor de middag, met behulp van een fijnzeef en breng ze over in een Petri schaaltje met E3 embryo medium [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4en 0,1% w/v methyleenblauw].
- Verwijder vuil met een plastic Pasteur-Pipet (bijv. voedsel en vast afval). Onderzoek elke partij embryo's onder de stereomicroscoop om de niet-bevruchte/dode embryo's te verwijderen (geïdentificeerd door hun ondoorzichtige verschijning).
- Houd de embryo's bij 28,5 °C in een incubator. Onderzoek de embryo's, de volgende ochtend onder een stereomicroscoop en verwijder ongezonde of dode embryo's. Vervang ook het oude E3 medium met Fresh E3 medium.
Letop: zebravis embryo's worden altijd op 28,5 °c gehouden onder laboratoriumomstandigheden. - Breng 1 embryo zorgvuldig over in elke put van een 24-put plaat met voldoende E3 medium om de embryo's te bedekken.
3. preparaten van de stamoplossing van chemische verbindingen en verdeling van de verdunde verbinding in de putjes
- Neem de injectieflacons met remmer-verbindingen op die bij 4 °C zijn opgeslagen.
Opmerking: afhankelijk van de eigenschappen van de compound, deze worden opgeslagen bij verschillende temperaturen. - Weeg de compound (s) met behulp van een analytische balans die een paar milligram (mg) van de verbinding nauwkeurig kan wegen.
- Bereid ten minste 250 μL (100 mM) van de stamoplossing voor elke verbinding in een geschikt oplosmiddel (bijvoorbeeld E3 water of dimethylsulfoxide (DMSO), op basis van de oplosbaarheids eigenschappen van de verbindingen.
Opmerking: de bovenstaande stappen kunnen worden gedaan een dag voor het begin van het experiment op een geschikte tijd en opgeslagen bij 4 °c). - Maak seriële verdunningen van de stamoplossingen (bijvoorbeeld 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM en 500 μM) met behulp van E3 water in 15 mL centrifugebuizen.
Opmerking: de concentraties en het aantal seriële verdunningen variëren van de ene verbinding naar een andere verbinding, afhankelijk van hun toxiciteitsniveaus. - Verwijder vanaf de 24 goed plaat die embryo's bevat, E3 water uit de putten met een Pasteur-pipet en een pipet van 1 mL (met 1 DPF-embryo's) één rij per keer.
- Verdeel 1 mL van elk verdunningsmiddel in elk putje (beginnend met lager en verplaats naar een hogere concentratie) in de putjes van 24-putplaat.
- Stel een controlegroep in van dezelfde partij embryo's en voeg de overeenkomstige hoeveelheid verdunningsmiddel toe.
- Etiket 24-put platen met de naam en de concentratie van de verbinding en houd de platen bij 28,5 ° c in een incubator.
4. fenotypische analyse en beeldvorming van de embryo's met een stereomicroscoop
- Onderzoek de embryo's onder een stereomicroscoop voor parameters 24 uur na blootstelling aan de chemische verbindingen.
- Noteer de parameters zoals sterfte, broedeieren, hartslag, gebruik van dooier zak, ontwikkeling van de zwemblaas, beweging van de vis, pericardiale oedeem en vorm van het lichaam23.
- Neem de larven blootgesteld aan elke concentratie van de verbinding en leg ze opzij in een klein Petri schaaltje met 3% hoog moleculair gewicht methylcellulose met behulp van een metalen sonde.
Opmerking: de 3% methylcellulose (hoog moleculair met) is een viskeuze vloeistof die nodig is voor het insluiten van de vis met een vereiste oriëntatie voor microscopisch onderzoek. Voor het oriënteren van de vissen in deze vloeistof, is een metalen sonde nodig. - Neem de afbeeldingen met behulp van stereomicroscoop aangesloten op een camera. Sla de afbeeldingen elke dag op in een afzonderlijke map tot het einde van het experiment.
- Voer elke dag alle observaties in een tabel in een online tabel of op een afgedrukt blad in.
- Als de verbindingen neurotoxisch zijn, kunnen de 4 tot 5 DPF-larven een gewijzigd zwem patroon vertonen, een record van dergelijke veranderingen maken door een korte video (30 s tot 1 min) te vangen van de larven die een afwijkend bewegingspatroon vertonen.
- Noteer na 5 dagen blootstelling aan de chemische verbindingen de concentratie waarbij de helft van de embryo's sterft voor de berekening van de helft van de maximale dodelijke concentratie 50 (LC50) van elke chemische stof.
Nb: de LC50 is de concentratie waarbij 50% van de embryo's sterft aan het einde van 5 dagen blootstelling aan een chemische verbinding. Gebruik minimaal 20 embryo's voor het testen van de toxiciteit van elke concentratie van een samengestelde23. - Construeer een curve voor de sterfte van embryo's voor alle concentraties met behulp van een geschikt programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het kritische deel van de evaluatie van toxiciteit is het testen van verschillende concentraties van één of meerdere chemische verbindingen in één experiment. In het begin, selecteer de verbindingen voor de beoordeling van de toxiciteit, het aantal concentraties om te testen voor elke compound, en dienovereenkomstig, maak een grafiek (Figuur 3). We gebruikten een unieke kleur voor elke compound om de monsters te ordenen (Figuur 3). Het gebruik van oplosmiddel bestendige marker en labeling aan de onderkant of zijkanten van de platen is belangrijk om te voorkomen dat later mengen. Als de verbindingen fenotypische defecten veroorzaken in de larven die worden blootgesteld aan verschillende concentraties van Remmers, worden de defecten elke 24 h geregistreerd gedurende de periode van 1-5 DPF (figuur 4a, B, C, D). De embryo's die behandeld werden met een bekende CA IX-remmer met een concentratie van 500 μM vertonen geen schijnbare fenotypische veranderingen in de 1-5 dagen van blootstelling aan de chemische verbinding (figuur 4b). Figuur 4c en figuur 4D toont de embryo's behandeld met β-ca-remmers die verschillende fenotypische defecten hebben veroorzaakt, zelfs op dag 3 (pijl hoofd), gebogen lichaamsstructuur (pijl), onbenutte dooierzak en pericardiale oedeem (pijl hoofd) en afwezigheid van Otolith zakjes in de larven na 5 dagen na behandeling met een chemische verbinding (Arrow). In een andere studie, de embryo's behandeld met CA-remmer (figuur 4e) toont de afwezigheid van Otolith zakjes en zwemblaas (pijlkoppen). In onze studie, (figuur 4c, D), hebben we fenotypische defecten (fragiele embryo's en afwezigheid van pigmentatie) gedocumenteerd, zelfs na dag 1 van blootstelling aan ca-remmers. De fenotypische analyses toonden aan dat sommige van de remmer-verbindingen dodelijk zijn en niet kunnen worden ontwikkeld als geneesmiddel voor menselijk gebruik (figuur 4c, D en tabel 1).
De experimenten identificeerden een representatieve verbinding die minimale of geen fenotypische veranderingen veroorzaakte tijdens de embryonale ontwikkeling en toonde een hoge LC50 dosis (Figuur 5), wat suggereert dat de verbinding veilig is voor verdere karakterisering en kan potentieel worden ontwikkeld tot een kandidaat voor de geneesmiddelen voor menselijk gebruik16. Kijken naar stilstaande beelden van larven blootgesteld aan de compound toonde geen fenotypische defecten (Figuur 4B). Echter, dezelfde compound bleek neurotoxische en geïnduceerde ataxie in de larven na 5-dagen van blootstelling aan de CA-remmer (Figuur 6). Dit fenotype kon alleen worden gedetecteerd door het zwemgedrag van de zebravissen larven onder de Microscoop direct te observeren. Deze studies suggereerden dat de neurale ontwikkeling van zebravis larven gevoelig is voor de compound16,17.
Figuur 1: tijd in uren die nodig is voor de snelle screening van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's: In één reeks experimenten kan een persoon met een hands-on ervaring ongeveer 5 chemische verbindingen (elke verbinding die een minimum van 6 verdunningen vereist) met behulp van zebravis-embryo's in 24-Well-platen opschermen. In totaal duurt het ongeveer 8-10 uur vanaf het instellen van kruisen tot het uitvoeren van LC50 -bepaling over een periode van 8 dagen.
Figuur 2: grafiek waarin de afbraak van toxiciteits evaluatie van chemische verbindingen wordt aangegeven. Toxiciteit screening van chemische verbindingen vereist 8 dagen en kan worden onderverdeeld in vijf stappen. (Dag 1) Bestaat uit het opzetten van zebravis parings paren in tanks. (Dag 2) Omvat het verzamelen van embryo's uit de parings tanks tot Petri schaaltjes, gevolgd door ze gedurende een nacht bij een incubator van 28,5 °C te houden. (Dag 3) Onderzoek van embryo's met een stereomicroscoop en het schoonmaken van de embryo's. Verdeling van de embryo's in 24-put platen en toevoeging van de verdunningen van de teststoffen. (Dag 4-8) Fenotypische analyses van larven voor ontwikkelingsstoornissen. Zwemmen patroon studie en LC50 bepaling werd uitgevoerd op de laatste dag van blootstelling aan verbindingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: schematische voorstelling van experimenten die betrokken zijn bij de evaluatie van toxiciteit. De toxiciteits evaluatie bestaat uit het opstellen van een getabelleerd diagram met informatie over chemische verbindingen, verdunningen van de te beoordelen verbindingen en parameters. De verdunning van stamoplossingen naar de gewenste concentraties in 15 mL centrifugebuizen (de verdunning van de ene buis aan elke rij van de 24-Well plaat). Een 24-put plaat gemarkeerd met een waterdichte marker met de naam van de teststof, concentratie in elke rij, en datum van blootstelling. Onderzoek en beeldvorming van embryo's door de larven op een klein Petri schaaltje te brengen dat 3% methylcellulose met een hoog molecuulgewicht bevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: voorbeeld van fenotypische analyse van de larven in de controle-en test samengestelde behandelde groepen. A) fenotypische analyses van de controlegroep larven die niet met een stof zijn behandeld, vertoonden geen fenotypische afwijking onder een microscoop. B) larven die behandeld werden met een 500 μM ca-remmer (bekende remmer van koolzuuranhydrase IX toonde geen waarneembare fenotypische defecten aan. (C, D) De ontwikkelende larven behandeld met β-CA-remmer met respectievelijk 250 μΜ en 125 μM. De verbindingen geïnduceerde fenotypische defecten zoals gebogen lichaam, pericardiale oedeem, en onbenutte dooier SAC (pijlen en pijlkoppen). De panelen A en B zijn gewijzigd van aspatwar et al16. De panelen C, D en E tonen eerder niet gepubliceerde beelden, die werden verkregen met behulp van een andere Microscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: bepaling van de letale concentratie 50 (LC50) met behulp van 1-5 DPF zebravis larven. Toxiciteits beoordeling met behulp van zebravis-embryo's stelt onderzoekers in staat om de minimale dodelijke concentratie van de chemische verbinding aan het einde van het experiment te bepalen. De LC50 -concentratie van de verbinding (een bekende ca IX-remmer) was 3,5 mm. De hoge LC50 -concentratie maakt verdere karakterisering van de verbinding mogelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Aspatwar et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: een voorbeeld van zwempatroon analyse in zowel onbehandeld (A) als met remmer behandelde (B) groepen larven. De zebravis larven behandeld in panel B met 300 μM test remmer Compound (een bekende remmer van humaan koolzuuranhydrase IX) toonde een abnormaal (ataxisch) bewegingspatroon (pijlkoppen), wat suggereert dat de compound neurotoxiciteit induceert in de zich ontwikkelende embryo's . De pijlpunten wijzen naar de normale kromming van de staart tijdens het zwemmen. In panel A wijzen de pijlen naar de normale kromming van de staart tijdens het zwemmen. Dit cijfer is gewijzigd van Aspatwar et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| CA-remmer | Toxiciteits screening | LC50 | In vivo | Toxische CAIs | Verwijzing |
| Carbamaten | 24 | Alle | 1a | 3b | 24, ongepubliceerd |
| Coumarinen | 10 | Alle | - | 2 | Gepubliceerde |
| Nitroïmidazolen | 2 | Alle | 2 | 2c | 16 |
| Sulfonamiden | 5 | Alle | - | 3 | 25 |
| Totale | 41 | Alle | 3 | 10 | - |
| een heel Op basis van de toxiciteits screening werd de remmer gebruikt voor remming van Mycobacterium de in het zebravis-model. b Dodelijke remmer, cneurotoxisch boven 300 μM-concentratie | |||||
Tabel 1: een samenvatting van de veiligheid en de toxiciteit van de gescreende verbindingen. Het toxiciteits evaluatie experiment helpt de onderzoeker om een conclusie te bereiken over de veiligheid van de geteste chemische verbindingen. De LC50 -concentratie maakt het mogelijk om veilige concentratie te definiëren voor verdere karakterisering. Een onderzoeker kan beslissen of de verbinding dodelijk is, zelfs na 24 uur blootstelling van embryo's aan de stof die onderzocht wordt. In ons voorbeeld is een subtiel effect op zwemmen als gevolg van neurotoxiciteit de belangrijke informatie, wat nuttig is voor het instellen van verdere experimenten. Dienovereenkomstig konden we, op basis van de toxiciteits screening, veilige concentraties van de CA-remmer gebruiken voor verdere karakterisering in vivo24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro toxiciteitstest met behulp van gekweekte cellen kan overleven en morfologische studies van de cellen die beperkte informatie over de toxiciteit geïnduceerd door de teststof te detecteren. Het voordeel van toxiciteits screening van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's is een snelle detectie van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in een heel dier tijdens de embryonale ontwikkeling in een relevant modelorganisme. Ongeveer 70% van de eiwit codering menselijke genen hebben orthologs tegenhangers in de zebravis genoom25. Genetische trajecten die de signaaltransductie en-ontwikkeling beheersen, worden zeer goed bewaard tussen mens en zebravis26, en daarom hebben chemische verbindingen waarschijnlijk vergelijkbare toxische effecten bij mensen25.
Zebravissen staan voorop bij toxicologisch onderzoek en zijn al uitgebreid gebruikt om toxines in watermonsters op te sporen en om het werkingsmechanisme van milieu-toxines en de effecten daarvan op het dier27te bestuderen. In dit artikel tonen we het gebruik van het ontwikkelen van zebravis embryo's om de toxiciteit van potentiële verbindingen in de vroege fase van de geneesmiddelen ontdekking te evalueren. Onze snelle en veelzijdige toxiciteits beoordeling is gebaseerd op 1) veranderingen in het fenotype van het organisme (broedeieren, Otolith zakjes, pericardiale oedeem, dooiersac gebruik, notochord ontwikkeling, hartslag, zwemblaas ontwikkeling, beweging) tijdens embryonale ontwikkeling over een periode van 5 dagen, en 2) bepaling van de dodelijke concentratie (LC50). Redelijke uren van hands-on werk (8-10 h verdeeld over 8 dagen) is genoeg om te bepalen van het toxiciteitsprofiel van een verbinding met behulp van deze procedure. Voor nieuw gesynthetiseerde verbindingen die beschikbaar in beperkte hoeveelheden zijn, toxiciteit kan worden geëvalueerd met behulp van een minimum van 3 mg van de compound. Er is geen speciale uitrusting nodig. De procedure is, dus, een snelle en goedkope manier om te evalueren van de toxische effecten van een samengestelde die potentieel kunnen worden ontwikkeld tot het geneesmiddel voor menselijk gebruik.
De kwaliteit van de partij embryo's heeft een grote invloed op de uitkomst van het experiment. De kwaliteit van de eieren (met inbegrip van de snelheid van de bevruchting) is niet duidelijk onmiddellijk na de inzameling van de kweek tanks (0-4 HPF). Voor het verkrijgen van alleen normaal ontwikkelende embryo's voor de experimenten, voor het toevoegen van verbindingen, laten we de embryo's tot 28,5 °C gedurende 24 uur na de inzameling uit de kweek tanks. Na 24 HPF worden dode of ongezond uitziende embryo's weggegooid. Daarnaast is het raadzaam om in elk experiment een mock-behandelde groep embryo's te hebben om de kwaliteit van de partij eieren die in het experiment wordt gebruikt verder te beheersen en om de sterfte bij Baseline te zien om de LC 50 nauwkeurig te bepalen.
Een mock-behandelde groep is ook nodig om te controleren op de toxiciteit van het voertuig naar keuze. Veel chemicaliën zijn onoplosbaar in water en DMSO wordt vaak gebruikt als het voertuig voor de levering van de teststoffen. DMSO wordt over het algemeen goed verdragen door de embryo's in lagere (0,1%) concentraties28. Soms, de verbindingen zijn niet volledig oplosbaar zelfs in DMSO en de oplossing lijkt bewolkt waardoor het moeilijk voor de evaluatie van de toxiciteit. In dergelijke gevallen, om de stamoplossing van de compound volledig oplosbaar en helder te krijgen, het toevoegen van een druppel van 0,1% NaOH zal het probleem op te lossen. Er moeten passende controlegroepen worden ingesteld om de toxiciteit van de verbinding nauwkeurig te beoordelen. Als andere voertuigen worden gebruikt, kan de inherente toxiciteit ervan invloed hebben op het experiment.
Elke put van een 24-put plaat bevat van 1-10 embryo's ondergedompeld in een totaal volume van 1 mL. Als de teststof slechts in kleine hoeveelheden beschikbaar is, kan het nodig zijn om maximaal 10 embryo's per put te gebruiken voor de beoordeling van de toxiciteit. Het wordt ten zeerste aanbevolen om voor elke analyse slechts 1 embryo per goed te gebruiken16,24,29. De plaat wordt gedurende 5 dagen bij een incubator van 28,5 °C bewaard. Soms significante verdamping wordt waargenomen waardoor een duidelijke verandering in de concentratie van de stof in een gegeven goed16. Door de 24-Wells platen met paraffine films van alle kanten af te dichten, alleen embryo's in de middelste putjes te plaatsen en de andere putten langs de velgen met water te vullen, kan de door verdamping veroorzaakte problemen worden vermeden. In onze eerdere studies, we hebben niet observeren eventuele verdamping van de verdunners van de chemicaliën van 24-Well platen24,29. Ook, als de compound in kwestie is bekend als instabiel onder omgevingstemperaturen, dagelijkse veranderingen van water met verse compound zal nodig zijn voor betrouwbare resultaten.
Het zwem patroon van zebravis larven wordt na de 5 dagen van blootstelling aan de compound geanalyseerd. De putten van een 24-Wells plaat met 5 DPF larven zijn niet ideaal voor het doel als gevolg van de beperkte grootte van de put. Daarom, voor een accurate analyse van het zwem patroon, moeten de larven worden overgebracht naar een Petri schaaltje met 50 mL E3 water en kunnen ze 2 minuten voor de analyse regelen. In onze studie toonden slechts twee remmers het effect op zwem patroon16 onder de 52 α-CA-en β-ca-remmers afgeschermd voor veiligheid en toxiciteit, op basis van onze ervaring deze test kan subtiele veranderingen detecteren, waaronder een milde ataxische beweging van de larven.
Deze studie toonde aan dat de enige beperking op de huidige methode fysieke behendigheid is. Deze bezorgdheid kan worden overwonnen door herhaling, omdat de vaardigheid van een persoon verbetert met de praktijk. Zodra de expertise is bereikt, is de evaluatie van verbindingen met behulp van zebravis embryo's ethisch, gemakkelijk, efficiënt en informatief. Daarom verwachten wij dat een dergelijke snelle test met behulp van zebravis embryo's een populair instrument zal worden voor de in vivo toxiciteits screening in de vroege fase van de Geneesmiddelenontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werd geen potentiële belangenverstrengeling gerapporteerd door de auteurs.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door subsidies van Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Fins Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere Tuberculosefonds (SP, MH en MP) en Jane en Aatos Erkko Foundation (SP en MP ). We danken onze Italiaanse en Franse medewerkers, Prof. Supuran, en Prof. Winum, voor het leveren van koolzuuranhydraseremmers voor de veiligheid en toxiciteit bij de evaluatie van anti-TUBERCULOSE en anti-kankergeneesmiddelen ontwikkeling. Wij danken Aulikki Lehmus en Marianne Kuuslahti voor de technische bijstand. We bedanken ook Leena Mäkinen en Hannaleena Piippo voor hun hulp bij het fokken van zebravis en het verzamelen van embryo's. We danken Harlan Barker oprecht voor de kritische evaluatie van het manuscript en inzichtelijke commentaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
