Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

בדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים טרום השרשה באמצעות מדיום תרבית משומש: איסוף דגימות וניתוח פלואידיות כרומוזומליות

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62619
Automatic Translation
*1,2,3,4, *5, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4, 5
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול לבדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים המשתמש במדיום תרבית משומש, המונע ביופסיה של עוברים ומאפשר זיהוי כרומוזום פלואידי באמצעות NGS. המאמר הנוכחי מציג את ההליך המפורט, כולל הכנת מדיום תרבית, הגברה של גנום שלם (WGA), הכנת ספריית ריצוף הדור הבא (NGS) וניתוח נתונים.

Abstract

בהפריה חוץ גופית קלינית (IVF), השיטה הרווחת עבור PGT-A דורשת ביופסיה של כמה תאים מהטרופקטודרם (TE). זוהי השושלת היוצרת את השליה. שיטה זו, לעומת זאת, דורשת מיומנויות מיוחדות, היא פולשנית, וסובלת מתוצאות חיוביות ושליליות שגויות מכיוון שמספרי הכרומוזומים ב- TE ומסת התא הפנימית (ICM), המתפתחת לעובר, אינם תמיד זהים. NICS, טכנולוגיה הדורשת ריצוף של דנ"א המשתחרר למדיום התרבית הן מ-TE והן מ-ICM, עשויה להציע מוצא לבעיות אלה, אך הוכחה בעבר כבעלת יעילות מוגבלת. המחקר הנוכחי מדווח על הפרוטוקול המלא של NICS, הכולל שיטות דגימה בינוניות בתרבית, הגברה של גנום שלם (WGA) והכנת ספריות, וניתוח נתוני NGS באמצעות תוכנת ניתוח. בהתחשב בזמני ההקפאה השונים במעבדות עוברים שונות, לאמבריולוגים יש שתי שיטות לאיסוף מדיום תרבית עוברים שניתן לבחור על פי התנאים בפועל של מעבדת הפריה חוץ גופית.

Introduction

טכנולוגיות רבייה בסיוע (ARTs) שימשו יותר ויותר לטיפול באי פוריות. עם זאת, שיעור ההצלחה של ART, כגון הפריה חוץ גופית, היה מוגבל, ושיעור אובדן ההריון גבוה משמעותית מזה של האוכלוסייה הרגילה1. הגורם העיקרי לבעיות אלה הוא הפרעות כרומוזומליות, הקיימות בדרך כלל בעוברים אנושיים טרום השרשה2. PGT-A היא שיטה יעילה לבדיקת עוברים לאיזון כרומוזומלי לפני השרשה 3,4. כמה מחקרים הוכיחו כי PGT-A יכול להפחית את שיעור ההפלות ולשפר את שיעור ההריון 5,6,7,8. עם זאת, PGT-A דורש מומחיות טכנית מורכבת הדורשת הכשרה וניסיון ספציפיים. הליך ביופסיית העובר הפולשני עלול גם לגרום נזק לעוברים9. מחקרים הראו כי ביופסיית בלסטומרים יכולה לעכב את ההתפתחות הבאה, ומספר הביופסיות עשוי להשפיע על שיעורי ההשתלה10. למרות שנושא הבטיחות הביולוגית ארוכת הטווח של ביופסיית עוברים עדיין לא נבדק ביסודיות בבני אדם, מחקרים בבעלי חיים הראו את ההשפעות השליליות שלה על התפתחות העובר11,12,13.

דיווחים קודמים הצביעו על כך שכמויות זעירות של חומרי דנ"א הופרשו למדיום התרבית במהלך התפתחות העובר, ונעשו מאמצים לבצע בדיקת כרומוזומים מקיפה (CCS) באמצעות תרבית עוברים משומשת 14,15,16,17,18. עם זאת, שיעורי הגילוי והדיוק של הבדיקות לא עמדו בדרישות לשימוש קליני נרחב. המחקר הנוכחי דיווח על שיפור בבדיקת NICS להגדלת שיעורי האיתור, כמו גם את הדיוק של מבחן NICS19. בשנים האחרונות, נוזל בלסטוקוele (BF) נחקר כמדגם אנליטי של PGT-A זעיר פולשני. עם זאת, שיעור ההגברה המוצלחת של הגנום כולו והדנ"א הניתן לזיהוי בדגימות נוזל בלסטוציסט נע בין 34.8% ל-82%20,21,22. נפח ה-BF המדווח במחקרים שונים נע בין 0.3 nL ל-1 μL. לאור הכמות הנמוכה של DNA ב- BF, ניתן להגדיל את כמות ה- DNA ללא תאים על ידי ערבוב נוזל בלסטוציסט ומדיום תרבית כדי לשפר את שיעור ההצלחה ואת עקביות האיתור. Kuznyetsov et al.23 ו-Li et al.24 טיפלו בזונה פלוצ'ידה בלייזר ושחררו נוזל בלסטוציסט למדיום התרבית כדי לשפר את הכמות הכוללת של דנ"א עוברי, וקצב ההגברה של דגימות בינוניות/BF משולבות לאחר WGA היה 100% ו-97.5%, בהתאמה. Jiao et al.25 השיגו גם שיעור הצלחה של 100% הגברה באמצעות אותה שיטה.

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול מפורט הכולל הכנת דגימות מדיה משומשות, הכנת NGS וניתוח נתונים. על ידי הסרה זהירה של תאי קומולוס מביציות, המחקר הנוכחי ביצע הזרקת זרע יחיד תוך ציטופלזמית (ICSI) ותרבית בלסטוציסט. היום, 4 ימים 5/יום 6 בילה בינוני נאסף להכנת ספריית WGA ו- NGS. על ידי שימוש בטכנולוגיית NICS, המחקר הנוכחי ייעל את שלבי הכנת ספריית WGA ו- NGS תוך כ -3 שעות והשיג תוצאות CCS באופן לא פולשני תוך כ -9 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור אתי התקבל מוועדת האתיקה של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין.

1. הכנה

הערה: החומרים והציוד הדרושים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. ריאגנטים
    1. חימום מקדים ושיווי משקל (מאוזן) של 20-30 מיקרוליטר מדיום גמטה/מדיום דישון ומדיום תרבית שלב מחשוף/בלסטוציסט (מכוסה בשמן מינרלי) והיאלורונידאז (בצינור מכוסה) ב-37°C, 5%CO2 ו-5% O2 באינקובטור טרי-גז לילה לפני השימוש.
    2. מחממים מראש את ההיאלורונידאז ל-37°C על משטח עבודה במכסה אדים.
    3. הכינו מאגר ויטריפיקציה וריאגנטים לאיסוף דגימות בהתאם להוראות היצרן.
  2. כלים
    1. הכינו פיפטות איסוף והעברה של דגימות (קוטר פנימי של ~200 עד 250 מיקרומטר), פיפטות דנודציה/חשפניות (קוטר פנימי של ≥150 מיקרומטר, ~130-140 מיקרומטר, ו~120 מיקרומטר), ופיפטות לשטיפה (קוטר פנימי של ~150 מיקרומטר) על ידי משיכת פיפטות פסטר מזכוכית ליצירת קצוות עדינים פתוחים מלוטשים באש.
      הערה: ניתן לרכוש ישירות את הפיפטות המשמשות לאיסוף/העברת דגימות, דנודציה ושטיפה. ניתן לרכוש ישירות גם את מחטי האחיזה ומחטי ההזרקה.

2. פרוטוקול 1: איסוף דוגמאות

  1. טיפול מקדים בקומפלקס ביציות-קורונה-קומולוס (OCCCs) לפני העיכול עם היאלורונידאז
    1. השיגו גירוי שחלתי בעזרת הורמון מגרה זקיק (FSH) ותכשירי גונדוטרופין בגיל המעבר האנושי (hMG). כאשר זקיק העופרת הוא >18 מ"מ, השתמש ב- 10,000 IU של גונדוטרופין כוריוני (hCG) להבשלה סופית של הביציות.
    2. בצע שאיבת ביציות 36 שעות לאחר זריקת טריגר. הרימו והעבירו ביציות לצלחות תרבית רקמה עם 2.5 מ"ל m-HTF שחומם מראש מכוסה בשמן מינרלי.
    3. העבירו במהירות את OCCCs לבאר המרכזית של צלחת תרבית איברים המכילה 1 מ"ל של מדיום הפריה באמצעות פיפטת העברה ולאחר מכן לדגור עם הביציות ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו 5% O 2 אינקובטור במשך2-4 שעות.
  2. לעכל OCCCs עם hyaluronidase על ידי הוספת 1 מ"ל של 37 ° C מחומם מראש hyaluronidase (80 IU / מ"ל) לבאר המרכזית של צלחת תרבית איברים המכילה OCCCs (שלב 2.1.3). יש לשמור על הריכוז הסופי של היאלורונידאז על 40 IU/mL ולערבב היטב.
    1. לדגור OCCCs על פלטפורמה תרמית 37 ° C במשך 2 דקות. התבוננו בשינויים תחת מיקרוסקופ כל 30 שניות עד שנותרו רק 1-2 שכבות של תאי גרנולוסה.
  3. דנודציה של תאי גרנולוזה
    1. מעבירים במהירות את ה-OCCCs המעוכלים בצלחת התרבית לטיפול בביציות ומכסים בשמן מינרלי בכל באר.
    2. התבוננו בתאי הגרנולוזה המופרדים תחת מיקרוסקופ. שאפו בעדינות ושחררו את הביציות 5 פעמים כדי להסיר שאריות תאי גרנולוזה סביב הביציות.
    3. חזור על השלב הקודם ב -3 הבארות הנותרות כדי להסיר לחלוטין את תאי הגרנולוסה.
      הערה: ניתן לבצע את השלבים הנ"ל (2.1-2.3) בהתאם לפעולה השגרתית של כל מעבדה.
  4. הערכת הביצית
    1. להעריך את השלמות של הסרת תאי גרנולוזה באמצעות מיקרוסקופ. אם לא ניתן היה להסיר את התאים לחלוטין, אז שימור של 5 או פחות תאי גרנולוזה מקובל בשלב זה.
      הערה: אם תאי קומולוס עדיין מחוברים לביצית, ניתן להסיר את השאריות מאוחר יותר ביום 3 לפני העברת העובר ממדיום תרבית בשלב המחשוף למדיום תרבית בשלב הבלסטוציסט.
  5. לאחר ביצוע הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI)26, מעבירים את הביציות למיקרו-טיפות בינוניות בתרבית עוברים במחשוף של 20-30 מיקרו-ליטר (ביצית אחת מתאימה למיקרו-טיפה אחת) באמצעות פיפטות העברה ודוגרות באינקובטור של 37°C, 5% CO 2 ו-5% O2.
    1. רשום את היום של ICSI כיום 0. בדקו את העוברים והניקוד על פי סדנת הקונצנזוס באיסטנבול בנושא הערכת עוברים של יום 1 להפריה (כ-18 שעות), יום 2 (כ-45 שעות) ויום 3 (כ-68 שעות) למחשוף עוברים27.
  6. שטיפת עוברים
    1. הכינו 20-30 מיקרו-ליטר של מיקרו-טיפות בינוניות בתרבית בלסטוציסט לכל עובר מכוסה בשמן מינרלי בצלחות תרבית רקמה ביום 2 באינקובטור של 37°C, 5% CO 2 ו-5% O2.
    2. הכינו עוד שלוש מיקרו-טיפות מכוסות בשמן מינרלי, ותייגו את כלי תרבית הרקמה החדשים לשטיפה מס' 1-3.
    3. העבירו את 3 העוברים של היום לטיפות הכביסה. שאפו בעדינות ושחררו את העוברים 3 פעמים בכל טיפה באמצעות פיפטות דנודציה.
      הערה: הליך זה יכול גם לסייע בהסרת שאריות התאים הגרגיריים המחוברים לעובר.
    4. התבוננו והעריכו את העוברים תחת מיקרוסקופ ביום השלישי לפני שהתווך השתנה ממדיום תרבית בשלב המחשוף למדיום תרבית בלסטוציסט לצורך ניקוד מורפולוגי. אם תאי קומולוס עדיין היו מחוברים לעובר, פיפטה מתאימה למעלה ולמטה בתרבית בלסטוציסט אחרת מחוממת מראש ומאוזנת טיפה בינונית מכוסה בשמן מינרלי עם פיפטה חשפנית עד שתאי הקומולוס הוסרו לחלוטין.
      הערה: היה צורך להסיר לחלוטין את כל תאי הקומולוס המחוברים ביום 3 לפני העברת העובר מהצלחת הבינונית של תרבית שלב המחשוף לצלחת המדיום של תרבית שלב הבלסטוציסט. כל תאי הקומולוס הנותרים יפריעו לניתוח הסופי ויתנו תוצאות שליליות כוזבות.
  7. שתי אפשרויות לקולקציית מדיום תרבות
    הערה: המרכז להפריה חוץ גופית יכול לבחור באחת משתי שיטות לאיסוף מדיום תרבות בהתבסס על המשאבים, הדרישות וההעדפות של המרכז.
    1. אפשרות 1: שטיפת עוברים ותרבית
      הערה: אפשרות זו מיועדת למעבדות IVF המבצעות ויטריפיקציה בבוקר היום החמישי.
      1. מעבירים את העובר למיקרו-טיפות מחוממות מראש (37°C) של מדיום תרבית, ושוטפים בעדינות כל עובר באופן סדרתי ב-3 מיקרו-טיפות על ידי פיפטינג ביום 4 אחר הצהריים.
      2. מעבירים כל עובר למיקרו-טיפה יחידה ייחודית שחוממה מראש (37°C) של מדיום תרבית לאיסוף דגימה. נפחה של טיפה אחת של מדיום תרבית אינו יכול לעלות על 25 מיקרוליטר.
      3. בצע תרבית עובר בלסטוציסט ביום 5/יום 6 ב 37 ° C, 5% CO 2, ו 5% O2.
    2. אפשרות 2: שטיפת עוברים ותרבית
      הערה: אפשרות זו מיועדת למעבדות IVF המבצעות ויטריפיקציה ביום 5 אחר הצהריים או ביום 6.
      1. מעבירים את העובר למיקרו-טיפות שחוממו מראש (37°C) בתרבית בינונית של 10-15 μL, ושוטפים בעדינות כל עובר באופן סדרתי ב-3 מיקרו-טיפות על ידי פיפטינג ביום החמישי.
      2. מעבירים כל עובר למיקרו-טיפה יחידה ייחודית שחוממה מראש (37°C) של מדיום תרבית לאיסוף דגימה. נפחה של טיפה אחת של מדיום תרבית אינו יכול לעלות על 15 מיקרוליטר.
      3. בצע תרבית עובר בלסטוציסט ביום 5/יום 6 ב 37 ° C ו 5% CO2.
  8. אוסף דוגמאות
    1. כוונן בעדינות את ה- ICM במרחק ניכר מנקודת היעד של קרן הלייזר, המתמקדת בצומת התא של הטרופקטודרם כדי ליצור חור קטן בטרופקטודרם כדי לשחרר את הנוזל מחלל הבלסטוקול. לאחר מכן עוברים עוברים לתמיסת הקפאה לשימור בהקפאה בהתאם לתהליך הקונבנציונלי.
    2. העבר מדיום תרבית מכל עובר מתורבת לתוך צינור PCR ללא RNase / DNase המכיל 5 μL של חיץ ליזה התא.
    3. לאסוף את אותה כמות של מדיום תרבית מבלי לשמש לתרבית עוברים כביקורת שלילית. יש להקפיא את כל הדגימות שנאספו מיד בחנקן נוזלי ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של -80°C לאחר שנאספו עד לבדיקת NICS.
  9. בצע ויטריפיקציה כמתואר בפרוטוקול.

3. פרוטוקול 2: בניית הספרייה

  1. תרבות בינונית ליזה
    1. לדלל 1 μL של שליטה חיובית (10 ng gDNA אנושי) עם 199 μL של מדיום תרבית טרי. מערבבים היטב וצנטריפוגות את הצינור לזמן קצר (200 x גרם במשך 5 שניות).
    2. העבר 10 μL של יום 5-יום 6 מדיום תרבית בלסטוציסטה, שליטה חיובית מדוללת, ומדיום תרבית טרי לצינורות PCR חדשים של 0.2 מ"ל.
    3. הוסף 1 μL של תערובת אנזים MT לכל צינור PCR וערבב היטב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה מיד במשך 2-3 שניות ב 200 x גרם.
    4. שים את שפופרת ה- PCR משלב 3.1.3 בתחנת הכנה לדוגמה של NICS שחוממה מראש והפעל את תוכנית הליזיס כדלקמן: 10 דקות ב- 75 °C; 4 דקות ב 95 ° C; להחזיק ב 22 ° C.
      הערה: תחנת ההכנה לדוגמה דומה למכונת PCR רגילה.
      1. לחץ על סמל Lysis כדי להיכנס למסך ההתקנה.
      2. בחר Tube עבור מצב בקרה; קלט 10 μL עבור נפח דגימה; בחר מופעל עבור בקרת Hotlid והזן 105 ° C עבור הטמפרטורה. בחר לא עבור השהיה בסג הראשון. לחץ על אישור כדי להמשיך.
      3. המתן עד שזמן השהייה יופיע --:-- :---, המציין את סוף התוכנית ולאחר מכן לחץ על עצור כדי לסיים את התוכנית.
    5. הפסק את התוכנית לאחר השלמת התהליך. המשך לשלב הבא באופן מיידי.
  2. הכנה טרום ספרייתית
    1. הפשירו את החיץ Pre-Lib ל-RT. ערבבו היטב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה מיד במשך 2-3 שניות ב 200 x גרם.
    2. הכינו תערובת אב לתגובה קדם-ספרייתית באופן הבא: הוסיפו 2 μL של תערובת אנזימים Pre-Lib ל-60 μL של Pre-Lib Buffer, ערבבו את התגובה ביסודיות וצנטריפוגה קצרה.
    3. הוסף 60 μL של תערובת תגובה קדם-ספרייתית לכל דגימה בינונית שטופלה מראש מהשלב הקודם. מערבבים היטב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה מיד במשך 2-3 שניות ב 200 x גרם.
    4. מקם את שפופרת ה-PCR משלב 3.2.3 בתחנת ההכנה לדוגמה והפעל את תוכנית קדם-ספריה באופן הבא: 95°C למשך 2 דקות; 12 מחזורים של 15 °C עבור 40 s, 22 °C עבור 40 s, 33 °C עבור 30 s, 65 °C עבור 30 s, 72 °C עבור 40 s, 95 °C עבור 10 s ו 63 °C עבור 10 שניות; והחזק בטמפרטורה של 4°C.
      1. לחץ על סמל Pre_Lib כדי להיכנס למסך ההתקנה.
      2. בחר Tube עבור מצב בקרה; קלט 70 μL עבור נפח מדגם; בחר מופעל עבור בקרת מכסה חם והזן 105 ° C עבור הטמפרטורה. בחר לא עבור השהיה בסג הראשון. לחץ על אישור כדי להמשיך.
      3. המתן עד שזמן השהייה יופיע --:-- :---, המציין את סוף התוכנית, ולחץ על עצור כדי לסיים את התוכנית.
    5. הפסק את התוכנית עם השלמת התהליך. המשך לשלב הבא באופן מיידי.
  3. הכנת הספרייה
    1. הפשירו את מאגר הספרייה ל-RT. ערבבו היטב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה מיד במשך 2-3 שניות ב 200 x גרם.
    2. הכינו תערובת אב לתגובת הספרייה באופן הבא: הוסיפו 1.6 מיקרוליטר של תערובת אנזימי הספרייה ל-60 מיקרוליטר של מאגר הספרייה, ערבבו את התגובה ביסודיות וצנטריפוגה קצרה.
    3. הוסף 60 μL של תערובת תגובת ספרייה ו- 2 μL של פריימר ברקוד לכל מוצר קדם-ספרייה משלב 3.2.3. מערבבים היטב את התגובה וצנטריפוגה קצרה.
    4. מקם את שפופרת ה- PCR משלב 3.2.3 במחזור התרמי והפעל את תוכנית הכנת הספרייה באופן הבא: 94 ° C למשך 30 שניות; 17 מחזורים של 94 ° C עבור 25 שניות, 62 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 45 שניות); ולאחר מכן להחזיק ב 4 °C (75 °F).
      1. לחץ על סמל Lib_Prep כדי להיכנס למסך ההתקנה.
      2. בחר Tube עבור מצב בקרה; קלט 130 μL עבור נפח מדגם; בחר מופעל עבור בקרת Hotlid והזן 105 ° C עבור הטמפרטורה המתאימה. בחר לא עבור השהיה בסג הראשון. לחץ על אישור כדי להמשיך.
      3. המתן עד שזמן השהייה יופיע --:-- :---, המציין את סוף התוכנית, ולחץ על עצור כדי לסיים את התוכנית.
  4. טיהור הספרייה
    1. הסר את Magbeads מהאחסון בטמפרטורה של 2-8°C למשך 20 דקות לפחות לפני שלב הטיהור. מערבבים ומערבבים את ה-Magbeads במשך 20 שניות. הוציאו מספיק חרוזים לשלב הטיהור לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל וחרוזים חמים ל-RT.
    2. הוסיפו 1x Magbeads לכל ספרייה. מערבבים על ידי פיטינג למעלה ולמטה ≥10 פעמים ודגרים ב-RT במשך 5 דקות.
      הערה: לדוגמה, הוסף 100 μL של Magbeads ל- 100 μL של דוגמת ספרייה.
    3. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את הצינור לזמן קצר והניחו על מעמד מגנטי.
    4. המתן כ-5 דקות עד שהפתרון יתבהר. תוך שמירה על הצינור על המעמד המגנטי, בזהירות לשאוף את הפתרון ולהשליך.
    5. הוסף 200 μL של 80% אתנול מוכן טרי לצינור. דוגרים ב-RT במשך 30 שניות ומסירים בזהירות את הסופרנטנט. חזור על הפעולה פעם נוספת.
    6. הסר את האתנול לחלוטין ככל האפשר. יבשו באוויר את החרוזים על המעמד המגנטי למשך כ-5-10 דקות ב-RT.
    7. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 17.5 מיקרוליטר של חיץ אלוציה, וסובב את הצינור כדי להשהות מחדש את החרוזים. צנטריפוגו את הצינור לזמן קצר ודגרו ב-RT למשך 5 דקות.
    8. הניחו את הצינור על המעמד המגנטי והמתינו עד שהתמיסה תתבהר. בזהירות להעביר 15 μL supernatant לצינור חדש.
  5. כימות הספרייה
    1. כמת ספריות מטוהרות באמצעות פלואורומטר בהתאם למדריך למשתמש של ערכות בדיקת dsDNA HS של קיוביט28. התשואה של הספריות נעה בין ~ 15 ל 300 ng.
  6. איגום ספריות
    1. השתמש ב- 10 ננוגרם מכל דגימת ספרייה לצורך איגום.
  7. רצף
    1. עיין במדריך למשתמש של רצף (15027617 v01)29.
    2. רצפי ספרייה מטוהרים של 50 bp בקצה אחד על הפלטפורמה הניבו כ-2 מיליון קריאות עבור כל דגימה, והומלץ על עומק רצף של 0.03 ×.
  8. ניתוח נתונים
    1. הזן את שם המשתמש והסיסמה בדף הכניסה
    2. לאחר הכניסה למערכת, לחץ על ניתוח ויופיע דף חדש. לחץ על צור שליחה תחת הכרטיסיה NICS-A. לאחר מכן, בחר NGS עבור הפלטפורמה, בחר תאגיד, בחר NICSInst עבור מגיב, הזן את פרטי הפרויקט בתיבה תחת מזהה פרויקט, הגדר את העדפות הניתוח והעלה את הקבצים. לאחר שכל קבצי הרצף הועלו בהצלחה, לחץ על שלח כדי להתחיל בניתוח (איור 3A).
    3. לחץ על הצג שליחות כדי להציג את רשימת הפרויקטים שנשלחו. לאחר השלמת הניתוח, מצב הפרויקט יהפוך ל'הושלם' ולחצן 'הצג' יופיע בשדה הדוח. לחץ על הלחצן Show כדי להציג את טבלת הסיכום של ניתוח NICS (איור 3B).
    4. לחץ על הלחצן יצא דוח כדי לשמור את הדוחות (איור 3C).
      הערה: שלושה סוגי קבצים ייוצאו עבור כל ניתוח. קובץ גרפי הכולל את כל תרשימי וריאציית מספר ההעתקה (CNV) עבור כל כרומוזום וגנום שלם, אשר יאוחסן תחת תיקיית "גרף"; גיליון אלקטרוני המכיל את פרטי QC לדוגמה של הפעלת ניתוח זו; קובץ מסמך המכיל את דוחות NICS המותאמים אישית על ידי המשתמש; וגיליון אלקטרוני המכיל את פרטי הסיכום לדוגמה של הפעלת ניתוח זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקר הנוכחי יישם את השיטה המוצעת על מטופל. אישור IRB והסכמה מדעת התקבלו לפני יישום ניתוח NICS. המחקר הנוכחי השיג 6 בלסטוציסטים מחולים וביצע NICS על כל 6 העוברים ביום 4 עד יום 5 בינוני. הפרעות כרומוזומים שנגרמו על ידי טרנסלוקציה מאוזנת של ההורים התגלו בחמישה כרומוזומים עם בדיקת NICS; לכן, לא ניתן היה להשתמש בהם להעברה (איור 4A-E). תוצאות ה-NICS של שני העוברים הראו את אותו קריוטיפ 45, ו-XN ו-18- (×1) היו שניהם מחיקות כרומוזום 18 (איור 4A, B). הקריוטיפ 46, XN, -1p (pter→p21.1, ×1) הוא רק הזרוע הקצרה של מחיקת האזור של כרומוזום 1 pter→p21.1 (איור 4D).

תוצאות NICS הראו קריוטיפ 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3) ו--18(q21.32→qter, ×1), מה שהצביע על כך שגם הזרוע הארוכה של כרומוזום 18 q21.32→qter מחיקת אזור וגם הזרוע הקצרה של אזור כרומוזום 1 pter→p21.2 שוכפלו (איור 4E). למרות שקריוטיפים 46, XN, +5q (×4) ו- -8 (×1, mos) הם שכפול כרומוזום 5 ומראים 8 הבדלים בפסיפס, בדיקת NICS יכולה לסנן את כל 24 הכרומוזומים לאנאופלואידיות. תהליך זה מספק שיטה חדשה להעברת בלסטוציסטים קריוטיפ נורמליים בודדים.

Figure 1
איור 1. הסרת שלמות של תאי קומולוס. (A) הביציות עם תאי קומולוס. (B) הביציות ללא תאי קומולוס מחוברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. תאי קומולוס מוסרים מהעובר ב-D3 לפני העברתם ל-BM. יש להסיר את כל תאי הקומולוס המחוברים לפני שינוי התווך מהצלחת הבינונית הראשונית של תרבית העובר לצלחת המדיום של תרבית הבלסטוציסט, שהיא ביום 3 לאחר שהעוברים מגיעים לשלב של 8 תאים. כל תאי קומולוס שאינם מוסרים יפריעו לניתוח הסופי ויעניקו תוצאות שליליות כוזבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. ניתוח נתונים. (A) קיימות אפשרויות שונות עבור יישום המשתמש. עבור תאגיד פלטפורמת רצף, משתמשים יכולים לבחור Illumina, Ion Torrent או MGI. המשתמשים יכולים לבחור אם המידע המגדרי ידווח. סיים את הגדרת הפרמטר לעיל, לחץ על התיבה תחת העלאת קבצים ובחר את קבצי הרצף המתאימים להעלאה. עבור Illumina, בחר את הקבצים עם סיומת של fastq.gz. לחץ על שלח כדי להתחיל את הניתוח לאחר העלאה מוצלחת. (ב) תצוגת טבלת הסיכום. טבלת הסיכום כוללת את המידע הבא: שם מדגם: השם של כל מדגם NICS מפורט; QC נתונים: מציין אם קובץ הרצף עובר את QC לניתוח NICS; דירוג AI: הדירוג (A, B או C) עבור כל מדגם NICS; AI_Rating פרשנות: הערכת פוטנציאל השתלת עוברים; דירוג AI: הציון עבור כל מדגם NICS; עלילת CNV (גנום שלם): הצג את פרופילי CNV של כל הכרומוזומים; (ג) דף שמירת דוח. לחץ על לחצן יצא דוח לצד סיכום התוצאות. בחר את המידע שברצונך להציג בדוח הסופי ולחץ על יצא. הדוחות יישמרו בתיקיית ההורדות של המחשב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. בדיקת עוברים ובחירתם באמצעות NICS מהמטופל. בסך הכל שישה עוברים התפתחו בהצלחה לשלב הבלסטוציסט, ומדיום תרבית Day4-Day5 מכל עובר נאסף עבור בדיקת NICS. (A) ו-(B) האם תוצאות ה-NICS של שני עוברי הבלסטוציסט הראו את אותו קריוטיפ 45, XN, -18(×1) שניהם מחיקת כרומוזום 18. (C) הראה קריוטיפ 46, XN, +5q (×4), -8(×1, mos) הוא שכפול כרומוזום 5 ופסיפס 8. (D) הראה קריוטיפ 46, XN, -1p (pter→p21.1, ×1) הוא רק הזרוע הקצרה של כרומוזום 1 pter→p21.1 מחיקת אזור, בעוד (E) הראה קריוטיפ 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3), -18(q21.32→qter, ×1) הוא זרוע קצרה של כרומוזום 1 pter→p21.2 שכפול אזור וזרוע ארוכה של כרומוזום 18 q21.32 → אזור qter (F) הראה הרכב כרומוזומלי מאוזן. ציר x פירושו 22 אוטוזומים באדום וכחול, ציר y מציין את מספר העותק של כל אוטוזום. הנקודות האפורות הן סולם הסרגל של תגובת מספר ההעתקה בכל חלון סל והקריוטיפ הרגיל של מספר העותק חייב להיות 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה S1. שיעורי ההצלחה של זיהוי DNA אפשרות 1 ואפשרות 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה S2. הקונקורדנציה בין NICS ו- PGT-A באפשרויות שונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שינויים ופתרון בעיות

אם תוצאות NICS מזוהמות בחומרים גנטיים של ההורים, יש לוודא שכל תאי הקומולוס-קורונה רדיאטה מוסרים ולוודא כי ICSI מבוצע לצורך הפריה. נמנעים מאחסון בינוני לא תקין או מתהליכי הכנת תבניות, מה שעלול לפגוע בדנ"א. חלל העבודה טוהר ביסודיות עם ריאגנטים לטיהור DNase ו- RNase. כדי למנוע זיהום מעוברים אחרים, עובר אחד תמיד תורבת בטיפה אחת של מדיום כדי למנוע זיהום צולב החל מהיום הרביעי. תופעת הזיהום ממוזערת כאשר מעכבים את מיקום העוברים בתרבית הסופית ירידה30,31,32,33. כדי למזער את הזיהום האימהי שינה קוזניצוב34 את נהלי תרבית העוברים מיום 0 ליום 4, כולל הסרה זהירה של שאריות תאי קורונה על ידי פיפטציה ושטיפה.

ליין ואחרים 30 מראים כי כאשר לוקחים את מדיום תרבית העובר מיום 4 ליום 5, הדיוק של זיהוי euploidy משופר, עקביות פלואידית העובר הוא יותר מ 95%, ואת העקביות של כרומוזום המין מגיע 100 %. Lledo et al.33 מצאו כי שיעור צירוף המקרים בין יום 3 יום 5 מדיום תרבית ודגימות TE היה 74.6% ו 92.0% כאשר עוברים היו בתרבית מיום 4 ליום 6.

גם הנתונים הפנימיים שלנו תומכים במסקנה זו, כפי שמוצג בלוח S1. בהשוואה לשיטת התרבית הרגילה של יום 3 יום 5, תאי הגרנולוזה הוסרו עוד יותר עקב שינוי אחד נוסף בתווך התרבית ביום 4 או ביום 5. אנו מספקים נתונים פנימיים (טבלה S1) המראים כי לשתי השיטות שלנו (אפשרות 1 ואפשרות 2) יש עקביות טובה בהשוואה ל- PGT-A, שהיא טובה יותר משיטת הדגימה ללא הסרה יסודית של CC.

מוצרים מוגברים אם הופיעו בבקרה השלילית, וייתכן שחומרי DNA חיצוניים זיהמו את המגיב או את חלל העבודה. יש לנקות את סביבת העבודה על ידי ריאגנטים המסירים DNA/RNA, להשתמש בחומרים נטולי נוקלאזות, וליצור את הריאגנטים לאחר השימוש הראשון.

הבדלים בשיעורי ההצלחה בין אפשרות 1 לאפשרות 2 נדונים בטבלה S1 ובטבלה S2.

מגבלות בדיקת NICS

ישנן שתי מגבלות עיקריות של NICS. 1) לפני ICSI, יש להסיר את כל תאי הקומולוס (בדרך כלל ממוצא אימהי, בדרך כלל הרכב כרומוזומים תקין). אם ההסרה אינה שלמה, תאי הקומולוס עשויים לשחרר DNA במהלך התפתחות העובר והדנ"א החיצוני מוגבר, מה שעשוי להיות הגורם לגילוי שלילי שגוי. 2) קשה להסיר את הזרע המחובר לזונה פלוסידה, ומומלץ מאוד לבצע את הליך NICS עם ICSI. למרות שההחלפה הקבועה של אמצעי המחשוף ביום השלישי עשויה להפחית את האפשרות לזיהום עקב תאי קומולוס וזרע מיותר, יש למזער זיהום זה אם נעשה שימוש ב- NICS בהפריה חוץ גופית קלינית. עם זאת, פותחה שיטה לגילוי NICS בעוברי הפריה חוץ גופית, כולל הפונקציה של זיהוי DNA אקסוגני, אשר תודגם בעתיד הקרוב.

מחקר זה לא השווה את ההבדלים בין מדיות שונות, שכן ניסויים קליניים בקנה מידה גדול השוו מדיה תרבותית. שמונה מרכזים השתמשו ב-4 מדיות תרבית שונות, רציפות ורציפות, וב-2 אחוזים שונים של תוספי אלבומין (5% ו-10%), ולהבדלים אלה לא הייתה השפעה משמעותית על הדיוק של תוצאות cfDNA עוברי31. ממצאים אלה תומכים בישימות הפוטנציאלית של ניתוח cfDNA עוברי לכל מעבדה להפריה חוץ גופית כאשר עובדים תחת הפרוטוקול הספציפי.

משמעויות ביחס לשיטות הקיימות

שיטת NICS מונעת ביופסיה של העובר ובכך משפרת מאוד את בטיחות השימוש. בהשוואה לבלסטוציסטים, NICS היא טכניקת סינון קדם-השרשה פשוטה, חוסכת זמן, רגישה וניתנת לשחזור, המתאימה לאוכלוסיות רבייה בסיוע עם הסתברות גבוהה לאנאופלואידיות. בניגוד לביופסיה פולשנית, הדורשת ידע רב ומקצועי עבור הליך ביופסיית הבלסטוציסט, ניתן ליישם את NICS באופן נרחב מכיוון שהאיסוף הפשוט של המדיום המשומש שלה עוקב רק אחר הפעולה הרגילה של הפריה חוץ גופית19 והוא אינו דורש הסמכת PGS/PGD במדינות מסוימות.

יישומים עתידיים

ל- NICS יש פוטנציאל לתחולה רחבה לבדיקת כרומוזומים בהפריה חוץ גופית קלינית, לא רק עבור ICSI אלא גם עבור עוברי IVF. למרות ICSI מומלץ מאוד, שיטות של הסרת הזרע מחובר zona pellucida נדרשים כדי למנוע את ההשפעה של הזרע.

הערכה מורפולוגית היא שיטה מסורתית להערכת עוברים, אך ברוב המקרים, עוברים חריגים מבחינה כרומוזומלית יכולים להיראות דומים מורפולוגית לעוברים תקינים כרומוזומלית (euploid). שילוב הערכה מורפולוגית עם בדיקת NICS בעת העברת עוברים פלואידים עם מורפולוגיה טובה לרחם עשוי לשפר את שיעורי ההריון המתמשך ואת שיעור לידות החי. ניסוי קליני אקראי ייערך כדי להעריך את היעילות הקלינית של החזרת עובר יחיד באמצעות טכנולוגיית NICS.

שלבים קריטיים בפרוטוקול

יש להסיר את כל תאי קומולוס-קורונה רדיאטה מהביציות לפני ההפריה. הביציות הופרו על ידי הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI). נמנעה הוספת חלבונים/תוספי מזון שמקורם בבני אדם למדיום התרבית. מדיום התרבית השתנה ביום 4 ונאסף ביום 5-6 כאשר הבלסטוציסטים התרחבו במלואם. העוברים גודלו בתרבית בטיפות בודדות של מדיום תרבית החל מהיום הרביעי. בעת איסוף מדיום התרבית, הוחלפו פיפטות העברה בין דגימות כדי למנוע זיהום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang ו- Sijia Lu הם עובדים של Yikon Genomics Co., Ltd.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות ל-Shiping Bo ול-Shujie Ma על עזרתם בניתוח נתוני NGS. מימון: עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח (מענק מס' 2018YFC1003100).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
  10. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicine. 94 (12), e669 (2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015).
  29. Miseq system use guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html (2016).
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).

Tags

בדיקת כרומוזומים עוברים טרום השרשה אנושיים מדיום תרבית משומשת איסוף דגימות אנליזה כרומוזומלית פלואידית הפריה חוץ גופית (IVF) בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנאופלואידיה (PGT-A) טרופקטודרם (TE) מסת תא פנימית (ICM) תוצאות חיוביות ושליליות שגויות טכנולוגיית NICS ריצוף DNA דגימה בינונית בתרבית הגברת גנום שלם (WGA) הכנת ספרייה ניתוח נתוני NGS שימור בהקפאה מעבדה להפריה חוץ גופית

Erratum

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

בדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים טרום השרשה באמצעות מדיום תרבית משומש: איסוף דגימות וניתוח פלואידיות כרומוזומליות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu,… More

Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter