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Biology

Inducir la Periodontitis Apical en Ratones

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59521
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para inducir localmente la periodontitis apical en ratones. Mostramos cómo perforar un agujero en el diente del ratón y exponer su pulpa, con el fin de causar inflamación local. También se demuestran métodos de análisis para investigar la naturaleza de esta inflamación, como la microtomografía y la histología.

Abstract

Los mecanismos involucrados en la inflamación inducida local se pueden estudiar utilizando varios modelos animales disponibles. Una de ellas es la inducción de la periodontitis apical (AP). La periodontitis apical es una patología común de naturaleza inflamatoria en los tejidos periodontales que rodean la raíz dental. Para entender mejor la naturaleza y el mecanismo de esta patología es ventajoso realizar el procedimiento en ratones. La inducción de esta inflamación odontogénica se logra perforando en el diente del ratón hasta que la pulpa dental esté expuesta. A continuación, la pulpa dental permanece expuesta a ser contaminada por la flora oral natural con el tiempo, causando periodontitis apical. Después de este período de tiempo, el animal es sacrificado, y el diente y el hueso de la mandíbula se pueden analizar de varias maneras. Los análisis típicos incluyen imágenes de micro-CT (para evaluar la resorción ósea), tinción histológica, inmunohistoquímica y expresión de ARN. Este protocolo es útil para la investigación en el campo de la biología oral para entender mejor este proceso inflamatorio en un entorno experimental in vivo con condiciones uniformes. El procedimiento requiere un manejo cuidadoso de los ratones y la mandíbula aislada, y una demostración visual de la técnica es útil. Se demuestran todos los aspectos técnicos de los procedimientos que conducen a la periodontitis apical inducida y su caracterización en un modelo de ratón.

Introduction

El objetivo de este método es inducir la periodontitis apical en un ratón contaminando el ápice con la microflora natural, y luego estudiar varias características de este proceso patológico.

La periodontitis apical (AP) es una patología común de naturaleza inflamatoria en los tejidos periodontales que rodean la raíz dental. Esta enfermedad dental puede causar dolor intenso y debe ser tratada por un dentista. Las opciones de tratamiento incluyen tratamiento de conducto radicular (primario o secundario), cirugía de endodoncia, extracción dental o seguimiento dependiendo de los hallazgos clínicos y radiográficos, y la opinión del médico. El mecanismo de este proceso inflamatorio, aunque estudiado durante varias décadas1,2,3, todavía no se entiende exhaustivamente. Teniendo en cuenta la gravedad de esta patología, existe, por tanto, una clara necesidad de investigación que aborde su naturaleza fundamental. Por lo tanto, los sistemas donde el estudio de AP es posible son de gran interés científico.

Puesto que la AP es un proceso patológico complejo que involucra los tejidos locales y el sistema inmunológico, los estudios in vitro son insuficientes para una comprensión completa de los procesos. El estudio de muestras clínicas de esta enfermedad también son problemáticos debidoa limitaciones éticas y variabilidad significativa entre diferentes personas y diferentes etapas clínicas 4,5, y por lo tanto la necesidad de modelos in vivo. Estos modelos se basan en el concepto de exponer la pulpa dental a la contaminación y observar la reacción inflamatoria del cuerpo a este estímulo en los tejidos periapicales6,7. Los modelos in vivo comunes incluyen roedores o animales más grandes como perros. A pesar del desafío clínico en el tratamiento de ratones, que son animales muy pequeños con dientes en miniatura, las ventajas del modelo de ratón son significativas: prácticamente, trabajar con ratones es técnicamente simple en términos de instalaciones y es más rentable, y científicamente, el ratón es un modelo animal bien estudiado con herramientas genéticas y moleculares fácilmente disponibles y un genoma bien estudiado. De hecho, estudios previos utilizaron un modelo de ratón para estudiar señales de resorción inflamatorias y óseas y células implicadas en la periodontitis apical8,9,10,11. Por lo tanto, se necesita un protocolo claro sobre cómo utilizar un modelo de ratón para el estudio del AP. Aquí, describimos tal protocolo.

El protocolo descrito aquí tiene la gran ventaja de ser apropiado para estudiar ratones knock-out (KO) y aprender cómo la falta de un gen específico afecta la inflamación dental7,12. Otras aplicaciones útiles de este protocolo incluyen el estudio de los efectos de los medicamentos y las condiciones sistémicas en el desarrollo de la periodontitis apical13,el efecto de la periodontitis apical en el desarrollo de osteonecrosis de las mandíbulas14 , 15 y terapia con células madre para la regeneración ósea16.

Este protocolo también se puede generalizar como un modelo para estudiar la inflamación local. Para estudiar el proceso inflamatorio, se han desarrollado varios modelos de ratón, que incluyen por ejemplo colitis inducida o artritis17,18. Estos modelos tienen efectos sistémicos y no tienen control incorporado en el mismo animal. Los modelos de periodontitis apical inducida, que incluyen un control contralateral sin inflamación, tienen la ventaja de superar estas limitaciones14,19.

El protocolo descrito a continuación es por lo tanto útil para los investigadores que están interesados en los procesos inflamatorios locales. La naturaleza controlada de esta inflamación, su confinamiento a un lugar específico, y el diente de control contralateral, hacen que este protocolo sea valioso para el estudio de los mecanismos involucrados en este proceso. Además, el protocolo es útil para los investigadores interesados en los aspectos clínicos de la inflamación periapical. El modelo de ratón es ideal para estudiar diferentes variables de la enfermedad, además de la ventaja de poder realizar fácilmente manipulaciones genéticas en el modelo de ratón, para investigar la actividad de genes específicos en la inflamación periapical.

Técnicamente, el procedimiento clínico es difícil de llevar a cabo debido a las pequeñas dimensiones de los dientes de los ratones. Será beneficioso visualizar este procedimiento con el fin de aprender sobre el posicionamiento, el equipo necesario y el rendimiento.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Hebrea (Ethics no. MD-17-15093-5).

1. Anestesia animal y posicionamiento

  1. Prepare soluciones estériles como se describe a continuación.
    1. Preparar 5 ml de 7 mg/ml de ketamina y 0,09 mg/ml de medetomidina diluida en solución tampón de fosfato (PBS)/Saline.
    2. Preparar una solución estéril de Atipamezol (0,4 mg/ml) diluida en PBS/Saline (recomendado para preparar una cantidad de 5 ml).
    3. Preparar una solución estéril de Mepivacaína (7,5 mg/ml) diluida en PBS/Saline para anestesia local (un vial suministrado de Mepivacaína es suficiente para un stock de 7,2 ml).
  2. Utilice 6-8 semanas de edad hembra C57BL/6 ratones para el experimento. Mantener a los animales en una unidad animal específica libre de patógenos (SPF), con agua y alimentos estándar proporcionados por la instalación y la alimentación animal ad libitum.
  3. Pesar ratones e inyectar por vía intraperitoneal (IP) un volumen de 10 ml por cada gramo del peso. Por ejemplo, para un ratón que pesa 20 gramos,
    inyectar 200 ml de solución de ketamina/medetomidina. Esto dará una concentración final de (70 mg/kg) de ketamina y (0,9 mg/kg) medetomidina
    para cada animal.
  4. Para prevenir la ulceración ocular debido a la sequedad durante el procedimiento, aplicar pomada para los ojos que contenga cloramphenicol (5%) a los ojos de los animales mientras están bajo anestesia. Mantenga a los animales calientes con una lámpara mientras están anestesiados. Compruebe la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo del pedal (realizando pellizco firme en el dedo del pecho).
  5. Después de anestesiar el ratón, coloque el ratón acostado en su lado derecho (para un investigador diestro) sobre una superficie de espuma de poliestireno extruido de celda cerrada y adhiera los pies a la superficie con cinta adhesiva.
  6. Abra la boca utilizando pequeñas bandas de goma alrededor de los incisivos (1 para los incisivos superiores, y 1 para los incisivos inferiores) sujetados en su lugar por agujas largas ancladas en la superficie de espuma de poliestireno extruido de celda cerrada.
  7. Retraiga la mejilla derecha usando fórceps pegados a la superficie. Utilice fórceps que estén cerrados en estado estable.
  8. Coloque la superficie con el ratón en una posición de trabajo cómoda que permita el acceso a los molares mandibulares, utilizando un aumento adecuado (un microscopio binocular o un microscopio clínico) y la luz.
  9. Retraiga la lengua usando fórceps o espátula dental e inyecte anestesia local con una aguja calibre 27 en el pliegue mucobucal adyacente al primer molar mandibular. 25-50 l es suficiente. Se debe visualizar la hinchazón del tejido alrededor del lugar de inyección.

2. Exposición a la pulpa

  1. Utilice una rebaba dental redonda de 1/4, o una rebaba de diamante del mismo tamaño (se recomienda un vástago largo) a una velocidad de 800 rondas por minuto (rpm), unida a cualquier motor dental adecuado (por ejemplo, un motor de reducción automática de par (ATR)).
  2. Taladre en la parte oclusal del primer molar mandibular derecho hasta que los cuernos de la pulpa sean visibles a través de la dentina. utilizar ráfagas cortas del motor para evitar el sobrecalentamiento del área.
  3. Utilice un archivo K o un archivo H #8 o #10 para perforar la pulpa e insertar el archivo en los cuernos de pulpa (mesial y distal) rompiendo la dentina que los cubre. Los archivos son esterilizados por autoclave.
  4. Continúe trabajando con los archivos dentro de la pulpa lo más profundo posible, mientras amplía las aberturas con los archivos. Por lo general, habrá sangrado visible desde la pulpa.
  5. Asegúrese de redondear los bordes afilados del diente con la rebaba y retire el diente de la oclusión, con el fin de reducir el dolor durante el experimento. Limpie los residuos durante el procedimiento con un microcepillo.
  6. Deje el diente contralateral (primer molar mandibular izquierdo) como control.

3. Fin del procedimiento clínico

  1. Suelte el ratón del estado de fijación e inyecte Atipamezol IP (10 ml por cada gramo de peso corporal. Esto dará una dosis final de (4 mg/kg) de Atipamezol.
  2. Inyectar buprenorfina diluida en PBS/salina (0,05 mg/kg) IP (recomendado para preparar una cantidad de 3 ml el día del procedimiento). Consulte Discusión para obtener una explicación de por qué es necesario aliviar el dolor.
  3. Asegúrese de que los animales se recuperen de la anestesia antes de dejarlos. Dales alimentos blandos porque pueden ser incapaces de comer alimentos duros debido al dolor dental.

4. Seguimiento posterior al procedimiento (42 días)

  1. Durante los primeros 3 días después del procedimiento, pesar los animales e inyectar Buprenorfina (0,1 mg/kg) IP una vez al día (recomendado para preparar una cantidad de 6 ml).
  2. Durante el tiempo del experimento (42 días cuando se acumula inflamación) monitorear a los animales en peso y evaluación general del comportamiento 2-3 veces a la semana.
  3. Entregar alimentos blandos a los animales durante el transcurso del período de seguimiento. Humedezca la comida con agua y colóquela en un plato de petri en el suelo de la jaula.

5. Terminación y análisis del experimento

  1. Cuando se hayan completado 42 días11 de seguimiento, anestetizar animales IP con ketamina/xilazina a una concentración de 106,25 mg/kg de ketamina, y 75 mg/kg de xilazina (una solución en stock de 42,5 mg/ml de ketamina, y 1,5 mg/ml de xilazina en un volumen total de 2 ml es recomendado) y preformar la luxación cervical.
    NOTA: Existen diferentes opciones para posibles análisis con el fin de evaluar la inflamación20,21. Aquí se describirá el análisis del tejido por micro-CT y tinción histológica.
  2. Después de la eutanasia, utilice tijeras quirúrgicas y fórceps para cortar parte de la mandíbula, incluidos los 3 molares (por separado para cada control de lado tratado y no tratado). Mediante el uso de fórceps se desprenden tanto como el tejido blando como sea posible, dejando principalmente hueso y dientes en la muestra.
  3. Enjuague brevemente el tejido en PBS y luego colóquelo en paraformaldehído (PFA) 4% (diluido en PBS) durante 24-48 horas para la fijación.
    ADVERTENCIA: Utilice PFA en una campana química y de acuerdo con sus directrices de la Ficha de datos de seguridad de materiales (MSDS).
  4. Después de 24-48 horas, enjuague con PBS 3x para lavar el PFA.
  5. Micro-CT
    1. Para el análisis de micro-CT, llevar los tejidos cosechados (parte de la mandíbula incluyendo 3 molares, en dimensiones de aproximadamente 4 mm x 5 mmx 1 mm) a un escáner de micro-CT, colocarlos en un tubo de 12 mm de diámetro lleno de 1,5 mL de PBS orientado para que las superficies bucales o linguales del diente y la raíz se encuentran paralelos a la parte inferior del tubo. Separe entre las muestras con esponja y cubra la parte superior del tubo con una película flexible.
    2. Abra el panel de escaneado y elija el número de medida. Elija el archivo de control con los siguientes parámetros: energía de 70 kV, intensidad de 114 oA y resolución de 6 mmde tamaño de voxel.
    3. Haga clic en la vista de exploracióny, cuando aparezca la imagen, haga clic en la línea de referencia y marque el área de las muestras para escanear. Después de cada ejemplo, haga clic en Agregar exploración. Cuando haya terminado de marcar los ejemplos, vaya a la lista de tareas y elija start interact tasks.
      NOTA: Las mismas muestras se pueden utilizar posteriormente para la histología. Es importante que no se sequen durante la tomografía computarizada.
  6. Utilice un programa informático adecuado para la alineación y el análisis de micro-CT.
    1. Abra la muestra en el plano XY en la evaluación de micro-CT. Elija tres puntos en cada muestra para la alineación:
      La constricción apical mesial - define el origen del sistema de coordenadas.
      La parte coronal del canal mesial - define un punto en el eje Z.
      La constricción apical distal - define un punto en el plano XZ.
    2. Utilice la herramienta de medición en el panel izquierdo y dibuje una línea que llegue a cada punto. Defina cada uno de los tres puntos por un valor X, Y y Z, tal como aparece en el panel derecho.
    3. Defina el área de interés en la muestra eligiendo la tarea en Evaluaciónde CT y haga clic en Evaluación 3D. Aparecerá en la pantalla un rectángulo y una ventana con las dimensiones por eje. Haga coincidir las dimensiones del rectángulo para ajustarse al área de interés en el eje XY haciendo clic en las esquinas con el botón central del ratón. Elija las dimensiones en el eje Z insertando el primer número de sector de interés en el cuadrado Z en VoI Start, y el número de sectores desde el primero hasta el último número de sectores de interés en el cuadrado Z bajo Dim.
    4. Haga clic en las aplicaciones en el administrador de sesionesy elija DECterm. Espere unos segundos para que se abra una ventana y, a continuación, escriba los cinco pasos del script de espaciodo que se describen a continuación de acuerdo con las siguientes instrucciones (entre las líneas haga clic en intro):
      Ipl
      isq_to_aim
      aim1
    5. Copiar el nombre isq (archivo de interés): elija vistas en el administrador de sesiones y haga clic en microCTdata. Busque el archivo en el que está trabajando y haga clic en el archivo. A continuación, haga clic en el medio en la ventana del DECterm.
    6. Introduzca los valores X, Y y Z (con un espacio entre ellos) que se determinaron en VOI al elegir la región de interés.
    7. Introduzca los valores X, Y y Z (con un espacio entre ellos) que se determinaron en dim al elegir la región de interés.
    8. Espere hasta recibir un mensaje: isq to aim completed.
      (paso II- alineación):
      alinear z
      aim1
      aim2
    9. Introduzca los valores X, Y y Z (con un espacio entre ellos) que se determinaron para el origen del sistema de coordenadas.
    10. Introduzca los valores X, Y y Z (con un espacio entre ellos) que se determinaron para el punto en el eje z.
    11. Introduzca los valores X, Y y Z (con un espacio entre ellos) que se determinaron para el punto en el plano XZ.
    12. Espere hasta recibir un mensaje: "align_Z completado"
      (paso III- encabezado):
      Rúbrica
      aim2
      0 0 0
      0 0 0
    13. Haga clic en Intro.
      (paso IV- convertir el archivo de nuevo de aim a isq):
      toisq
      aim2
    14. Copiar el nombre isq (archivo de interés): elija vistas en el administrador de sesiones y haga clic en datos microCT. Busque el archivo en el que está trabajando y haga clic en el archivo. A continuación, haga clic en el medio en la ventana del DECterm. Borrar (usando "retroceso") el ". ISQ" al final del archivo y escriba:"_new. ISQ" para reconocer el archivo alineado.
    15. Haga clic en entrar en el botón de entrada de introduzca.
    16. Espere hasta recibir un mensaje: "toisq_from_aim completado"
      (paso V- voltear):
      Isq
      Un
    17. Copie el nuevo nombre isq (archivo de interés): elija views en el administrador de sesiones y haga clic en microCT data. Busque el archivo en el que está trabajando y haga clic en el archivo. A continuación, haga clic en el medio en la ventana del DECterm.
    18. Haga clic en entrar en el botón de entrada de introduzca. Espere a recibir un mensaje: "isq_to_aim completado"
      dar la vuelta
      Un
      aa
      Zx
      esperar a recibir un mensaje: "flip_aim completado"
      De
      aa
    19. Copiar el nuevo nombre isq: elija views en el administrador de sesiones y haga clic en datos microCT. Busque el archivo en el que está trabajando y haga clic en el archivo. A continuación, haga clic en el medio en la ventana del DECterm. Borrar (usando "retroceso") el ". ISQ" al final del archivo, y escriba: "_flip. ISQ" para reconocer el archivo alineado.
    20. Espere hasta recibir un mensaje: "from_aim_to_isq completed"
  7. Contorneado
    1. Elija la rebanada que representa aproximadamente el centro del diente, en el que se presentan la pulpa coronal, la pulpa radicular de ambos canales y ambos foramens apicales.
    2. Marcar manualmente el contorno de interés en la rebanada central haciendo clic en el panel de contorno superior izquierdo- comenzando desde el punto distal del ápice de la raíz distal marcar el borde apical coronalmente a la zona apical radiopaca, a través del borde mesial del ápice de la raíz mesial siguiendo el borde distal de la raíz mesial y el borde mesial de la raíz distal a través de la región de furcación (véase la Figura 3 II,IV).
    3. Copie este contorno (Ctrl+C, Ctrl+V) y ajústelo en consecuencia a 5 sectores situados a cada lado del sector central.
    4. Para calcular el volumen tisular del contorno marcado para cada muestra, elija la tarea en Evaluaciónde CT y haga clic en Evaluación 3D. En la ventana de evaluación 3D haga clic en seleccionar tarea cercana y elija un filtro para calcular el volumen de tejido (TV).
  8. Histología
    1. Después de la extracción de los tejidos del escáner de micro-CT, descalcifice los tejidos colocando cada muestra en un tubo de microcentrífuga con 1 ml de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) 0,5 M pH 8,0 durante 10 días. Cambie la solución EDTA cada 3 días.
    2. Deshidratación: Poner muestras en casetes histológicos, y en el aumento de las concentraciones de etanol, una hora cada uno, de la siguiente manera: 70% etanol (en este punto el proceso se puede detener durante varias semanas, siempre y cuando las muestras se mantengan en etanol), 90% etanol 2x, 100% etanol 2x, xileno 2x (precaución: utilizar xileno en una campana química, y de acuerdo con sus directrices MSDS).
      1. Transfiera los cassettes a la parafina líquida (60 oC) y deje en la campana química durante la noche para que el xileno se evapore.
    3. Bloqueo: Utilice una máquina de bloqueo histológico para incrustar las muestras en parafina. Tenga cuidado de incrustarlos en una posición correcta (es decir, la corona y las raíces deben orientarse paralelamente a la parte inferior del molde, de manera que el diente esté "acostado") con el fin de obtener secciones sagitales. Las muestras ya están listas para ser cortadas con un microtome.
    4. Cortar las secciones: Comience cortando rodajas gruesas de 20 m hasta llegar a la parte relevante del tejido. Una vez que el reconocimiento de cualquier parte del diente (corona o raíces) cambiar a secciones de 6 m, y cambiar el ángulo de corte de acuerdo con la sección anterior.
      1. Por ejemplo, si la sección anterior incluía la corona pero no las raíces, cambie el ángulo del bloque en el microtome para que las raíces se acerquen al cuchillo, y la corona retroceda (las partes del diente se pueden reconocer a simple vista en el bloque en sí).
      2. Continúe ajustando el ángulo hasta obtener secciones sagitales incluyendo pulpa coronal y radicular, y el foramen apical. Corte en esta orientación tantas rodajas como sea posible, hasta que se corte el tejido relevante.
    5. Para los protocolos de tinción (p. ej., tinción de Haemotoxylin y Eosina (H&E), tinción de Brown & Brenn, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP), inmunohistoquímica), véase20,21.

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Representative Results

En la Figura 1se presenta un diagrama de flujo de los pasos experimentales. Como se menciona en el protocolo, los ratones son anestesiados, y su primer molar mandibular en un lado se perfora hasta la exposición de la pulpa, mientras que el diente contralateral se deja como un control. A continuación, los dientes se dejan contaminar por la flora oral durante 42 días, durante los cuales son monitoreados y reciben analgésicos. Después de 42 días, los ratones son eutanasiados, y los dientes y la mandíbula adyacente se toman para su análisis.

La Figura 2 muestra imágenes clínicas de la mandíbula del ratón después de la primera exposición a la pulpa molar derecha. En la Figura 2A se muestra toda la mandíbula, mientras que el recuadro en la Figura 2B muestra una ampliación del primer molar derecho tratado. El primer molar izquierdo se utiliza como control. La exposición de los cuernos de pulpa mesial y distal y la entrada a los canales se puede ver en la Figura 2B. Tenga en cuenta que el diente se bajó mecánicamente a la sub-oclusión con el fin de reducir el dolor.

Después de la exposición a la pulpa dental a la flora oral, la pulpa dental se contamina finalmente6,7 y se vuelve necrótica. Según la literatura22, Bacterias gram negativas luego secretan lipopolisacárido (LPS) a la región apical del diente. A través de una reacción compleja del sistema inmunológico, uno de los resultados es la resorción ósea en la región periapical, que es el sello distintivo de la periodontitis apical23. Esta resorción ósea puede ser identificada y cuantificada por micro-CT. En las imágenes de micro-CT, las regiones periapicales radiolúcidas indican áreas donde el tejido óseo duro se convirtió en una lesión periapical suave debido al proceso inflamatorio. En la Figura3, las imágenes representativas de micro-CT muestran un diente tratado en comparación con un control. La flecha de la Figura 3AIII apunta a la exposición de la pulpa mesial (la exposición a la pulpa distal no aparece en esta parte de la muestra), y las áreas radiolúcidas mesiales y perigeográficas mesiales de resorción ósea están rodeadas por una línea discontinua. Un gráfico de diagrama de caja que se muestra aquí cuantifica la significativa resorción ósea periapical en los dientes tratados en comparación con los controles.

Si bien la micro-TC es una excelente técnica para la evaluación del tamaño tridimensional de las lesiones, carece de información sobre su composición biológica. La tinción histológica, tal como se presenta en la Figura 4, proporciona esta información. La tinción de H&E se demuestra en un diente de control en comparación con un diente tratado. En el diente tratado (Figura4B, C,D), la propia pulpa dental presenta necrosis que se puede ver claramente en la tinción de H&E (Figura4C),en comparación con el tejido de pulpa organizado de control (Figura4A). Además, y lo que es más importante, en la región periapical del diente tratado se visualiza una lesión periapical, compuesta de células inmunitarias (dominantemente macrófagos y linfocitos), (Figura4D)(en comparación con el ligamento periodontal sano (PDL) y hueso en la región periapical del diente de control). Esta lesión periapical es el resultado deseado de la técnica de periodontitis apical inducida que se presenta aquí.

Por otro lado, la Figura 5 presenta una contaminación infructuosa que puede ocurrir en casos raros (al menos el 85% de los animales muestran resorción ósea en la micro-TC), es decir, un diente que estuvo expuesto a la flora oral durante 42 días, pero que no presentó necrosis pulpar , y por lo tanto no demostró pérdida ósea y lesión periapical en los análisis micro-CT (Figura5A)y histológico (Figura5B).

Figure 1
Figura 1: Eje temporal del proceso experimental. Representación esquemática de la progresión temporal del procedimiento experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes clínicas de la mandíbula del ratón después de la primera exposición correcta a la pulpa molar. (A) Mandíbula del ratón, primer molar derecho con pulpa expuesta, primer molar izquierdo sirve como un control sin tratar. (B) Ampliación del molar derecho con la pulpa expuesta. La entrada a los canales se puede visualizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de Micro-CT. (A) Exploraciones representativas de micro-CT (rebanadas de 6 m) de dientes tratados (AIII, AIV) y de control (AI, AII). La flecha apunta a la exposición de la pulpa mesial (la exposición distal de la pulpa no está presente en esta rebanada). Las áreas periapicales mesiales y distales de pérdida ósea adyacentes al diente tratado están rodeadas de líneas discontinuas. AII, AIV- Imágenes representativas del marcado de contorno. (B) Diagrama de caja que cuantifica el volumen de tejido (medido por el contorno marcado para 11 rodajas de cada muestra) del control (naranja, no 14 animales) en comparación con las muestras tratadas (azul, no 15 animales). El análisis se realizó utilizando el software de evaluación Scanco para micro-CT. Las muestras se alinearon en el eje sagital orientado de manera que la pulpa coronal, los conductos radiculares y el foramen apical se visualizaran en el mismo sector (ver protocolo para obtener información detallada orientación). Los contornos se marcaron para 5 rodajas a cada lado del área del diente medio (todos juntos 11 rebanadas). El volumen de tejido para el contorno de cada muestra se calculó utilizando el software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas histológicas de H&E: (A) rebanada histológica de un diente de control. (B) Rebanada histológica de un diente tratado, con una lesión periapical grave presentada. (C) agrandamiento del tejido necrótico. (D) agrandamiento del tejido de granuloma periapical P-pulp, D-dentina, B-hueso, BM-médula ósea, ligamento PDL-periodontal, Pulpa n-necrótica, G- granuloma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ejemplo de contaminación infructuosa: (A) imagen representativa de micro-CT de un diente con exposición a la pulpa (flecha blanca), pero ninguna pérdida significativa de hueso periapical, correlacionada con (B) imagen representativa histológica de H&E de la misma imagen diente que revela pulpa vital (no necrótica), y los tejidos apicales normales. P-pulp, D-dentina, B-hueso, BM-médula ósea, ligamento PDL-periodontal. (C) Ampliación del tejido calcificado presentado en B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí se introduce un método para la inducción de la periodontitis apical en ratones. El objetivo del método es explotar la condición de periodontitis apical para el estudio de los mecanismos y consecuencias de este proceso inflamatorio. La periodontitis apical fue inducida en ratones de 6-8 semanas de edad, una edad en la que las raíces están completamente desarrolladas24. Con el fin de causar periodontitis apical en este modelo, la pulpa dental de los molares mandibulares del ratón se expone utilizando una rebaba dental. Las bacterias de la flora oral de los ratones (en condiciones de SPF) invaden la pulpa y los conductos radiculares de los dientes, causando necrosis pulpar, y secretando LPS a los tejidos apicales, lo que desencadena la inflamación apical.

Al llevar a cabo este procedimiento, preste atención a estos siguientes pasos críticos. El posicionamiento correcto de los animales durante la exposición de la pulpa es fundamental para el éxito del procedimiento. Un paso crítico es la exposición adecuada de la pulpa. La exposición insuficiente del canal puede dar lugar a una formación del puente Dentina, que puede conducir al fracaso del procedimiento y a la incapacidad de crear el AP. Durante la exposición a la pulpa, se requiere atención para minimizar la lesión de los tejidos blandos durante la exposición a la pulpa para evitar el dolor no deseado y la inflamación en otras regiones que pueden causar efectos secundarios. La alineación adecuada de las muestras en el software de análisis de micro-CT es fundamental para obtener resultados interpretables. Al preparar el tejido de la mandíbula para la histología, se recomienda despegar el tejido blando que rodea el hueso para lograr una orientación correcta al preparar moldes para la histología. Las muestras deben mantenerse en medio húmedo durante todo el proceso (desde la fase de cosecha, pasando por la micro-CT, hasta el procedimiento de bloqueo histológico). Al cortar el tejido en un microtome, el ángulo de la muestra debe fijarse con el fin de lograr rodajas sagitales del diente. También es importante tener en cuenta cuestiones éticas relativas al bienestar de los animales. Por ejemplo, la anestesia adecuada es crítica durante el procedimiento (tanto sistémica como local, ver25,26). Los medicamentos para el dolor son esenciales, especialmente durante los primeros días después del procedimiento, y se debe implementar el control del peso y el comportamiento, así como el suministro de alimentos blandos a los animales. Por experiencia previa, la reacción general de los ratones es tolerar bien el procedimiento y no presentan angustia extrema.

Un fallo del método se considera en los casos en que una inflamación apical no se formó: no hay evidencia de resorción ósea en la región periapical del diente en la exploración micro-CT, y el tejido PDL del diente está intacto en la tinción histológica (como presentado en la Figura 5). Las posibles razones para no lograr la inflamación incluyen diferencias estocásticas en el comportamiento de los animales, así como la exposición específica de cada animal a las bacterias. Aunque se logran buenos resultados en la causa de la periodontitis apical mediante el uso de este método (al menos el 85% de los animales muestran resorción ósea), siga el protocolo de cerca para reducir cualquier variación entre las muestras. Si algún ratones muestra signos de angustia durante el período de seguimiento, considere la posibilidad de retirarlos del experimento para evitar el sufrimiento. La decisión de hacerlo puede ser ayudada examinando la pérdida o ganancia de peso de los animales durante el período de seguimiento. Los animales que pierden mucho peso sufren y deben ser retirados. También hemos observado que los animales que más sufren son los que iniciaron el experimento con un peso bajo o mala condición de salud. En general, el procedimiento, si se realiza correctamente, debe producir resultados consistentes.

Hay que tener en cuenta varias limitaciones de esta técnica. Es importante señalar que este modelo fue desarrollado con el fin de estudiar la periodontitis apical causada por la contaminación bacteriana y no imita varios otros mecanismos posibles por los cuales puede surgir periodontitis apical, como lesiones traumáticas y enfermedad autoinflamatoria. Además, existen diferencias significativas entre este modelo y la situación clínica en pacientes humanos. En ratones, no se han descrito lesiones periapicales espontáneas y esto es totalmente una situación artificial. La anatomía de los dientes de roedores también difiere de la de los seres humanos; la importancia de que estas diferencias sean desconocidas. Sin embargo, el ratón es un modelo extremadamente útil para entender los mecanismos básicos y los fenómenos. Por otra parte, un modelo de curación de conducto radicular en un ratón (mediante el tratamiento con un conducto radicular) no se ha divulgado hasta ahora, pero potencialmente tiene alta importancia en este campo de investigación en caso de que resulte ser factible. Se ha notificado un método de tapado de pulpa para ratones, que muestra un gran potencialde 27. Un modelo de curación de conducto radicular de hecho se ha desarrollado recientemente en ratas, un animal modelo a menudo utilizado en la investigación endodóntica28. El método reportado aquí podría servir como un procedimiento preliminar para el desarrollo de este modelo de curación de conducto radicular.

El uso de un método in vivo es crucial para el estudio de una reacción inmune tan compleja, y un modelo de ratón, aunque clínicamente desafiante debido al pequeño tamaño del animal, tiene muchas ventajas: es rentable, implica instalaciones de fácil acceso, y un conjunto de herramientas genéticas y moleculares disponibles (como eliminatorias disponibles, bibliotecas CRISPR y una multitud de datos genómicos). Este modelo es más adecuado para la investigación endodóntica, ya que induce la presentación clínica de AP en condiciones de laboratorio estériles, con variaciones mínimas (a diferencia de los estudios clínicos). Además, este modelo también tiene ventajas en otros campos de investigación, como la inflamación crónica, debido a la capacidad de causar una inflamación crónica pero local con una mínima afectación sistémica, y el uso del lado contralateral del mismo animal como control.

Este trabajo informa del uso de micro-CT e histología para el análisis de la lesión. Potencialmente, otros tipos de análisis se pueden utilizar en este modelo que no se realizaron aquí, como aislar el ADN y probar la metilación del ADN en diferentes genes en las células inflamatorias; aislar el ARN y realizar ARN-seq para ver el patrón de expresión génica en diferentes células inmunitarias o diferentes tipos de ratones; o aislar las células y caracterizarlas por FACS20,21,29. Colectivamente, hay un gran potencial en el modelo reportado aquí, que con suerte será facilitado por este protocolo y demostración informados.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer al Dr. Oded Heyman por su ayuda con el posicionamiento animal, A Rafael Lieber por su ayuda con el análisis de micro-CT, y la Prof. Andiara De Rossi Daldegan por su consejo sobre la preformación del experimento. También nos gustaría reconocer al Dr. Sidney Cohen por su lectura y edición críticas.

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund a MK e IA, y una beca Yitzhak Navon del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel a EG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Eurovet Animal Health CAS 104075-48-1
ATR dentsply tecnika
blocking machine Leica EG1150H
buprenorphine vetmarket 163451
clinical microscope/binocular Olympus Sz61
dental bur Komet dental ZR8801L 315 008
dental spatula Premier 1003737
EDTA J.T Baker 8993
entelan mercury 1.07961
Eosin Y solution, alcoholic SIGMA HT110116
hematoxylin solution, Mayer's SIGMA MHS 16
Ketamine hydrochloride Vetoquinol CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor) CP-pharma GmbH CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3% Teva CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators PARKELL S379
micro-ct scanner scanco uCT 40
parafin Leica 39602004
PBS SIGMA D8537
PFA EMS 15710
Chloramphenicol eye ointment (5%) Rekah pharmaceutical CAS 56-75-7
tweezers WAM Ref-CT
xylazine Eurovet Animal Health CAS 7361-61-7
xylene Gadot CAS 1330-20-7

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Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing Apical Periodontitis in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59521, doi:10.3791/59521 (2019).

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