Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att lokalt inducera apikal parodontit hos möss. Vi visar hur man borrar ett hål i musens tand och exponerar sin massa, för att orsaka lokal inflammation. Analysmetoder för att undersöka arten av denna inflammation, såsom mikro-CT och histologi, visas också.
Abstract
De mekanismer som är involverade i lokal inducerad inflammation kan studeras med hjälp av flera tillgängliga djurmodeller. En av dessa är induktion av apikal parodontit (AP). Apikala parodontit är en vanlig patologi av en inflammatorisk karaktär i parodontala vävnader som omger tandroten. För att bättre förstå arten och mekanismen hos denna patologi är det fördelaktigt att utföra ingreppet hos möss. Induktionen av denna odontogena inflammation uppnås genom att borra i musens tand tills tand massan exponeras. Därefter är tand massan fortfarande utsatt för att vara förorenad av den naturliga orala floran över tid, vilket orsakar apikala parodontit. Efter denna tidsperiod, djuret offras, och tanden och käkbenet kan analyseras på olika sätt. Typiska analyser är mikro-CT-avbildning (för att utvärdera benresorption), histologisk färgning, immunohistokemi och RNA-uttryck. Detta protokoll är användbart för forskning inom området för oral biologi för att bättre förstå denna inflammatoriska process i en in vivo experimentell miljö med enhetliga villkor. Förfarandet kräver en noggrann hantering av möss och den isolerade käken, och en visuell demonstration av tekniken är användbar. Alla tekniska aspekter av de förfaranden som leder till inducerad apikal parodontit och dess karakterisering i en musmodell demonstreras.
Introduction
Målet med denna metod är att inducera apikal parodontit i en mus genom att förora spetsen med den naturliga mikrofloran, och att sedan studera olika egenskaper hos denna patologiska process.
Apikala parodontit (AP) är en vanlig patologi av en inflammatorisk karaktär i parodontala vävnader som omger tandroten. Denna tandsjukdom kan orsaka svår smärta och måste behandlas av en tandläkare. Behandlingsalternativen inkluderar rotfyllning behandling (primär eller sekundär), ENDODONTISK kirurgi, tandutdragning, eller uppföljning beroende på de kliniska och radiologiska fynd, och yttrandet från klinikern. Mekanismen för denna inflammatoriska process, även studerat i flera decennier1,2,3, är fortfarande inte heltäckande förstås. Med tanke på svårighetsgraden av denna patologi, det finns alltså ett tydligt behov av forskning som behandlar dess grundläggande natur. System där studiet av AP är möjligt är således av stort vetenskapligt intresse.
Eftersom AP är en komplicerad patologisk process som involverar de lokala vävnaderna och immunförsvaret, är in vitro-studier otillräckliga för en fullständig förståelse av processerna. Studier av kliniska prover av denna sjukdom är också problematiska på grund av etiska begränsningar och betydande variation mellan olika människor och olika kliniska stadier4,5, ochdärmed nödvändigheten av in vivo-modeller. Dessa modeller är baserade på begreppet utsätta tand massan till kontaminering och observera den inflammatoriska reaktionen av kroppen till denna stimulans i de periapikala vävnaderna6,7. Vanliga in vivo-modeller är gnagare eller större djur såsom hundar. Trots den kliniska utmaningen vid behandling av möss, som är mycket små djur med miniatyr tänder, är fördelarna med musmodellen betydande: praktiskt taget arbetar med möss är tekniskt enkel när det gäller anläggningar och är mest kostnadseffektiv, och vetenskapligt är musen en väl studerat djurmodell med lätt tillgängliga genetiska och molekylära verktyg och en väl studerat genom. Faktum är att tidigare studier använt en musmodell för att studera inflammatoriska och benresorption signaler och celler inblandade i apikala parodontit8,9,10,11. Därför behövs ett tydligt protokoll om hur man använder en musmodell för att studera AP. Här beskriver vi ett sådant protokoll.
Det protokoll som beskrivs här är har den stora fördelen av att vara lämpligt att studera knock-out (Ko) möss och lära sig hur avsaknaden av en specifik gen påverkar tand inflammation7,12. Andra användbara tillämpningar av detta protokoll inkluderar studiet av effekterna av mediciner och systemiska tillstånd på utvecklingen av apikala parodontit13, effekten av apikala parodontit på utvecklingen av osteonekros i käkarna14 , 15 och stamcellsterapi för ben förnyelse16.
Detta protokoll kan också generaliseras som en modell för att studera lokal inflammation. För att studera den inflammatoriska processen, flera musmodeller har utvecklats, som inkluderar till exempel inducerad kolit eller artrit17,18. Dessa modeller har systemiska effekter och har ingen inbyggd kontroll i samma djur. Modeller för inducerad apikal parodontit, som inkluderar en kontralaterala kontroll utan inflammation, har fördelen av att övervinna dessa begränsningar14,19.
Det protokoll som beskrivs nedan är därför användbart för forskare som är intresserade av lokala inflammatoriska processer. Den kontrollerade karaktären av denna inflammation, dess inneslutning till en viss plats, och den kontralaterala kontroll tand, alla gör detta protokoll värdefullt för att studera de mekanismer som är inblandade i denna process. Dessutom är protokollet användbart för forskare som är intresserade av de kliniska aspekterna av Periapikal inflammation. Musmodellen är idealisk för att studera olika variabler av sjukdomen, förutom fördelen av att kunna enkelt utföra genetiska manipulationer i musmodellen, för att undersöka aktiviteten hos specifika gener i Periapikal inflammation.
Tekniskt, det kliniska förfarandet är utmanande att utföra på grund av de små dimensionerna av möss tänderna. Det kommer att vara fördelaktigt att visualisera denna procedur för att lära sig om positionering, utrustning som behövs och prestanda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av hebreiska universitetet (Ethics No. MD-17-15093-5).
1. djur anestesi och positionering
- Förbered sterila lösningar enligt beskrivningen nedan.
- Bered 5 mL av 7 mg/mL ketamin och 0,09 mg/mL Medetomidin utspädd i fosfatbuffertlösning (PBS)/Saline.
- Bered en steril lösning av atipamezol (0,4 mg/mL) utspädd i PBS/saltlösning (rekommenderas att bereda en mängd på 5 mL).
- Förbered en steril lösning av Mepivacaine (7,5 mg/mL) utspädd i PBS/saltlösning för lokalbedövning (en medföljande injektionsflaska med Mepivacaine är tillräcklig för ett bestånd av 7,2 mL).
- Använd 6-8 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 möss för experimentet. Förvara djur i en särskild patogen fri (SPF) djurenhet, med standard vatten och livsmedel som tillhandahålls av anläggningen och utfodring av djuret libitum.
- Väga möss och injicera intraperitonealt (IP) en volym på 10 μL för varje gram av vikten. Till exempel, för en mus som väger 20 gram,
Injicera 200 μL ketamin/Medetomidin lösning. Detta kommer att ge en slutlig koncentration av (70 mg/kg) ketamin och (0,9 mg/kg) Medetomidin
för varje djur. - För att förhindra ögon sår på grund av torrhet under ingreppet, applicera ögonsalva som innehåller kloramfenikol (5%) på djurens ögon medan de är under anestesi. Håll djuren varma med en lampa medan de är sövda. Kontrollera djupet av anestesi genom att kontrollera pedal reflex (utför fast tå nypa).
- När musen är sövda, Placera musen på sin högra sida (för en högerhänt forskare) på en sluten cell extruderad polystyren skum yta och fästa fötterna på ytan med tejp.
- Öppna munnen genom att använda små gummiband runt framtänderna (1 för övre framtänder, och 1 för lägre framtänder) hålls på plats av långa nålar nålas in i slutna celler extruderad polystyren skum yta.
- Dra tillbaka den högra kinden genom att använda pinps tejpade på ytan. Använd PINDATA som är stängda i stabilt tillstånd.
- Placera ytan med musen i en bekväm arbetsställning som möjliggör tillgång till mandibular molarer, med rätt förstoring (ett binokulärt Mikroskop eller kliniskt Mikroskop) och ljus.
- Dra tillbaka tungan med hjälp av pinkoppar eller Dental spatel och injicera lokalbedövning med en 27 gauge nål i mucobuccal luckan intill den första mandibular molar. 25-50 μL är tillräcklig. Svullnad av vävnaden runt injektionsstället ska visualiseras.
2. exponering av massa
- Använd en 1/4 rund Dental Burr, eller en samma storlek diamant skorv (ett långt skaft rekommenderas) med en hastighet av 800 rundor per minut (rpm), ansluten till någon lämplig Dental motor (till exempel en automatisk vridmoment minskning (ATR) motor).
- Borra på ocklusala delen av första höger mandibular molar tills massan Horn är synliga genom dentin. Använd korta skurar av motorn för att förhindra att området övervärms.
- Använd en K-fil eller H-fil #8 eller #10 för att tränga igenom massan och infoga filen i massa horn (mesial och distala) genom att bryta dentin som täcker dem. Filer steriliseras av autoklav.
- Fortsätt att arbeta med filerna inne i massan så djupt som möjligt, samtidigt bredda öppningar med filerna. Vanligtvis kommer det att finnas blödning synlig från massan.
- Se till att runda skarpa kanter av tanden med Burr och ta bort tanden från ocklusion, för att minska smärtan under experimentet. Rengör smuts under ingreppet med en microbrush.
- Lämna den kontralaterala tanden (vänster första mandibular molar) som en kontroll.
3. slutet av det kliniska förfarandet
- Släpp musen från fixeringsläppet och injicera Atipamezole IP (10 μL för varje gram kroppsvikt. Detta kommer att ge en slutlig dos av (4 mg/kg) Atipamezole.
- Injicera buprenorfin utspädd i PBS/saltlösning (0,05 mg/kg) IP (rekommenderas att förbereda ett belopp på 3 mL på dagen för förfarandet). Se diskussion för förklaring varför smärtlindring är nödvändig.
- Se till att djuren återhämta sig från anestesi innan du lämnar dem. Ge dem mjuk mat eftersom de kan vara oförmögna att äta hård mat på grund av tand smärta.
4. uppföljning efter ingreppet (42 dagar)
- För de första 3 dagarna efter ingreppet, väga djuren och injicera buprenorfin (0,1 mg/kg) IP en gång om dagen (rekommenderas att förbereda en mängd 6 ml).
- Under tiden för experimentet (42 dagar när inflammationen byggs upp) övervaka djuren efter vikt och allmän beteendemässig bedömning 2-3 gånger i veckan.
- Leverera mjuk mat till djuren under uppföljnings periodens gång. Blöt maten med vatten och Lägg den i en petriskål på golvet i buren.
5. avslutande av experiment och analys
- När 42 dagar11 av uppföljningen har slutförts, söva djur IP med ketamin/xylazin vid en koncentration av 106,25 mg/kg ketamin, och 75 mg/kg xylazin (en stamlösning av 42,5 mg/ml ketamin, och 1,5 mg/ml xylazin i en total volym av 2 ml är rekommenderas) och förforma cervikal dislokation.
Obs: det finns olika alternativ för möjliga analyser för att utvärdera inflammation20,21. Här kommer analysen av vävnaden med mikro-CT och histologisk färgning att beskrivas. - Efter eutanasi, använda kirurgisk sax och tång för att skära ut en del av käken inklusive 3 kindtänderna (separat för varje sida-behandlade och icke-behandlade kontroll). Genom att använda tång lossna så mycket som den mjuka vävnaden som möjligt, lämnar mestadels ben och tänder på provet.
- Skölj vävnaden kort i PBS, och sedan lägga den i PARAFORMALDEHYD (PFA) 4% (utspädd i PBS) för 24-48 timmar för fixering.
FÖRSIKTIGHET: Använd PFA i en kemisk huva, och enligt dess material säkerhets data blad (MSDS) riktlinjer. - Efter 24-48 timmar, skölj med PBS 3x för att tvätta ut PFA.
- Micro-CT
- För mikro-CT-analys, ta de skördade vävnaderna (del av underkäken inklusive 3 kindtänder, i dimensioner av ca 4 mm x 5 MMX 1 mm) till en mikro-CT scanner, placera dem i en 12 mm diameter rör fylld med 1,5 mL PBS orienterad så att buckala eller språkliga ytor av tanden och roten är att lägga parallellt med botten av röret. Separera proverna med svamp och täck över röret med flexibel film.
- Öppna skannings panelen och välj Mät numret. Välj kontrollfilen med följande parametrar: energi 70 kV, intensitet på 114 μA, och upplösning på 6 μm3 Voxel storlek.
- Klicka på Scout-vyn, och när bilden visas klickar du på referenslinje och markerar området för proverna för skanning. Efter varje prov klickar du på Lägg till skanning. När du är klar med att markera exemplen går du till uppgiftslistan och väljer Starta Interact-aktiviteter.
Anmärkning: samma prover kan därefter användas för histologi. Det är viktigt att de inte torkar ut under CT-Scan.
- Använd ett lämpligt datorprogram för mikro-CT-justering och analys.
- Öppna provet på XY-planet i Micro-CT-utvärderingen. Välj tre punkter för varje prov för justering:
Den mesiala apikala sammandragning-definierar ursprunget till koordinatsystemet.
Den koronala delen av mesial Canal-definierar en punkt på Z-axeln.
Den distala apikala sammandragning-definierar en punkt på XZ planet. - Använd mätverktyget på den vänstra panelen och rita en linje som når varje punkt. Definiera var och en av de tre punkterna med ett X, Y & Z-värde, som det visas i den högra panelen.
- Definiera intresseområdet i provet genom att välja uppgift under μct-utvärderingoch klicka på 3D- utvärdering. En rektangel och ett fönster med måtten per axel visas på skärmen. Matcha dimensionerna för rektangeln så att den passar det intressanta området på XY-axeln genom att klicka i hörnen med musens mittknapp. Välj dimensionerna i Z-axeln genom att infoga det första segmentet av intresse på Z-kvadraten under VOI-start, och antalet segment från den första till det sista segmentet av intresset för z-kvadraten under dim.
- Klicka på program under sessionshanteraren, och välj decterm. Vänta några sekunder på att ett fönster ska öppnas och skriv sedan de fem stegen i det vinklade scriptet som beskrivs nedan enligt följande instruktioner (mellan raderna Klicka på RETUR):
Ipl
isq_to_aim
aim1 - Kopiera den ISQ (fil av intresse) namn: Välj vyer under Session Manager och klicka på microctdata. Hitta filen som arbetar på, och mellersta Klicka på filen. Sedan mellersta Klicka tillbaka i fönstret på DECterm.
- Ange X-, Y-& Z-värdena (med ett mellanrum mellan dem) som fastställdes enligt VOI när du valde region av intresse.
- Ange X, Y & Z-värden (med ett mellanslag mellan dem) som fastställdes under dim när du väljer region av intresse.
- Vänta tills du får ett meddelande: ISQ till AIM slutförd.
(steg II-justering):
Justera z
aim1
aim2 - Ange X-, Y-& Z-värdena (med ett mellanrum mellan dem) som bestämdes för Koordinatsystemets ursprung.
- Ange X, Y & Z-värden (med ett mellanslag mellan dem) som bestämdes för punkten på Z-axeln.
- Ange X-, Y-& Z-värdena (med ett mellanrum mellan dem) som fastställdes för punkten på XZ-planet.
- Vänta tills du får ett meddelande: "align_Z Completed"
(steg III-header):
Huvudet
aim2
0 0 0
0 0 0 - Klicka på RETUR.
(steg IV-konvertera filen tillbaka från AIM till ISQ):
toisq
aim2 - Kopiera den ISQ (fil av intresse) namn: Välj vyer under Session Manager och klicka på MicroCT data. Hitta filen du arbetar med, och mellersta Klicka på filen. Sedan mellersta Klicka tillbaka i fönstret på DECterm. Radera (med "Backsteg") ". ISQ "i slutet av filen och skriv:" _ New. ISQ "för att känna igen den justerade filen.
- Klicka på RETUR | Enter.
- Vänta tills du får ett meddelande: "toisq_from_aim Completed"
(steg V-Flip):
ISQ
A - Kopiera den nya ISQ (fil av intresse) namn: Välj vyer under sessionshanteraren och klicka på MicroCT data. Hitta filen som arbetar på, och mellersta Klicka på filen. Sedan mellersta Klicka tillbaka i fönstret på DECterm.
- Klicka på RETUR | Enter. Vänta med att få ett meddelande: "isq_to_aim Completed"
Flip
A
Aa
Zx
vänta med att få ett meddelande: "flip_aim Completed"
Från
Aa - Kopiera det nya ISQ-namnet: Välj vyer under sessionshanteraren och klicka på MicroCT-data. Hitta filen som arbetar på, och mellersta Klicka på filen. Sedan mellersta Klicka tillbaka i fönstret på DECterm. Radera (med "Backsteg") ". ISQ "i slutet av filen och skriv:" _ flip. ISQ "för att känna igen den justerade filen.
- Vänta tills du får ett meddelande: "from_aim_to_isq Completed"
- Öppna provet på XY-planet i Micro-CT-utvärderingen. Välj tre punkter för varje prov för justering:
- Contouring
- Välj det segment som representerar ungefär mitten av tanden, där Koronal massa, radikulära massa av båda kanalerna, och båda apikala foramens presenteras.
- Manuellt markera konturen av intresse på den mellersta segmentet genom att klicka på den övre vänstra kon tur panelen-med början från den distala punkten av den distala roten Apex Markera den apikala gränsen till det röntgentäta apikala området, genom den mesiala gränsen för mesial root Apex efter den distala gränsen för mesial roten och den mesiala gränsen för den distala roten genom furkation regionen (se figur 3 II, IV).
- Kopiera denna kontur (Ctrl + C, CTRL + V) och justera den därefter till 5 skivor placerade på vardera sidan av den mellersta segmentet.
- För att beräkna vävnads volymen för den kontur som är markerad för varje prov, Välj uppgift under μct-utvärdering, och klicka på 3D-utvärdering. I fönstret för 3D-utvärdering klickar du på Välj nära aktivitet och väljer ett filter för att beräkna vävnads volymen (TV).
- Histologi
- Efter avlägsnande av vävnader från mikro-CT scanner, avkalka vävnaderna genom att sätta varje prov i en microcentrifug rör med 1 ml etylendiamintetraättiksyra (EDTA) 0,5 M pH 8,0 för 10 dagar. Ändra EDTA-lösningen var tredje dag.
- Dehydrering: sätt prover i histologiska kassetter, och i ökande etanol koncentrationer, en timme vardera, enligt följande: 70% etanol (i detta skede processen kan stoppas i flera veckor, så länge proverna hålls i etanol), 90% etanol 2x, 100% etanol 2x, xylen 2x (försiktighet: Använd xylen i en kemisk huva, och enligt dess MSDS riktlinjer).
- Överför kassetter till flytande paraffin (60 ° c) och låt den vara i kemisk huv över natten för att xylen ska avdunstat.
- Blockering: Använd en histologisk blockeringsmaskin för att bädda in proverna i paraffin. Var noga med att bädda in dem i en korrekt position (dvs., kronan och rötter bör orienteras parallellt med den nedre delen av mögel, på ett sätt som tanden är "liggande") för att få sagittal sektioner. Proverna är nu klara att klippas med en mikrotom.
- Skära sektionerna: börja med att skära tjocka skivor av ~ 20 μm tills de når den relevanta delen av vävnaden. När erkänna någon del av tanden (krona eller rötter) ändra till delar av 6 μm, och ändra vinkeln för skärning enligt föregående avsnitt.
- Till exempel, om det föregående avsnittet ingår kronan men inte rötterna, ändra vinkeln på blocket i mikrotomen så att rötterna kommer närmare kniven, och kronan går tillbaka (de delar av tanden kan kännas igen med ett naket öga på blocket själv).
- Fortsätt att justera vinkeln tills du får sagittal sektioner inklusive Koronal och radikulära massa, och apikala foramen. Skär i denna orientering så många skivor som möjligt, tills den relevanta vävnaden är alla skurna.
- För infärgnings protokoll (t. ex. hemotoxylin och eosin färgning (H & e), brun & Brenn färgning, tartrat-resistent surt fosfatas (trap) färgning, immunohistokemi), se20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett flödesschema av experimentella steg presenteras i figur 1. Som nämnts i protokollet, möss är sövda, och deras första mandibular molar på ena sidan borras tills massa exponering, medan kontralaterala tanden lämnas som en kontroll. Därefter är tänderna kvar att vara förorenade av den orala floran för 42 dagar, under vilken de övervakas och få smärtstillande medicin. Efter 42 dagar, möss är euthanized, och tänderna och angränsande käken tas för analys.
Figur 2 visar kliniska bilder av mus underkäken efter första högra exponeringen av molar massa. I figur 2A visas hela underkäken, medan insetet i figur 2b visar en utvidgning av den behandlade första högra molar. Vänster första molar används som kontroll. Exponering av både mesiala och distala massa horn och ingången till kanalerna kan ses i figur 2b. Observera att tanden sänktes mekaniskt till sub-ocklusion för att minska smärtan.
Efter tand massa exponering för den orala floran, är tandköttet så småningom förorenat6,7 och blir nekrotisk. Enligt litteraturen22, gramnegativa bakterier utsöndrar sedan lipopolysackarid (LPS) till den apikala regionen av tanden. Genom en komplex reaktion av immunförsvaret, ett av resultaten är benresorption i periapikala regionen, som är kännetecknande för apikala parodontit23. Denna benresorption kan identifieras och kvantifieras av mikro-CT. I mikro-CT-bilder, röntgen periapikala regioner indikerar områden där den hårda benvävnaden blev en mjuk Periapikal lesion på grund av den inflammatoriska processen. I figur 3visar representativa mikro-CT-bilder en behandlad tand jämfört med en kontroll. Pilen i figur 3aIII pekar på den mesiala massa exponeringen (den distala massa exponeringen syns inte på denna del av provet), och de mesiala och distala periapikala radiolucensområdena för benresorption omges av en streckad linje. En boxplot graf som visas här kvantifierar den signifikanta periapikala benresorptionen i de behandlade tänderna jämfört med kontrollerna.
Även mikro-CT är en utmärkt teknik för utvärdering av 3-dimensionell storlek av lesioner, det saknas information om deras biologiska sammansättning. Histologisk färgning, som visas i figur 4, ger denna information. H & E färgning påvisas i en kontroll tand jämfört med en behandlad tand. I den behandlade tanden (figur 4b, C, D) uppvisar tand massan en nekros som tydligt kan ses i H & E-färgning (figur 4c), jämfört med den organiserade massan massa vävnad (figur 4a). Dessutom, och viktigare, i periapikala regionen av den behandlade tanden en Periapikal lesion, sammansatt av immunceller (dominantly makrofager och lymfocyter), visualiseras (figur 4D) (jämfört med den friska parodontala ligament (PDL) och benvävnad i den periapikala regionen av kontroll tanden). Denna Periapikal lesion är det önskade resultatet av den inducerade apikala parodontit teknik som presenteras här.
Å andra sidan uppvisar figur 5 en misslyckad kontaminering som kan förekomma i sällsynta fall (minst 85% av djuren uppvisar benresorption i mikro-CT), d.v.s. en tand som exponerades för den orala floran under 42 dagar, men som inte utgjorde en massa nekros , och därför inte visade benförlust och Periapikal lesioner i mikro-CT (figur 5a) och histologisk (Figur 5b) analyser.
Figur 1: tids axel för experimentell process. Schematisk framställning av den temporal utvecklingen av det experimentella tillvägagångssättet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kliniska bilder av mus underkäken efter rätt första molar massa exponering. (A) mus underkäke, första höger molar med exponerad massa, första vänster molar fungerar som en obehandlad kontroll. B) utvidgning av den högra molar med den exponerade massan. Ingången till kanalerna kan visualiseras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mikro-CT-analys. A) representativa MIKRODATORTOMOGRAFI (skivor med 6μm) av behandlade (AIII, AIV) och kontroll (AI, AII) tänder. Vid mesial massa exponering (distal massa exponering förekommer inte i denna sektor). Mesiala och distala periapikala områden av benförlust intill den behandlade tanden är omgivna av streckade linjer. AII, AIV-representativa bilder av kon tur märkning. B) fält-Plot kvantifiera vävnads volymen (mätt med konturen märkt för 11 skivor av varje prov) av kontrollen (orange, n = 14 djur) jämfört med de behandlade (blå, n = 15 djur) prover. Analysen utfördes med hjälp av Scancos utvärderingsprogramvara för Micro-CT. proverna anpassades på den sagittal axeln orienterade på ett sätt som Koronal massa, rotkanaler och apikala foramen visualiserades i samma sektor (se protokollet för detaljerad information om orientering). Konturer markerades för 5 skivor på vardera sidan av mitten av tanden området (alla tillsammans 11 skivor). Vävnadsvolym för konturen av varje prov beräknades med hjälp av programvaran. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: histologisk H &Amp; E representativa bilder: (a) histologisk del av en kontroll tand. B) histologisk bit av en behandlad tand, med en allvarlig Periapikal lesion presenterad. Cutvidgning av nekrotisk vävnad. Dförstoring av Periapikal granulomvävnad P = massa, d = dentin, B = ben, BM = benmärg, PDL = periodontal ligament, N = nekrotisk massa, G = granulom. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på misslyckad kontaminering: a) mikroct-representativ bild av en tand med massa exponering (vit pil), men ingen signifikant Periapikal benförlust, korrelerad tillB) histologisk H & E representativ bild av samma tand som avslöjar Vital (inte nekrotisk) massa, och normala apikala vävnader. P = massa, D = dentin, B = ben, BM = benmärg, PDL = periodontal ligament. C) utvidgning av förkalkade vävnader som presenteras i B. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introduceras en metod för induktion av apikal parodontit hos möss. Målet med metoden är att utnyttja det apikala parodontit villkoret för att studera mekanismer och konsekvenser av denna inflammatoriska process. Apikal parodontit inducerades i 6-8 veckor gamla möss, en ålder där rötterna är fullt utvecklad24. För att orsaka apikala parodontit i denna modell, är tandköttet av mus mandibular molarer exponeras med hjälp av en tand skorra. Bakterier från den orala floran av möss (i SPF villkor) invadera massa-och rotkanalerna av tänderna, orsakar massaved nekros, och utsöndring LPS till apikala vävnader, som utlöser apikala inflammation.
När du utför detta förfarande, uppmärksamma dessa följande kritiska steg. Korrekt positionering av djuren under massa exponering är avgörande för framgången av förfarandet. Ett kritiskt steg är den korrekta exponeringen av massan. Otillräcklig kanal exponering kan resultera i en dentin Bridge formation, vilket kan leda till fel i förfarandet och oförmåga att skapa AP. Vid massa exponering krävs uppmärksamhet för att minimera mjukvävnadsskada vid massa exponering för att undvika oönskad smärta och inflammation i andra regioner som kan orsaka biverkningar. Korrekt anpassning av proverna i Micro-CT analysprogramvara är avgörande för att få tolkningsbara resultat. Vid beredning av käke vävnad för histologi, det rekommenderas att dra bort mjuk vävnad som omger benet för att uppnå korrekt orientering när förbereder formar för histologi. Proverna skall förvaras i vått medium under hela processen (från skörde stadiet, genom mikro-CT, fram till det histologiska block förfarandet). När du klipper vävnaden i en mikrotom, bör vinkeln på provet fastställas för att uppnå sagittal skivor av tanden. Det är också viktigt att ta hänsyn till etiska frågor om djurens välbefinnande. Till exempel, ordentlig anestesi är kritisk under förfarandet (både systemisk och lokal, se25,26). Smärtstillande är viktigt, särskilt för de första dagarna efter ingreppet, och övervakning vikt och beteende samt en försörjer djuren med mjuka livsmedel bör genomföras. Från tidigare erfarenhet, den totala reaktionen av möss är att tolerera väl förfarandet och de uppvisar inte extrem ångest.
Ett fel i metoden anses i fall där en apikal inflammation inte bildas: det finns inga belägg för benresorption i den periapikala regionen av tanden på Micro-CT-skanning, och PDL vävnad av tanden är intakt i histologisk färgning (som presenteras i figur 5). De möjliga orsakerna till att inte uppnå inflammation inkluderar stokastiska skillnader i beteendet hos djuren samt den specifika exponeringen av varje djur till bakterier. Även om goda resultat uppnås genom att orsaka apikal parodontit genom att använda denna metod (minst 85% av djuren uppvisar benresorption), följ protokollet noga för att minska variationen mellan proverna. Om några möss uppvisar tecken på ångest under uppföljningsperioden, Överväg att ta bort dem från experimentet för att förhindra lidande. Beslutet att göra detta kan underlättas genom att man tittar på djurens förlust eller viktökning under uppföljningsperioden. Djur som förlorar mycket vikt lider och bör avlägsnas. Vi har också konstaterat att de djur som lider mest är de som startade experimentet vid en låg vikt eller dåligt hälsotillstånd. Sammantaget bör förfarandet, om det utförs på rätt sätt, ge konsekventa resultat.
Flera begränsningar av denna teknik ska noteras. Det är viktigt att notera att denna modell har utvecklats för att studera apikal parodontit orsakad av bakteriell kontamination och inte efterlikna flera andra möjliga mekanismer genom vilka apikala parodontit kan uppstå, såsom traumatisk skada och autoinflammatorisk sjukdom. Det finns dessutom betydande skillnader mellan denna modell och den kliniska situationen hos patienter som lever på människa. Hos möss har spontana periapikala lesioner inte beskrivits och detta är helt en konstgjord situation. Anatomin av gnagare tänder skiljer sig också från den hos människor; betydelsen av dessa skillnader är okända. Icke desto mindre, musen är en mycket användbar modell för att förstå grundläggande mekanismer och fenomen. Dessutom, en root Canal Healing modell i en mus (genom att behandla med en rotfyllning) har inte rapporterats hittills, men potentiellt har stor betydelse inom detta forskningsområde bör det visa sig vara genomförbart. En metod för massa tak har rapporterats för möss, vilket visar stor potential27. En root Canal Healing modell har verkligen nyligen utvecklats i råttor, en modell djur som ofta används i ENDODONTISK forskning28. Den metod som rapporteras här skulle kunna fungera som ett preliminärt förfarande för att utveckla denna rotkanalen helande modell.
Med hjälp av en in vivo metod är avgörande för studiet av en sådan komplex immunreaktion, och en musmodell, även om kliniskt utmanande på grund av den lilla storleken på djuret, har många fördelar: det är kostnadseffektivt, innebär lättillgängliga anläggningar, och en uppsättning tillgängliga genetiska och molekylära verktyg (såsom tillgängliga knock-outs, CRISPR bibliotek och en mängd genomiska data). Denna modell lämpar sig bäst för ENDODONTISK forskning, eftersom den inducerar den kliniska presentationen av AP i sterila laboratorie tillstånd, med minimala variationer (i motsats till kliniska studier). Dessutom, denna modell har också fördelar inom andra forskningsområden, såsom kronisk inflammation, på grund av förmågan att orsaka en kronisk men lokal inflammation med minimal systemisk inblandning, och användning av kontralaterala sidan av samma djur som en kontroll.
Detta arbete rapporterar användningen av mikro-CT och histologi för analys av lesionen. Potentiellt kan andra typer av analyser användas i denna modell som inte utfördes här, såsom att isolera DNA och testa DNA-metylering på olika gener i de inflammatoriska cellerna. isolera RNA och utföra RNA-SEQ för att se mönstret av genuttryck i olika immunceller eller olika typer av möss; eller isolera celler och karakterisera dem genom FACS20,21,29. Sammantaget finns det en stor potential i den modell som rapporteras här, som förhoppningsvis kommer att underlättas av detta rapporterade protokoll och demonstration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna Dr Oded Heyman för hans hjälp med djur positionering, Raphael Lieber för hjälp med mikro-CT-analys, och prof. andiara de Rossi daldegan för råd om formning experimentet. Vi skulle också vilja erkänna Dr Sidney Cohen för kritisk läsning och redigering.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Dr Izador I. Cabakoff Research donationsfond till MK och IA, och en Yitzhak Navon gemenskap från Israel ministeriet för vetenskap och teknik till exempel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z.
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
