Summary
ここでは、蛍光イメージングによる血管系、核、免疫細胞、ニューロン、脂質・液滴被覆タンパク質を可視化するマーカーを組み合わせて、マウスとヒトの両方の白色脂肪組織の3D構造を解決するための簡単で安価で迅速なクリアリング方法について述べています。
Abstract
肥満は、心血管疾患、2型糖尿病、および肝臓疾患を発症するリスクを高める世界的な公衆衛生上の主要な問題です。肥満は脂肪細胞肥大や肥大による脂肪組織(AT)質量の増加を特徴とし、その三次元構造の深い改造につながる。確かに、肥満の間に拡大するATの最大容量は肥満関連病理の開発にとって極めて重要である。このAT拡張は、過剰なエネルギー摂取量への適応を可能にし、筋肉や肝臓などの他の代謝器官への有害な脂質の波及を避けるために重要な恒食機構です。従って、AT拡張の失敗につながる構造改造を理解することは、臨床的適用性の高い根本的な問題である。本稿では、蛍光イメージングによるマウスとヒト白脂肪組織の形態を探求するために当研究室で日常的に使用されている、シンプルで高速なクリアリング方法について説明します。この最適化されたATクリアリング方法は、化学フード、温度制御軌道シェーカー、蛍光顕微鏡を備えた標準的な実験室で簡単に行われます。また、使用する化学化合物は容易に入手可能である。重要なことに、この方法は、様々なマーカーを染色することによって3D AT構造を解決し、アディポ細胞、神経および血管ネットワーク、および先天的および適応的な免疫細胞分布を特異的に視覚化することを可能にする。
Introduction
肥満は脂肪組織量の増加を特徴とし、肥満の人々が心血管疾患、2型糖尿病、肝臓病およびいくつかの癌を発症するリスクを高めていることを考えると、世界的に主要な公衆衛生問題となっている。
脂肪組織の基本的な生理学的機能は、全身グルコースおよび脂質恒常性11,22を調節することである。この摂食期間中、脂肪細胞(すなわち脂肪組織の主細胞)は、食事によって提供される過剰のグルコースおよび脂質をトリグリセリドに保存する。断食の間、脂肪細胞はトリグリセリドを非エステル化脂肪酸とグリセロールに分解して体のエネルギー需要を維持します。肥満の発症の間、脂肪組織は脂肪細胞のサイズ(肥大症)および/または数(過形成)を増加させることによって拡大し、その貯蔵能力を高める。脂肪組織の拡張がその限界に達すると、患者の間で一定の高い可変性、残りの脂質は筋肉および肝臓3、44を3含む他の代謝器官に蓄積し、その機能障害および肥満関連の心代謝合併症を発症する1,1、5。したがって、脂肪組織の拡張を支配するメカニズムを特定することは、臨床的な課題です。
肥満の間に脂肪組織内で文書化された形態学的修飾は、その病理学的機能不全に関連している。いくつかの染色手順は、アクチン6、血管マーカー7、脂質滴マーカー8、および特異的免疫細胞マーカー9、1010を含む脂肪組織の組織組織を記述するために使用されてきた。9しかし、アディポサイトの直径が大きい(50~200μm)11の11場合、肥満時に観測された劇的な構造AT変化を正確に分析するためには、組織全体の大部分を3次元で分析することが不可欠です。しかし、光が不透明な組織に浸透しないため、蛍光顕微鏡を用いた大組織試料内での3Dでのイメージングは不可能である。透明にする組織のクリアの方法は、文献で報告されています (レビューのために、12を参照してください ) 1 つの組織をクリアし、組織全体の顕微鏡を実施することができます。これらの方法は、健康で病気の組織における3D細胞組織を評価する前例のない機会を提供します。記載された各方法には利点と欠点があり、したがって、研究された組織に応じて慎重に選択する必要があります(レビューのために、13を参照)。実際、いくつかのアプローチは、高価な、有毒であるか、,,,または14、15、16、17、18、19を得14,15,ることが困難である材料または化合物の使用を長い潜伏期間および/または使用する必要があります。16171819ヴェルナー・スポルテホルツが1世紀前に使用した最初の化合物の1つを利用して組織20をクリアし、化学フード、温度制御軌道シェーカー、共焦点顕微鏡を含む標準的な機器を備えた実験室ですべてのマウスおよびヒト脂肪組織貯蔵庫のクリアに非常によく適応したユーザーフレンドリーで安価なプロトコルを設定しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルはテストされ、すべてのマウスおよびヒト白色脂肪組織の貯蔵所について検証される。ヒトおよびマウス脂肪組織は、それに応じて欧州の法律に従って収集され、フランスとスウェーデンの倫理委員会によって承認されました。
1. マウスとヒト白色脂肪組織の固定
- 収穫したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む少なくとも10mLのPBSに15mLのプラスチックチューブに浸漬する。
- ローリングプレートの室温でプラスチックチューブを1時間振ります。
- プラスチックチューブをローリングプレートの上に4°Cで一晩放置し、固定を完了します。
注:このプロトコルは、通常の食事を与えられたマウスから得られた全身上端体脂肪パッド(≈250mg - ≈0.6 cm3)などの大規模な脂肪組織サンプルに適合しています。高脂肪食(≈1.5g - ≈4 cm3)またはヒト脂肪組織サンプルを与えられたマウスから得られた上端体脂肪パッドのようなより大きなサンプルについては、クリアプロトコルは完全に(PFAと抗体混合物をスケールアップすることによって)サンプル全体に対して完全に機能するはずですが、一般的に、残りのサンプルを1g(≈2.5cm3)の周りに切断して、追加の染色またはアプリケーションのために残りのサンプルを予約します。PFA(ステップ1.1.)の場合、組織の体積の約10倍を使用することをお勧めします。抗体混合物(ステップ3.1.および3.4.)の場合、組織を完全に浸漬するために体積を増やし、組織が1.5 mLプラスチックマイクロチューブに対して大きすぎる場合は15mLプラスチックチューブ( 材料表を参照)を使用します( 材料表を参照)。
2. マウスとヒト白色脂肪組織の透過と飽和
- 固定白色脂肪組織をPBSの10 mLで室温で5分間リンスし、PFAの痕跡をすべて除去します。
- 0.3%のグリシン( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、残りの遊離アルデヒド基を1分あたり100回転(rpm)で軌道シェーカーで室温で1時間振り、残りの遊離アルデヒド基を急いで残します。
- 0.2%トリトンX-100( 材料表を参照)を補ったPBS10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、100rpmで2時間の温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを振ります。
- 0.2%トリトンX-100と20%DMSO( 材料表を参照)を補ったPBSの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、一晩100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを振ります。
- 0.1%のTween-20( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、0.1%トリトンX-100、0.1%デオキシコール酸( 材料表を参照)、20%DMSOで37°Cの温度制御軌道シェーカーでチューブを少なくとも240rpmで振る。
- 0.2%トリトンX-100を補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100 rpmで軌道シェーカーで室温でチューブを1時間振ります。
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSA( 材料表を参照)を補ったPBSの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、12時間100rpmの温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを12時間、非特異的に結合する可能性のある任意の部位を飽和させる。
注:ステップ2.7において、BSAは、使用される二次抗体の種の血清によって置換することができる。
3. マウスとヒト白色脂肪組織の染色手順
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAおよび一次抗体を補った300μLのPBSを含む1.5mLプラスチックマイクロチューブ内の組織を移管する(凍結染色よりも10倍多く濃縮されたが、抗体ごとに最適な抗体濃度を評価する必要があります)。アルミニウム箔で覆い、温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを少なくとも2日間100rpmで振って、光からチューブを保護します(ステップ1.1とステップ3.7.1のノートを参照)。
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAを補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、温度制御された軌道シェーカーで37°Cで光から保護されたチューブを100 rpmで5時間振る。この手順を 2 回実行します。
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAを補うPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで100rpmで37°Cで1泊から2日間、光から保護されたチューブを振ります。
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAおよび二次抗体(凍結染色よりも10倍濃縮)を補ったPBSの300 μLを含む1.5 mLプラスチックマイクロチューブに組織を移す。アルミニウム箔で覆い、温度制御軌道シェーカーで37°Cでチューブを少なくとも2日間100rpmで振って、光からチューブを保護します(ステップ1.1とステップ3.7.1のノートを参照)。
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、および3%BSAを補ったPBSの10 mLを含む15mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cで光から保護し、5時間で37°Cでチューブを振ります。この手順を 2 回実行します。
- 0.2%トリトンX-100、10%DMSO、および3%BSAを補ったPBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで100rpmで37°Cで光から保護されたチューブを1泊から2日間振ります。
- PBSの10 mLを含む15 mLプラスチックチューブで組織をリンスし、100rpmで温度制御軌道シェーカーで37°Cで2時間、光から保護されたチューブを振ります。
注:核やアクチンなどの特定の構造の標識については、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPIまたは同等物)および/または蛍光標識ファロイジンをステップ3.1に追加する必要があります。蛍光標識された一次抗体のみが使用される場合、またはステップ3.4で使用する。二次抗体が使用される場合。
注:染色手順では、既にフルオロクロムと結合した一次抗体(フローサイトメトリーに使用されるものなど)を使用することができ、時間と特異性を得るためにお勧めします。実際、マウス一次抗体を使用し、その後に二次抗マウス抗体を使用できたとしても、ここで実証したように、循環免疫グロブリンによる血管の非特異的染色を観察することが多い。したがって、この問題を回避するために、既に標識されている一次抗体が強く推奨され、ここではフローサイトメトリーで使用される抗体が我々の手順と互換性があることを示す証拠を提供します。しかし、低レベルで発現される抗原の特定の場合には、二次抗体を介したシグナル増幅ステップが必須である。唯一の利用可能な一次抗体がマウスで作られると、犠牲で少なくとも5分間PBSを有するマウスの心臓灌流は、循環免疫グロブリンの大部分を除去することができ、したがって非特異的染色を行うことができる。
4. マウスとヒト白色脂肪組織のクリア手順
- 50%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
- 70%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
- 95%エタノールの10 mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
- 100%エタノールの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、2時間100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
- 100%エタノールの10mLを含む15mLプラスチックチューブに組織を浸し、一晩100rpmで軌道シェーカーで、光から保護されたチューブを振ります。
- 5 mLのメチルサリチル酸を含むプラスチックキャップ( 材料表を参照)を化学フードの下に20 mLガラス瓶に浸し、光から保護されたガラス容器を100rpmの軌道シェーカーで室温で少なくとも2時間振ります。
注: 手順 4.3 を回避することで、クリア処理手順を(必要に応じて)大幅に高速化できます。4.5.と、最終的なクリア品質はわずかに低下しますが。
クリアホワイト脂肪組織の5.3D共焦点イメージング
- 化学フードの下にガラス底( 材料表を参照)を装備した金属画像チャンバーに組織を移し、新鮮なメチルサリチル酸でチャンバーを満たします。
注:所定の位置に組織を固定し、したがって、チャンバー内に浮いたり、横に動かないようにするために、チャンバーに取り付けるときに、複数の18ミリメートルの丸いガラスカバーリップ( 材料表を参照)を適用します。 - 反転した共焦点顕微鏡の上に撮像チャンバーを置きます。
- 低倍率の目的(例えば、4倍の目的)を用いて組織を画像化し、脂肪組織全体またはヒト組織サンプルの数cm33D マップを生成する。
- 高い倍率で組織サンプリング用の領域を複数選択します。通常、解像度と深さの間に良好な比率を提供する 20 倍の長距離エアの目的を使用します。深さ600~2000μmのzスタックを持つ大型モザイク画像を取得します。
注: 遠距離の目的を使用して、組織の奥深くに画像を表示します。
3D脂肪組織画像からの定量的結果の抽出
注:異なる構造のセグメンテーションと、ポイント5で生成された3D画像スタックからの定量的情報の抽出は、市販またはフリーウェアのいずれかの既存の画像解析ソフトウェアオプションのいずれかを使用して実行できます。以下の点では、当社の研究室で、商用ソフトウェアを用いて3D脂肪組織画像から定量的情報を抽出するために日常的に使用されている戦略を説明します( 材料表を参照)。
- 3D スタックをソフトウェア形式に変換して、メモリ空間を解放します。
- セルをセグメント化します。
- ソフトウェアの Cell モジュールを開きます。
- 細胞検出の設定を、プラズマ膜染色に変更します。
- 細胞周辺(マクロファージのF4/80、T細胞のTCR-β、または免疫細胞サブタイプに特異的な分化CDタンパク質のクラスターのような皮質アクチンまたは血漿膜マーカーを標識するファロイジン)を線引するのに使用されるマーカーの蛍光チャネルを選択します。
- しきい値を設定し、予想されるセルサイズの範囲を提供します(すなわち、セル検出のための1〜200 μm)。
- セグメンテーションを実行します。z スタックに対応するボリュームは、隣接するセルごとに異なる色で色分けされたセグメント化されたセルで生成されます。
- 統計タブに統計フィルター(サイズ、丸み、円形など)を適用して、セグメンテーションアーティファクトを除外したり、セグメント化された細胞をそのサイズに基づいて対象細胞に絞り込んだりします(例えば、有数葉細胞の場合は20〜200μm、マクロファージの場合は5〜25μm、リンパ球の場合は1〜3μm)。
- 統計タブから測定値と定量データ(体積、数、サイズ、直径など)を抽出します。
- 細胞成分(核、小胞など)または血管を構造としてセグメント化します。
注:フィラメントのセグメンテーションは、船舶の接続性を調べるのに非常に便利ですが、表面モジュールのセグメンテーションを使用して、血管のサイズ、体積、直径に関するデータを抽出します。実際、フィラメントモジュールを使用すると、血管のサイズの定量化が失われます。- ソフトウェアの サーフェス モジュールを開きます。
- 細胞下の成分を3Dで再構成するために、細胞内成分に特異的に標識するために使用されるマーカーの蛍光チャネルを選択します。
- しきい値を設定し、構造物の予想直径サイズの範囲を提供します(すなわち、核の場合は0.5〜5 μm、血管の場合は0〜100μmなど)。
- セグメンテーションを実行します。セグメント化されたセルラー構造を持つボリュームが生成されます。測定値と定量データ(体積、数、サイズ、直径など)は、統計タブから抽出することができます。
- 管状の連続体として血管をセグメント化します。
注:フィラメントのセグメンテーションは、船舶の接続性を調べるのに非常に便利ですが、表面モジュールのセグメンテーションを使用して、血管のサイズ、体積、直径に関するデータを抽出します。実際、フィラメントモジュールを使用すると、血管のサイズの定量化が失われます。- ソフトウェアの フィラメント モジュールを開きます。
- 容器染色に対応する蛍光チャネルを選択します。
- 蛍光強度のしきい値を設定し、予想される接続ノードの適切な数を選択します。
- セグメンテーションを実行します。容器ネットワークを表すフィラメントは3Dで生成されます。測定は統計タブから抽出することができ、容器の長さ、船舶の分岐の数などを含む定量的なデータを得ることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1に示したここで説明した手順を用いて、それぞれ図2Aおよび図2Bに示すように、ヒトおよびマウス白色脂肪組織をそれぞれ染色し、光学的に透明化することができた。クリアされた組織を金属イメージングチャンバに移し、共焦点イメージングを行った(図3A)。クリアによって、取得できた組織画像の深さが大幅に改善されました(図3Bおよび図3C)。脂肪組織全体は、4倍の目的を使用して低倍率で3Dで獲得することができ(補足ムービー1を参照)、3Dマップを生成し、20倍の目的を使用して高倍率で獲得する異なる領域を選択することを可能にする(図3D)。高倍率画像は、深さ2mmの3Dで取得されます(図3E)。
この手順により、蛍光標識ファロイジンを用いることによって、DAPIおよびアクチンを用いた核を含む多数の一般的な細胞マーカーの標識が可能となる。脂質滴および脂肪細胞の特異的染色は、ペリリピン抗体を用いて達成することができる(材料表を参照)。図 4A)抗Glut4抗体(材料表を参照してください。図 4B)それぞれ。血管は、CD31抗体のいずれかを使用して検出することができます(材料表を参照してください。図 4C)マウスの犠牲の直前にレクチンDyLight649の静脈注射によって(材料の表を参照してください。図4D)。マクロファージおよびT細胞は、抗CD301-フィコエリスリン抗体を用いて可視化することができる(材料表を参照)。図4D)抗TCR-β太平洋ブルー抗体(材料表を参照してください。図 4E)。末梢神経ネットワークは、抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体を用いて検出することができる(材料表を参照)。図 4F-G)。さらに、このプロトコルは、マウス上端体脂肪組織(図4A-B,E)、マウス皮下脂肪組織(図4D,G)、マウスブラウン脂肪組織(図4F)およびヒト脂肪組織(図4C)の除去を可能にする。Figure 4Fこれらの標識と市販のソフトウェア(材料表を参照)を組み合わせてこれらのマーカーをセグメント化することにより、脂肪細胞の平均サイズおよびサイズ分布(図5A-B)およびii)血管ネットワーク密度(図5C)内で決定することができる。Figure 5
図1:白色脂肪組織のクリア処理の概要マウスまたはヒト白色脂肪組織は固定され、透過し、飽和し、染色され、クリアされる。その後、画像を3Dで取得し、商用ソフトウェアを使用して分析します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:白い脂肪組織の写真。(A)クリア処理の前後のヒト白色のアブドミノペリク脂肪組織の写真。(B)クリア処理の前後にマウス上端体白色脂肪組織の写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脂肪組織クリアによるイメージング深度の向上。(A)ガラス底を備えた金属画像化チャンバーの取り付け。(B) カネコの上端体白色脂肪組織の Z シリーズ画像をファロイジン-Alexa488 (緑色) クリア前後で染色した。(C)パネル B z スタックの白い点線に対応する XZ 投影。(D)ファロイジン-Alexa488を用いてアクチン染色したマウス皮下白脂肪組織の0.4 cm ZスタックのZ-スタックのZ-投影を4倍の目的で低倍率で取得した。右側の小さな画像は、20倍の目的を使用して選択された組織位置で取得した。(E) クリアマウス白脂肪組織から撮影した画像z-スタックの3Dボリュームレンダリングの側面図は、ファロイジン-Alexa488から20x画像と同様に取得した(D)から取得した。高倍率法で実現した 3D イメージング深度は、Z 深度の色分け(z= 0 mm から濃赤色の濃い赤色の z= 2 mm)で下線が付いています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウスおよびヒト白色脂肪組織が複数のマーカーに染色された。(A)抗ペリリピン1抗体および抗マウス-alexa647-共役抗体を用いて脂質滴に染色されたマウス上端白色脂肪組織の単一面像。(B)DAPI、抗Glut4抗体および抗マウス共役抗体を用いて、核および脂肪細胞に染色されたマウス上端体白色脂肪組織のモザイク単一平面画像。B(C) CD31-alexa647-共役抗体を用いた血管に染色されたヒト白色アドミノペリク脂肪組織の600μmzスタックのZ投影。(D) レクチン-DyLight649静脈注射および抗CD301-alexa55抗体を用いた血管およびマクロファージに染色されたマウス皮下白脂肪組織の600μm zスタックのZ-スタックのZ-プロジェクション。右下のインセットは、白い点線のボックスの拡大画像です。(E)ファロイジン-Alexa488および抗TCRβ-パシフィックブルー共役を用いてアクチンおよびT細胞に染色されたマウス上端白色脂肪組織の単一平面像。右下のインセットは、白い点線のボックスの拡大画像です。(F)DAPI、抗TH抗体、抗ウサギアレクサ647-コンジュゲート抗体を用いた核および神経ネットワークに染色されたマウスブラウン脂肪組織の50μmzスタックのZ-投影。(G)DAPI、抗TH抗体および抗ウサギ-アレクサ647-コンジュゲート抗体を用いた核および神経ネットワークのために染色されたマウス皮下白脂肪組織の600μm zスタックのZ-スタック。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:市販のソフトウェアを使用した3D画像の解析(資料表参照)。(A)市販のソフトウェアによって3Dでセグメント化されたヒトのアディポサイトの3Dボリュームレンダリング。すべてのアディポサイトは、隣接する隣接する有数細胞とは異なる色を有する。船は赤で表されます。(B) 約 20,000 のアディポサイトを含むパネル A の 3D 容積レンダリングからのアディポサイトのサイズ定量と分布。(C)3Dでセグメント化された血管の3D容積レンダリングは、市販のソフトウェアを使用し、それぞれ大小血管の赤または黄色で表される。Cこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ムービー1:図3Dに示す皮下白脂肪組織全体の 3D体積レンダリング。白いボックスは2 cm3 立方体を表す。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肥満などの病理学的進行の過程で脂肪組織内で起こる修飾は、病理学の背後にあるメカニズムの理解の基本である。脂肪組織におけるこのようなメカニズムを明らかにした先駆的な研究は、全体の脂肪組織プロテオミクス21、フローサイトメトリー22、23、および転写23体2224、25などの世界的なアプローチに24,25基づいている。さらに、組織学的分析26、27、28、29,27,28を用いて脂肪組織で起こる構造変化を29探る努力がなされている。しかし、5-10 μm脂肪組織切片の分析は、セクションのサイズが限られているため、重要な構造特徴を理解する能力を制限します。まず、各セクションが、その数少ない部分のみを表す(1/10番目)ため、セクションごとに少数のアディポサイト核しか検出できない。第二に、脂肪細胞の大部分が赤道の下または後ろで切断され、その平均サイズの偏った(下)測定につながるため、脂肪組織切片から推定される脂肪細胞の大きさは不正確である。第三に、血管および神経線維連続体は、物理的な切断中に失われる。第4に、組織内の免疫細胞の各サブタイプの分布は、三次元座標が失われるため確立が困難である。この文脈で、我々がここで提案する方法論は、任意の標準的な実験室が簡単かつ安価な方法で、3次元でヒトおよびマウスの白い脂肪組織を画像化することを可能にする。
この方法には、いくつかの制限があります。まず、組織を準備するのに要する時間(固定、透過、染色、クリア)が長い(1週間以上)。この時間の大部分は組織を染色するために必要とされるため、これを減らすのは難しいだろう。このような大きな組織サンプル内の抗体の浸透は、長いインキュベーション時間を必要とします。インキュベーション時間を短縮すると、非均質抗体の侵入のリスクが高くなり、染色アーティファクトにつながります。したがって、時間を得て手順を短縮する唯一の可能なウィンドウは、最適な結果が必要な場合に約1日かかる組織をクリアするために専用の時間ですが、これは品質の劇的な低下なしに半日に減少させることができます。第2の制限は、組織の収縮の可能性である。実際、溶媒を用いて組織を脱水するプロトコルでは、組織が水分除去のために収縮する可能性が高い。この収縮を推定することは常に困難であり、脱水プロセス中に脂質が抽出され始めると組織の端が透明になるので、ここではほとんど不可能です。したがって、クリアされた組織のサイズ推定は慎重に解釈する必要があります。しかし、異なる遺伝子型を有するマウスに由来する組織間のアディポサイトサイズまたは血管長の変化を比較し、異なる環境条件に提出された11。最後の制限は、マウス脂肪組織全体または大きなヒト脂肪組織外科試料の大量にリンクされている。確かに、プロトコルは完全にこれらの大きなサンプルをクリアするために適応されているが、全体の器官をイメージすることは共焦点顕微鏡で挑戦的である。この問題を克服し、臓器のクリア処理手順全体の可能性を最大限に活用する戦略は、4倍の目的を用いて臓器全体の3D低倍率マップを取得し、20倍の長距離目標を用いてより高い倍率3D画像を得ることができる組織内にランダムに分散した特定の領域を選択することである。「高倍率」セットアップは、約45 mm 3(4.73 x 4.7 x 2 mm)の組織体積をイメージングすることができます。この体積は、器官全体の体積(0.5〜4cm3以上)に比べて制限3されていますが、組織内のいくつかの位置で取得を繰り返すと、細胞から細胞下の分解能に対する組織の良好なサンプリングを得ることができます。大きな組織をイメージングすると、保存する必要がある大量のイメージングデータが生成されることに注意してください。
この手順は、脂肪組織14,30,30をクリアするために先に記載されている方法と比較すると有意な差がある。まず、メタノール、ジクロロメタン、ジベンジレター14を使用するAdipoClearとは異なり、ここで提示される方法は、脱水用エタノールと、透明化のためのメチルサリチル酸を使用する。したがって、ジクロロメタン、メタノール、ジベンジレテルの毒性が高いと比較して、食品/飲料処理産業(エタノールおよびメチルサリチル酸塩)で使用されることが多い毒性の低い溶剤(エタノールおよびメチルサリチル酸塩)を利用するため、この手順はより安全です。さらに、プロトコルに従う組織の調製は、AdipoClearプロトコル14よりも2日速い。さらに最近では、Liたちは、グリセロール30に浸漬して脂肪組織片を取り除く別の方法を提案した。このプロトコルは、この手順に比べて非常に簡単であり、画像の品質は、高倍率でも良いです。しかし、このクリアリングプロトコルは、2mm3脂肪組織3片を使用する場合にのみ効率的に動作します。クリア手順の前にこれらの小さなサンプルへの組織の切片は、低倍率でも2mm3より大きい組織体積をイメージングから1つを防ぎます。ここで示す手順は、低倍率で3Dで組織全体をマッピングし、高倍率で全体のクリア脂肪組織内のいくつかの既知の位置で45ミリメートル3の周りの画像の3Dスタックの取得を可能にします。
この手順には、将来のアプリケーションがいくつか含まれます。他の方法と同様に、ここで説明する手順は、簡略化および/またはさらに最適化することができます。この手順の興味深い進歩は、クリアリングプロセスの組み合わせから来る可能性があり、我々は、追加のイメージングアプローチで述べた。例えば、光学投影断層撮影(OPT)、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRF)、選択的計画照明顕微鏡(SPIM)、刺激放出枯渇顕微鏡(STED)などの特定のイメージング設定は、原則としてこの手順に適合していますが、これらのシステムを搭載した実験室への適用性は制限されます。あるいは、多くの研究室で見られる1秒間に数百枚の画像を取得できる高い開口率と取得システムを有する目的を用いて、超分解能放射状変動(SRRF)後処理画像解析フリーウェア31を用いて超解像解析を行うことができる。興味深いことに、古典的なフッ素色は、人間とマウスの白い脂肪組織全体の3D超解像分析を可能にするSRRF分析に適応されています。
プロトコルの多くの重要なステップは、クリアリング自体の前に組織処理に関連しています。まず第一に、古典的な組織学的分析については、固定ステップは基本的なものです。弱い固定の場合、構造的特徴は維持されず、拡張固定は特定の抗原部位の架橋および遮断を招き、結果的に非均質な免疫染色を引き起こしうる。もう一つの敏感なステップは、以下に説明するいくつかの重要な点を提示する組織の染色です。まず、抗体は、クライオスタットセクションで検査して、機能性を確認し、最適な濃度を決定する必要があります。クリアリング手順に使用される最終濃度は、クライオスタットセクションの最適濃度の10倍です。第二に、組織の大きさのためにインキュベーションの時間も重要です。潜伏時間が短すぎると、弱いまたは非均質な免疫染色が生じる(例えば、組織の周囲で正しい染色が、内部染色は行いません)。同様に、短すぎる洗浄工程は、非特異的染色につながる組織から非特異的に結合した抗体が除去されるのを防ぐ。我々の知る限りでは、抗体を用いた組織の拡張インキュベーションは染色を損なわない。そのため、長いインキュベーションと洗浄期間を強くお勧めします。第三に、蛍光色素の選択は、対象のシグナルに適合されなければならない。一般的に組織サンプルでは、特に白色脂肪組織では、488nmおよび555nmで非無視できないオート蛍光が検出可能である。高度に発現したタンパク質の場合、これは問題ではなく、染色はこれらのチャネルでうまく機能します。しかし、発現が少ないタンパク質については、遠赤色フルオロクロムの使用を強くお勧めします。クリアリングの場合、方法論は非常に簡単であるため、重要なステップはありません。サリチル酸メチルはプラスチック材料と互換性がないので、クリアステップ用のガラスボトルと、イメージングを行うためのガラス底部を備えた金属製のチャンバーをお勧めします。この取り付け手順の代替は、i)通常のガラススライド、歯科用樹脂およびガラスカバースリップ(小さなガラスチャンバーを生成する)、またはii)ガラスシャーレ(直立した顕微鏡用)を使用して存在する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示する矛盾を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、INSERMによってサポートされました。 コート・ダジュール大学、そして将来のラベックス・シグナライフへの投資を通じたフランス国立研究庁(ANR)からの助成金(ANR-11-LABX-0028-01)、プログラムUCA JEDI(ANR-15-IDEX-01)、アカデミー2「システムズコンプレックス」とアカデミー4「コンプレックス・エ・ダイバート」を通じて フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(エキペFRM DEQ20180839587)とJ.G.(ANR18-CE14-0035-01-ギレロン)に若い調査官プログラムを注ぎます。また、コンセシル・デ・アルプ・マリティームとレジオンPACAが出資するC3Mのイメージングコア施設に感謝し、IBISA顕微鏡・イメージングプラットフォームコートダジュール(MICA)も支援しています。マリオン・デュソットの組織準備に関する技術的な助けに感謝します。私たちは、原稿の証拠読み取りのためにアビー・カットトリス、UCA国際科学可視性に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
