Biology

Fareler içinde Apical periodontitis İndükleme

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59521

Elisheva Goldman^1,2, Eli Reich¹, Itzhak Abramovitz*², Michael Klutstein*¹

¹Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, ²Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center

* These authors contributed equally

Summary

Burada, yerel olarak farelerde apikal periodontitis teşvik etmek için bir protokol sunuyoruz. Biz nasıl fare diş bir delik matkap ve onun hamuru maruz göstermek, amacıyla lokal inflamasyon neden. Mikro-CT ve histoloji gibi bu inflamasyonun doğasını araştırmak için analiz yöntemleri de gösterilmiştir.

Abstract

Yerel kaynaklı inflamasyona katılan mekanizmalar, mevcut birçok hayvan modeli kullanılarak incelenebilir. Bunlardan biri apikal periodontitis indüksiyonu (AP). Apical periodontitis, diş kökünü çevreleyen periodontal dokularda inflamatuar bir doğanın yaygın bir patolojisidir. Bu patolojinin yapısını ve mekanizmasını daha iyi anlamak için farelerde prosedürü gerçekleştirmek avantajlıdır. Bu odontojenik inflamasyonun indüksiyon diş hamuru maruz kadar fare diş içine sondaj ile elde edilir. Sonra, diş hamuru zaman içinde doğal oral Flora tarafından kontamine maruz kalır, apikal periodontitis neden. Bu süre sonra, hayvan feda edilir ve diş ve çene kemiği çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Tipik analizler arasında mikro-CT görüntüleme (kemik reorpsiyonu değerlendirmek), histolojik boyama, immünhistokimya ve RNA ifadesi yer aldı. Bu protokol, oral biyoloji alanında, bu inflamatuar süreci uniform koşullara sahip bir In vivo Deneysel ortamda daha iyi anlamak için araştırma için yararlıdır. Prosedür fareler ve izole çene dikkatli bir şekilde işlenmesi gerekir, ve tekniğin görsel bir gösteri yararlıdır. İndüklenen apikal periodontitis ve bir fare modelinde karakterizasyonu için yol açan prosedürlerin tüm teknik yönleri gösterilmiştir.

Introduction

Bu yöntemin amacı, doğal mikroflora ile Apex kontamine ve daha sonra bu patolojik sürecin çeşitli özelliklerini incelemek için bir fare içinde apikal periodontitis ikna etmektir.

Apical periodontitis (AP), diş kökünü çevreleyen periodontal dokularda inflamatuar bir doğanın yaygın bir patolojisidir. Bu diş hastalığı şiddetli ağrıya neden olabilir ve bir diş hekimi tarafından tedavi edilmelidir. Tedavi seçenekleri arasında kök kanal tedavisi (primer veya ikincil), Endodontik cerrahi, diş çıkarma veya klinik ve radyografik bulgulara bağlı olarak takip ve klinisyen görüşü yer aldı. Bu inflamatuar sürecin mekanizması, birkaç yıl¹^,²^,³için okudu rağmen, hala kapsamlı olarak anlaşılmamıştır. Bu patolojinin şiddetini göz önünde bulundurarak, bu nedenle temel doğasını ele alan araştırma için net bir ihtiyaç vardır. Böylece AP 'nin çalışmasında mümkün olan sistemler büyük bilimsel ilgi görmektedir.

AP, yerel dokulara ve bağışıklık sistemini içeren karmaşık bir patolojik süreçtir, in vitro çalışmalar süreçlerin tam bir anlayış için yetersiz. Bu hastalığın klinik örneklerinin incelenmesi aynı zamanda etik sınırlamalar ve farklı insanlar ve farklı klinik aşamaları arasında önemli değişkenlik nedeniyle sorunlu⁴^,⁵, ve dolayısıyla in vivo modellerin gereksinimi. Bu modeller, diş hamuru kirliliğine maruz ve periapikal dokularda Bu uyarıcı için vücudun inflamatuar reaksiyonu gözlemleme kavramını temel alan⁶^,⁷. Ortak in vivo modelleri kemirgenler veya köpekler gibi büyük hayvanları içerir. Minyatür dişler ile çok küçük hayvanlar olan fareler tedavisinde klinik zorluk rağmen, fare modelinin avantajları önemlidir: pratikte, fareler ile çalışmak teknik tesisler açısından basit ve en uygun maliyetli ve bilimsel olarak, fare, kolayca mevcut genetik ve moleküler araçlar ve iyi okudu genom ile iyi incelenmiştir hayvan modelidir. Nitekim, önceki çalışmalar inflamatuar ve kemik reorpsiyon sinyalleri ve hücreler apikal periodontitis katılan okumak için bir fare modeli kullanılan⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Bu nedenle, AP çalışması için bir fare modelinin nasıl kullanılacağı konusunda net bir protokol gereklidir. Burada, böyle bir protokol tarif ediyoruz.

Burada açıklanan protokol knock-out (Ko) fareler çalışmak için uygun olmanın büyük avantajı vardır ve nasıl belirli bir gen eksikliği diş iltihabı etkiler öğrenmek⁷^,¹². Bu protokolün diğer kullanışlı uygulamaları, apikal periodontitis¹³' ün gelişimi üzerine ilaçların ve sistemik koşulların etkileri, apikal Periodontitin çenelerin osteatrosis gelişimi üzerine etkisi¹⁴ ^, ¹⁵ ve kemik rejenerasyonu için kök hücre terapisi¹⁶.

Bu protokol Ayrıca yerel inflamasyon çalışmak için bir model olarak Genelleştirilmiş olabilir. Enflamatuar süreci incelemek için, örneğin indüklenen kolit veya artrit¹⁷^,¹⁸dahil olmak üzere çeşitli fare modelleri geliştirilmiştir. Bu modellerin sistemik etkileri vardır ve aynı hayvan içinde hiçbir yerleşik kontrol vardır. İnflamasyon olmadan kontralateral kontrol içeren indüklenen apikal periodontitis için modeller, bu sınırlamalar¹⁴^,¹⁹üstesinden avantajı vardır.

Aşağıda açıklanan protokol bu nedenle yerel inflamatuar süreçlerle ilgilenen araştırmacılar için yararlıdır. Bu iltihap kontrollü doğası, belirli bir yere onun hapis, ve kontralateral kontrol diş, tüm bu süreç içinde yer alan mekanizmaları incelemek için bu protokol değerli olun. Ayrıca, protokol periapikal inflamasyonun klinik yönleri ile ilgilenen araştırmacılar için yararlıdır. Fare modeli, hastalığın farklı değişkenlerini incelemek için idealdir, fare modelinde genetik manipülasyonları kolayca gerçekleştirebilmek için, periapikal inflamasyonda spesifik genlerin aktivitesini araştırmak için avantajına ek olarak.

Teknik olarak, klinik prosedür fareler dişlerin küçük boyutları nedeniyle yürütmek için zordur. Konumlandırma, gerekli ekipman ve performans hakkında bilgi edinmek için bu prosedürü görselleştirmek yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Ibranice Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır (etik No. MD-17-15093-5).

1. hayvan anestezi ve konumlandırma

Aşağıda açıklandığı gibi steril çözümler hazırlayın.
1. Hazırlamak 5 mL 7 mg/mL ketamin ve 0,09 mg/mL Medetomidin fosfat tampon solüsyonu seyreltilmiş (PBS)/Saline.
2. PBS/Saline (5 mL 'Lik bir miktar hazırlamak için tavsiye edilir) seyreltilmiş atipamezol (0,4 mg/mL) steril bir çözelti hazırlayın.
3. Hazırlamak mepivacaine steril bir çözüm (7,5 mg/mL) Yerel anestezi için PBS/Saline seyreltilmiş (mepivacaine bir sağlanan şişe 7,2 mL bir stok için yeterlidir).
Deneme için 6-8 hafta eski kadın C57BL/6 fareler kullanın. Hayvanları belirli bir patojen ücretsiz (SPF) hayvan ünitesinde, standart su ve gıda tesisi tarafından sağlanan ve hayvan besleme reklam libitum ile tutun.
Fare tartmak ve intraperitoneal enjekte (IP) ağırlığı her gram için 10 μL bir hacim. Örneğin, 20 gram ağırlığında bir fare için,
200 μL ketamin/Medetomidin çözeltisi enjekte edilir. Bu son konsantrasyon verecektir (70 mg/kg) ketamin ve (0,9 mg/kg) Medetomidine
Her hayvan için.
Prosedür sırasında kuruluk nedeniyle göz ülserasyonu önlemek için, Kloramphenicol (% 5) içeren göz merhem uygulayın Onlar anestezi altında iken hayvanların gözleri üzerinde. Onlar anestezize iken bir lamba ile hayvanları sıcak tutun. Pedal refleks kontrol ederek anestezi derinliğini kontrol edin (firma ayak tutam performans).
Fare anestezi sonra, sağ tarafında (sağ el araştırmacı için) kapalı hücre Ekstrüze Polistiren köpük yüzeyi üzerinde döşeme ve bant kullanarak yüzeye ayak eklemek fare konumlandırın.
Kapalı hücre ekstrüde Polistiren köpük yüzeyine sabitlenmiş uzun iğneler ile yerinde tutulan (üst kesici ve 1 alt kesici için 1) kesici taşları etrafında küçük kauçuk bantları kullanarak ağzını açın.
Yüzeye bantlanmış forseps kullanarak sağ yanağını geri çekin. Sabit durumda kapalı olan forseps kullanın.
Uygun büyütme (bir dürbün mikroskop veya klinik mikroskop) ve ışık kullanarak, mandibular Molars erişim sağlayan rahat bir çalışma konumda fare ile yüzeyi yerleştirin.
Forseps veya diş spatula kullanarak dili geri çekin ve ilk mandibular molar bitişik Mukozit kat içine 27 Gauge iğne ile lokal anestezi enjekte. 25-50 μL yeterlidir. Enjeksiyon yerinde dokuların şişmesi görüntülenmesi gerekir.

2. Selüloz pozlama

Bir 1/4 yuvarlak diş Burr kullanın, ya da aynı boyutta elmas Burr (uzun bir şaft önerilir) dakika başına 800 mermi hızı (rpm), herhangi bir uygun diş motoru bağlı (örneğin bir otomatik tork azaltma (ATR) motor).
İlk sağ mandibular molar oklüzal parçası üzerinde sondaj hamuru boynuzları dentin aracılığıyla görünür kadar. aşırı Isıtma alanı önlemek için motorun kısa patlamaları kullanın.
Bir K-dosya veya H-dosya #8 veya hamuru delmek ve onları kapsayan dentin kırarak Pulp boynuzları (Mesial ve distal) içine dosya eklemek için #10 kullanın. Dosyalar autoclave tarafından sterilize edilir.
Dosyaları ile açıklıkları genişletirken, mümkün olduğunca derin hamuru içinde dosyaları ile çalışmaya devam edin. Genellikle selüloz görünür kanama olacaktır.
Deney sırasında ağrıyı azaltmak için, dişin keskin kenarlarını Burr ile yuvarlamak ve dişini oklüzyondan çıkarmak için emin olun. Bir mikrofırça ile prosedür sırasında temiz enkaz.
Kontralateral diş (sol ilk mandibular molar) bir kontrol olarak bırakın.

3. klinik prosedürün sonu

Fare sabitleme durumundan bırakın ve Atipamezole IP enjekte (her vücut ağırlığı gram için 10 μL. Bu son doz verecektir (4 mg/kg) Atipamezole.
PBS/Saline (0,05 mg/kg) IP (prosedür gününde 3 mL 'Lik bir miktar hazırlamak için tavsiye edilir) seyreltilmiş buprenorfik enjekte. Ağrı kesici neden gerekli olduğunu açıklamak için tartışma konusuna bakın.
Hayvanlar onları ayrılmadan önce anestezi kurtarmak emin olun. Onlar diş ağrısı nedeniyle sert gıda yeme aciz olabilir çünkü onlara yumuşak yiyecek verin.

4. prosedür takip sonrası (42 gün)

Prosedürden sonra ilk 3 gün için, hayvanları tartmak ve Buprenorfik enjekte (0,1 mg/kg) IP günde bir kez (6mL bir miktar hazırlamak için önerilir).
Deneme süresi boyunca (42 gün inflamasyon oluşturur) kilo ve genel davranışsal değerlendirme 2-3 kez bir hafta hayvanları izlemek.
Takip süresi boyunca hayvanlara yumuşak yiyecekler sunun. Suyu su ile ıslak ve kafesin katında bir petri-çanak koydu.

5. deney sonlandırma ve analiz

Zaman 42 gün¹¹ takip tamamlandığında, anestezize hayvanlar IP ile ketamin/xylazine bir konsantrasyonda 106,25 mg/kg ketamin, ve 75 mg/kg xylazine (bir stok çözüm 42,5 mg/ml ketamin, ve 1,5 mg/ml xylazine toplam hacminde 2 ml Önerilen) ve servikal dislocation preform.
Not: inflamasyonu değerlendirmek için olası analizler için farklı seçenekler vardır²⁰^,²¹. Burada mikro-CT ve histolojik boyama ile dokusunun Analizi tarif edilecektir.
Ötenazi sonra, 3 azı da dahil olmak üzere çenenin bir kısmını kesmek için cerrahi makas ve forseps kullanın (ayrı her yan-tedavi ve tedavi olmayan kontrol için). Forseps kullanarak mümkün olduğunca yumuşak doku kadar Peel, çoğunlukla kemik ve diş numunenin üzerinde bırakarak.
Doku PBS kısaca durulayın ve sonra civarında formaldehite koymak (PFA) 4% (PBS seyreltilmiş) için 24-48 saat sabitleme için.
DIKKAT: PFA 'yı kimyasal bir kaput içinde ve malzeme güvenliği veri belgesi (MSDS) yönergelerine göre kullanın.
24-48 saat sonra PFA 'yı yıkamak için PBS 3x ile durulayın.
Mikro-CT
1. Mikro-CT analizi için, hasat edilen dokulara (yaklaşık 4 mm x 5 MMX 1 mm boyutlarında 3 Molars dahil olmak üzere) bir Micro-CT tarayıcısını alın, onları 1,5 ml 'lik PBS odaklı 12 mm çapında bir tüpün içine yerleştirin, böylece bukkal veya dilli yüzeyler Diş ve kök tüpün altına paralel döşenmesi. Sünger ile numune arasında ayrı, ve esnek film ile tüp üst kapak.
2. Tarama panelini açın ve ölçüm numarasını seçin. Aşağıdaki parametrelerle kontrol dosyasını seçin: 70 kV enerji, 114 μA yoğunluğu ve 6 μm³ Voksel boyutu çözünürlüğü.
3. Scout görünümünetıklayın ve görüntü göründüğünde, Referans satırı 'na tıklayın ve numunelerin tarama için alanını işaretleyin. Her örnek sonra Tarama Ekle'yi tıklatın. Örnekleri işaretleme bittiğinde, görev listesine gidin ve etkileşimi Başlat görevleri'ni seçin.
  Not: aynı numune daha sonra Histoloji için kullanılabilir. CT-Scan sırasında kuruması önemlidir.
Mikro-CT hizalama ve analiz için uygun bir bilgisayar programı kullanın.
1. Mikroct değerlendirmesinde XY düzleminde örnek açın. Her örnekteki hizalama için üç nokta seçin:
  Mezial apikal konstriksiyon-koordinat sisteminin kökeni tanımlar.
  Mezial kanalın koronal parçası-Z ekseninde bir nokta tanımlar.
  Distal apikal konstriksiyon-XZ düzleminde bir nokta tanımlar.
2. Sol paneldeki ölçüm aracını kullanın ve her noktaya ulaşan bir çizgi çizin. Her üç noktayı, sağ panelde göründüğü gibi X, Y & Z değerine göre tanımlayın.
3. Μct değerlendirmealtında görev seçerek örnek Ilgi alanı tanımlayın ve 3B değerlendirme'i tıklatın. Bir dikdörtgen ve eksen başına ölçümlendirmelere sahip bir pencere ekranda görünecektir. Dikdörtgenin boyutlarını, farenin orta düğmesiyle köşelere tıklayarak XY eksenindeki ilgi alanına sığacak şekilde eşleştirin. Z ekseninde, VOI Başlat'ın altında yer alan ilk dilim sayısını ve ilk dilimdeki z karesi altında yer alan son dilim sayısına kadar olan dilimler sayısını ekleyerek z ekseni içindeki boyutları seçin.
4. Oturum Yöneticisialtında uygulamalar ' ı tıklatın ve dectermseçin. Bir pencerenin açılması için birkaç saniye bekleyin ve ardından aşağıdaki yönergelere göre aşağıda açıklanan eğimli komut dosyasının beş adımını yazın (satırlar arasında ENTER'a tıklayın):
  ıpl
  isq_to_aim
  aim1
5. ISQ (ilgi dosyası) adını kopyalayın: oturum Yöneticisi altında Görünümler 'ı seçin ve microctdata'yı tıklatın. Üzerinde çalışan dosyayı bulun ve dosyaya orta tıklayın. Sonra orta tıklayın geri DECterm penceresinde.
6. Faiz bölgesini seçerken VOI altında belirlenen X, Y & Z değerlerini (aralarında bir boşluk) girin.
7. İlgi bölgesini seçerken Dim altında belirlenen X, Y & Z değerlerini (aralarında bir boşluk) girin.
8. Bir ileti almaya kadar bekleyin: ISQ tamamlanmış amaç için.
  (adım II-hizalama):
  (z)
  aim1
  aim2
9. Koordinat sisteminin kökeni için belirlenen X, Y & Z değerlerini (aralarında bir boşluk) girin.
10. Z eksenindeki nokta için belirlenen X, Y & Z değerlerini (aralarında bir boşluk) girin.
11. XZ düzleminde nokta için belirlenen X, Y & Z değerlerini (aralarında bir boşluk) girin.
12. Bir mesaj almadan bekleyin: "align_Z tamamlandı"
  (adım III-başlık):
  Üstbilgi
  aim2
  0 0 0
  0 0 0
13. ENTER'a tıklayın.
  (adım IV-yeniden hedef ISQiçin dosya dönüştürme):
  toisq
  aim2
14. ISQ (ilgi dosyası) adını kopyalayın: oturum Yöneticisi altında Görünümler 'ı seçin ve MicroCT verileri'ni tıklatın. Üzerinde çalıştığınız dosyayı bulun ve dosyaya orta tıklayın. Sonra orta tıklayın geri DECterm penceresinde. Sil ("Backspace" kullanarak) ". ISQ "dosyasının sonunda ve yazma:" _new. ISQ "hizalanmış dosyayı tanımak için.
15. ENTER | girin.
16. Bir ileti almadan bekleyin: "toisq_from_aim tamamlandı"
  (adım V-Flip):
  ISQ
  A
17. Yeni ISQ (ilgi dosyası) adını kopyalayın: oturum Yöneticisi altında Görünümler 'i seçin ve MicroCT verileri'ni tıklatın. Üzerinde çalışan dosyayı bulun ve dosyaya orta tıklayın. Sonra orta tıklayın geri DECterm penceresinde.
18. ENTER | girin. Bir ileti almak için bekleyin: "isq_to_aim tamamlandı"
  Flip
  A
  Acar
  Zx
  bir mesaj almak için bekleyin: "flip_aim Completed"
  Kaynak
  Acar
19. Yeni ISQ adını kopyalayın: oturum Yöneticisi altında Görünümler 'i seçin ve MicroCT verileri'ni tıklatın. Üzerinde çalışan dosyayı bulun ve dosyaya orta tıklayın. Sonra orta tıklayın geri DECterm penceresinde. Sil ("Backspace" kullanarak) ". ISQ "dosyasının sonunda ve yazma:" _flip. ISQ "hizalanmış dosyayı tanımak için.
20. Bir ileti almadan bekleyin: "from_aim_to_isq tamamlandı"
Şekillendirme
1. Dişin yaklaşık ortasını temsil eden dilimi seçin, her iki kanalın koronal hamuru, radiküler hamuru ve her iki apikal foramat sunulmaktadır.
2. Sol üst kontur paneline tıklayarak orta dilimdeki ilginin konturunu el ile işaretle-distal kökünün distal noktasından başlayarak, mezial kök ekinin mezial sınırında, radyopak apikal alanına Cor, apikal sınırını işaretleyerek , mezial kökünün distal sınırını ve distal kökünün mezial sınırını furkasyon bölgesi aracılığıyla takiben (bkz. Şekil 3 II, IV).
3. Bu konturu kopyalayın (CTRL + C, CTRL + V) ve orta dilimin her iki tarafında konumlandırılmış 5 dilime göre ayarlayın.
4. Her örnek için işaretlenmiş kontur doku hacmi hesaplamak için görev μct değerlendirmealtında seçin ve 3B değerlendirmetıklayın. 3B değerlendirme penceresinde tıklayın yakın görev seçin ve doku hacmi (TV) hesaplamak için bir filtre seçin.
Histoloji
1. Mikro-CT tarayıcıdan dokuların kaldırılmasından sonra, 1 ml etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 0,5 M pH 8,0 ile bir mikrosantrifüjle tüpte her numuneyi koyarak dokulara kireç koyma 10 gün. EDTA çözümünü her 3 günde bir değiştirin.
2. Dehidrasyon: histolojik kasetleri örnekleri koymak, ve artan etanol konsantrasyonları içine, bir saat her, aşağıdaki gibi: 70% etanol (Bu noktada süreç birkaç hafta boyunca durdurulabilir, sürece örnekleri etanol tutulur), 90% etanol 2x, 100% etanol 2x, ksilen 2x (dikkat: bir kimyasal kaput içinde ksile kullanın, ve onun MSDS yönergelerine göre).
  1. Kasetleri sıvı parafine (60 °C) aktarabilir ve Ksilin Buharlık için bir gecede kimyasal kaput bırakın.
3. Engelleme: numuneleri parafine gömmek için histolojik engelleme makinesini kullanın. Doğru bir konumda onları katıştırmak için dikkatli olun (yani, taç ve kökleri kalıp alt kısmına paralel odaklı olmalıdır, bir şekilde diş "yatıyor") amacıyla sagittal bölümler almak için. Numuneler şimdi bir mikrotome ile kesilmeye hazırdır.
4. Bölümleri kesme: doku ilgili kısmına ulaşıncaya kadar ~ 20 μm kalın dilimleri keserek başlayın. Bir kez diş (taç veya kökleri) herhangi bir kısmını tanıma 6 μm bölümlere değiştirin ve önceki bölüme göre kesme açısını değiştirin.
  1. Örneğin, önceki bölümde taç ancak kökleri dahil, böylece kökleri bıçak daha yakın gelir ve taç geri gider mikrotome bloğunun açısını değiştirmek (diş parçaları blok kendisi üzerinde çıplak bir göz ile tanınabilir).
  2. Koronal ve radiküler Selüloz ve apikal foramen gibi sagittal bölümler elde edene kadar açısını ayarlamaya devam edin. Bu yönde, mümkün olduğunca çok sayıda dilim olarak kesilmiş, ilgili doku tüm kesilir kadar.
5. Boyama protokolleri (örn., hemotoxylin ve Eosin boyama (H & e), kahverengi & Brenn boyama, tartrat dirençli asit fosfataz (tuzak) boyama, immünhistokimya), bkz.²⁰^,²¹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deneysel adımların akış çizelgesi Şekil 1' de sunulmuştur. Protokolde belirtildiği gibi, fareler anestezize edilir, ve bir tarafta ilk mandibular molar hamuru pozlama kadar delinmiş, kontralateral diş bir kontrol olarak bırakılır iken. Ardından, dişler 42 gün boyunca oral Flora tarafından kontamine edilir, bunlar izlenen ve ağrı kesici alır. 42 gün sonra fareler ötenize edilir ve diş ve bitişik çene analizi için alınır.

Şekil 2 ilk sağ molar hamuru maruz sonra fare mandibula klinik görüntüler gösterir. Şekil 2A 'da, Şekil 2B 'deki Ankastre, tedavi edilen ilk sağ molar 'ın genişlemesini gösterirken tüm mandibula gösterilir. Sol ilk molar bir kontrol olarak kullanılır. Şekil 2B'de hem mezial hem distal selüloz boynuzları ve kanallara giriş görülebilir. Ağrıyı azaltmak için dişin mekanik olarak alt-oklüzyona düşürüldüğünü unutmayın.

Diş hamuru ağız florasına maruz kaldıktan sonra, diş hamuru sonunda⁶^,⁷ kontamine ve nekrotik olur. Literatüre göre²², gram negatif bakteri sonra dişin apikal bölgesine lipopolisakkarid (LPS) salgılar. Bağışıklık sisteminin karmaşık bir reaksiyonu sayesinde, sonuçların biri periapikal bölgede kemik reorpsiyonudur, bu da apikal periodontitis²³' ün damgasını taşımaktadır. Bu kemik reorpsiyonu, Micro-CT ile tanımlanabilir ve ölçülebilir. Mikro-CT görüntülerde, radyolit periapikal bölgeler sert kemik dokusunun enflamatuar süreç nedeniyle yumuşak bir periapikal lezyon haline gelen alanları gösterir. Şekil 3' te, temsilci MICRO-CT görüntüleri bir kontrole kıyasla tedavi edilen bir diş gösterir. Şekil 3AIII 'deki ok, mezial Pulp pozlama (distal selüloz pozlama numunenin bu diliminde görünmüyor) ve kemik reorpsiyonunun mezial ve distal periapikal radyolüsent alanları kesikli bir çizgi ile çevrilidir. Burada gösterilen bir kutu çizimi grafiği, kontrollere kıyasla tedavi edilen dişlerde önemli periapikal kemik reorpsiyonunda ölçülebilir.

Mikro-CT lezyonların 3 boyutlu boyutunun değerlendirilmesi için mükemmel bir teknik olmakla beraber, biyolojik bileşimleriyle ilgili bilgi eksiktir. Şekil 4' te sunulan histolojik boyama, bu bilgileri sağlar. H & E boyama, tedavi edilen bir dişe kıyasla kontrol dişinde gösterilmiştir. Tedavi edilen dişlerde (Şekil 4b, C, D), diş hamuru, kontrollü selüloz dokusuna (Şekil 4A) kıyasla H &Amp; E boyama (Şekil 4c) ' de açıkça görülebilecek nekroz sunar. Ayrıca, ve daha da önemlisi, tedavi edilen diş periapikal bölgede bir periapikal lezyonu, bağışıklık hücrelerinden oluşan (dominantly makrofajlar ve lenfositler), görselleştirilen (Şekil 4d) (sağlıklı periodontal bağ (PDL) ile karşılaştırıldığında ve kontrol dişinin periapikal bölgesinde kemik dokusu). Bu periapikal lezyon burada sunulan indüklenen apikal periodontitis tekniğinin istenilen sonucudur.

Öte yandan, Şekil 5 nadir durumlarda meydana gelebilir başarısız bir kontaminasyon sunar (en az% 85 hayvanların MIKRO-CT kemik erimesi göstermek), yani, 42 gün boyunca oral Flora maruz kalan bir diş, henüz hamuru nekroz mevcut değildi ve bu nedenle Micro-CT (Şekil 5A) ve histolojik (Şekil 5B) analizlerinde kemik kaybı ve periapikal lezyonu göstermez.

Şekil 1: deneysel sürecin zaman ekseni. Deneysel prosedürün temporal progresyonunun şematik gösterimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: sağ ilk molar hamuru maruz sonra fare mandibula klinik görüntüler. (A) fare mandibula, ilk sağ molar maruz hamuru ile, ilk sol molar tedavi edilmemiş bir kontrol olarak hizmet vermektedir. (B) sağ molar maruz Selüloz ile genişlemesi. Kanallara giriş görüntülenebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: mikro-CT analizi. (A) temsil edilen Micro-CT taramaları (6μm dilimleri) tedavi edilen ( Aııı, AIV) ve kontrol (AI, All) dişler. Mezial Pulp pozlama ok noktaları (distal selüloz pozlama bu dilim mevcut değildir). Tedavi edilen dişe bitişik kemik kaybı Mesial ve distal periapikal alanları kesikli çizgiler ile çevrilidir. Tüm, AıV-kontur işaretleme temsili görüntüleri. (B) kontrol (turuncu, n = 14 hayvan) tedavi (mavi, n = 15 hayvanlar) örnekleri ile karşılaştırıldığında (her örnek 11 dilim için işaretlenmiş kontur ile ölçülen) doku hacmi (d) kutu-Plot ölçülüyor. Analiz mikro-CT için SCANCO değerlendirme yazılımı kullanılarak yapılmıştır. örnekler, koronal selüloz, kök kanallar ve apikal foramin aynı dilim içinde görselleştirilen bir şekilde odaklı sagittal eksen üzerinde hizalanmıştır (ayrıntılı bilgi için protokol bakın yönlendirme hakkında). Konturlar orta diş alanının her iki tarafında 5 dilim için işaretlenmiş (hepsi birlikte 11 dilim). Her numunenin kontur için doku hacmi yazılım kullanılarak hesaplanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: histolojik H &Amp; E temsili görüntüler: (a) kontrol dişinin histolojik dilimi. (B) tedavi edilen bir dişinin histolojik dilimi, şiddetli periapikal lezyonu sundu. (C) nekrotik dokuların genişlemesi. (D) periapikal Granülom dokusunun genişlemesi P = selüloz, D = dentin, B = kemik, BM = kemik iliği, PDL = periodontal ligament, N = nekrotik selüloz, G = Granülom. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 5: başarısız kontaminasyon örneği: (a) selüloz pozlama (beyaz ok) olan bir dişin Micro-CT temsilcisi görüntüsü, ancak önemli periapikal kemik kaybı, (B) histolojik H & E temsili görüntü ile aynı Diş hayati (nekrotik değil) Selüloz ve normal apikal dokular açığa. P = selüloz, D = dentin, B = kemik, BM = kemik iliği, PDL = periodontal ligament. (C) B. ' de sunulan kalsifiye dokusunun genişlemesi bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Farelerde apikal periodontitis indüksiyonu için burada bir yöntem tanıtıldı. Yöntemin amacı, bu inflamatuar sürecin mekanizmaları ve sonuçlarını incelemek için apikal periodontitis koşulunu yararlanmasıdır. Apical periodontitis 6-8 hafta eski fareler, kökleri tamamen²⁴geliştirilen bir yaş indüklenen oldu. Bu modelde apikal periodontitis neden için, fare mandibular azı diş hamuru bir diş Burr kullanılarak maruz kalır. Fareler (SPF koşullarında) oral floradan bakteriler diş hamuru ve kök kanalları istila, selüloz nekrozu neden, ve apikal doku, apikal inflamasyon tetikleyen LPS salıtarak.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, aşağıdaki kritik adımlara dikkat edin. Hamuru pozlama sırasında hayvanların doğru konumlandırma prosedürün başarısı için önemlidir. Kritik bir adım hamuru uygun pozlama olduğunu. Yetersiz kanal pozlaması, prosedürün başarısızlığa ve AP oluşturamamasına yol açabilecek bir dentin Köprüsü oluşumuna neden olabilir. Selüloz pozlama sırasında, yan etkilere neden olabilecek diğer bölgelerde istenmeyen ağrı ve iltihap önlemek için selüloz maruz kalma sırasında yumuşak doku yaralanmasını en aza indirmek için dikkat gereklidir. Mikro-CT analiz yazılımında numunelerin uygun şekilde hizalanması, yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için önemlidir. Histoloji için çene dokusu hazırlarken, Histoloji için kalıplar hazırlarken doğru oryantasyon elde etmek için kemik çevreleyen yumuşak doku soyulmak için tavsiye edilir. Numuneler tüm süreç boyunca ıslak ortamda tutulmalıdır (hasat aşamasından, mikro-CT üzerinden, histolojik blok işlemine kadar). Bir mikrotome dokusu keserken, numunenin açısı diş sagittal dilimleri elde etmek için sabit olmalıdır. Hayvanların refahı ile ilgili etik sorunları dikkate almak da önemlidir. Örneğin, uygun anestezi prosedür sırasında önemlidir (hem sistemik hem de lokal, bkz.²⁵^,²⁶). Ağrı ilaç, özellikle prosedür aşağıdaki ilk birkaç gün için, esastır ve izleme ağırlığı ve davranış yanı sıra yumuşak gıda ile hayvanların tedariki uygulanması gerekir. Önceki deneyimlerinden, fareler genel reaksiyon iyi prosedür tolere etmektir ve aşırı sıkıntı sergiler yok.

Bir apikal inflamasyonun yapılamaması durumlarında yöntemin bir başarısızlık olduğu düşünülür: mikro-CT taramasında diş periapik bölgesinde kemik reorpsiyonu için hiçbir kanıt yoktur ve dişin PDL dokusu histolojik lekeleme içinde bozulmamış ( Şekil 5' te sunulmuştur). İnflamasyon elde etmek için olası nedenleri de bakterilere her hayvanın spesifik pozlama olarak hayvanların davranışlarında Stokastik farklılıklar içerir. Bu yöntemi kullanarak apikal periodontitis neden iyi sonuçlar elde olsa da (en az% 85 hayvanların kemik reorpsiyon göstermek), örnekleri arasında herhangi bir varyasyon azaltmak için protokol yakından izleyin. Eğer herhangi bir fareler takip döneminde sıkıntı belirtileri gösteriyorsanız, acıyı önlemek için onları denemeden kaldırmayı düşünün. Bunu yapmak için karar takip döneminde hayvanların kilo kaybı veya kazanç bakarak destekli olabilir. Çok kilo kaybetmek hayvanlar acı ve kaldırılması gerekir. Biz de en çok acı hayvanların düşük ağırlıkta ya da kötü sağlık durumunda deney başladı olduğunu gözlemledik. Genel olarak, yordam, doğru gerçekleştirilen, tutarlı sonuçlar vermelidir.

Bu tekniğin çeşitli sınırlamaları belirtilmelidir. Bu modelin, bakteriyel kontaminasyonun neden olduğu apikal periodontitinin incelenmesi için geliştirildiğini ve travmatik yaralanma gibi apikal periodontitinin ortaya çıkabileceği diğer birçok olası mekanizmayı taklit etmediğini dikkate almak önemlidir. otoinflamatuar hastalık. Dahası, bu model ile insan hastalarında klinik durum arasında önemli farklar var. Farelerde, spontan periapikal lezyonlar açıklanmadı ve bu tamamen yapay bir durumdur. Kemirgen dişlerin anatomisi de insanlardan farklıdır; Bu farklılıklar bilinmemektedir önemini. Yine de, fare temel mekanizmaları ve olayları anlamak için son derece yararlı bir modeldir. Dahası, bir fare içinde bir kök kanal şifa modeli (bir kök kanal ile tedavi ederek) şimdiye kadar rapor edilmedi, ancak potansiyel olarak araştırma bu alanda yüksek öneme sahiptir mümkün olduğunu kanıtlamak gerekir. Büyük bir potansiyel²⁷gösteren fareler için bir Pulp kapatma yöntemi bildirilmiştir. Bir kök kanal şifa modeli gerçekten son zamanlarda fareler, bir model hayvan genellikle Endodontik araştırma²⁸kullanılan geliştirilmiştir. Burada bildirilen Yöntem bu kök kanal şifa modeli geliştirmek için bir ön prosedür olarak hizmet verebilir.

Bir in vivo yöntemi kullanarak böyle bir kompleks bağışıklık reaksiyonu çalışması için çok önemlidir, ve bir fare modeli, hayvan küçük boyutu nedeniyle klinik olarak zor olmasına rağmen, birçok avantajı vardır: maliyet etkilidir, kolayca erişilebilir tesisleri içerir, ve bir dizi Mevcut genetik ve moleküler araçlar (gibi mevcut Knock-outs, jımpr kütüphaneler ve genomik veri çok sayıda). Bu model, Endodontik araştırma için en uygun olan, steril laboratuar koşullarında AP klinik sunumu indükler gibi, minimal varyasyonlar ile (klinik çalışmalar aksine). Dahası, bu model de diğer araştırma alanlarında avantajları vardır, kronik inflamasyon gibi, minimal sistemik tutulumu ile kronik ama yerel inflamasyona neden yeteneği nedeniyle, ve bir kontrol olarak aynı hayvanın kontralateral tarafı kullanımı.

Bu çalışma lezyonun analizi için mikro-CT ve histolojinin kullanımını bildiriyor. Potansiyel olarak, DNA 'yı yalıtma ve enflamatuar hücrelerdeki farklı genler üzerinde DNA metilasyonu testi gibi burada yapılmadı bu modelde diğer analizler kullanılabilir; RNA 'nın yalıtılması ve RNA-Seq ' d a k i farklı bağışıklık hücrelerinde veya farklı türde farelerde Gen ifadesinin desenini görmek; veya hücreleri yalıtarak ve onları FACS²⁰^,²¹^,²⁹tarafından karakterize. Toplu olarak, burada, Umarım bu rapor protokol ve gösteri tarafından kolaylaştırılmış olacak bildirilen modelinde büyük bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Acknowledgments

Dr. kanlı Heyman 'a hayvan konumlandırma, Raphael Lieber ile birlikte mikro-CT analizinde yardım için ve Prof. Andiara de Rossi Daldegan 'ın deney öncesi konusunda tavsiyelerde bulunmasını istiyoruz. Biz de kritik okuma ve düzenleme için Dr Sidney Cohen kabul etmek istiyorum.

Bu çalışma, Dr. ızador ı. Cabakoff araştırma Bağış Fonu 'ndan MK ve IA 'ya bir hibe ve Israil bilim ve Teknoloji Bakanlığı 'ndan ÖRNEĞIN Yitzhak Navon bursu ile destekleniyordu.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
blocking machine	Leica	EG1150H
buprenorphine	vetmarket	163451
clinical microscope/binocular	Olympus	Sz61
dental bur	Komet dental	ZR8801L 315 008
dental spatula	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	mercury	1.07961
Eosin Y solution, alcoholic	SIGMA	HT110116
hematoxylin solution, Mayer's	SIGMA	MHS 16
Ketamine hydrochloride	Vetoquinol	CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor)	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3%	Teva	CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators	PARKELL	S379
micro-ct scanner	scanco	uCT 40
parafin	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
Chloramphenicol eye ointment (5%)	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
tweezers	WAM	Ref-CT
xylazine	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
xylene	Gadot	CAS 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).

Biology

Fareler içinde Apical periodontitis İndükleme

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.