Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kromosomscreening av humana preimplantatoriska embryon med hjälp av använt odlingsmedium: provsamling och kromosomal ploidyanalys

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62619
Automatic Translation
*1,2,3,4, *5, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4, 5
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den aktuella studien rapporterar ett protokoll för kromosomscreening av mänskliga embryon som använder använt odlingsmedium, vilket undviker embryobiopsi och möjliggör kromosomploiditetsidentifiering med hjälp av NGS. Den här artikeln presenterar den detaljerade proceduren, inklusive beredning av odlingsmedium, helgenomamplifiering (WGA), förberedelse av nästa generations sekvenseringsbibliotek (NGS) och dataanalys.

Abstract

Vid klinisk provrörsbefruktning (IVF) kräver den rådande metoden för PGT-A biopsi av ett fåtal celler från trofektodermet (TE). Detta är den härstamning som bildar moderkakan. Denna metod kräver dock specialiserade färdigheter, är invasiv och lider av falska positiva och negativa resultat eftersom kromosomantalet i TE och den inre cellmassan (ICM), som utvecklas till fostret, inte alltid är desamma. NICS, en teknik som kräver sekvensering av DNA som frisätts i odlingsmediet från både TE och ICM, kan erbjuda en väg ut ur dessa problem men har tidigare visat sig ha begränsad effekt. Den aktuella studien rapporterar det fullständiga protokollet för NICS, som inkluderar provtagningsmetoder för odlingsmedium, helgenomamplifiering (WGA) och biblioteksförberedelse samt NGS-dataanalys med analysprogramvara. Med tanke på de olika kryokonserveringstiderna i olika embryolaboratorier har embryologer två metoder för att samla in embryoodlingsmedium som kan väljas enligt de faktiska förhållandena i IVF-laboratoriet.

Introduction

Assisterad befruktning (ART) har i allt högre grad använts för behandling av infertilitet. Framgångsfrekvensen för ART, såsom IVF, har dock varit begränsad, och missfallsfrekvensen är betydligt högre än för normalbefolkningen1. Den främsta orsaken till dessa problem är kromosomavvikelser, som vanligtvis förekommer i preimplantatoriska mänskliga embryon2. PGT-A är en effektiv metod för att screena embryon för kromosombalans före implantation 3,4. Vissa studier har visat att PGT-A kan minska antalet aborter och förbättra graviditetsfrekvensen 5,6,7,8. PGT-A kräver dock komplex teknisk expertis som kräver specifik utbildning och erfarenhet. Den invasiva embryobiopsiproceduren kan också potentiellt orsaka skador på embryona9. Studier har visat att blastomerbiopsi kan hindra efterföljande utveckling, och antalet biopsierade TE kan påverka implantationsfrekvensen10. Även om den långsiktiga biosäkerhetsfrågan för embryobiopsi ännu inte har utvärderats grundligt hos människor, har djurstudier visat dess negativa inverkan på embryoutvecklingen11,12,13.

Tidigare rapporter indikerade att spårmängder av DNA-material utsöndrades i odlingsmediet under embryoutvecklingen, och ansträngningar har gjorts för att utföra omfattande kromosomscreening (CCS) med hjälp av använt embryoodlingsmedium 14,15,16,17,18. Detektionsgraden och noggrannheten i testerna har dock inte uppfyllt kraven för omfattande klinisk användning. Den aktuella studien rapporterade en förbättring av NICS-analysen för att öka detektionsgraden samt noggrannheten hos NICS-testet19. Under de senaste åren har blastocoelevätska (BF) studerats som ett analytiskt prov av minimalt invasiv PGT-A. Andelen framgångsrik amplifiering av hela genomet och detekterbart DNA i blastocystvätskeprover varierar dock från 34,8 % till 82 %20,21,22. Volymen BF som rapporterats i olika studier varierar från 0,3 nL till 1 μL. Med tanke på den låga mängden DNA i BF är det möjligt att öka mängden cellfritt DNA genom att blanda blastocystvätska och odlingsmedium för att förbättra framgångsfrekvensen och konsistensen i detektionen. Kuznyetsov et al.23 och Li et al.24 behandlade zona pellucida med laser och släppte ut blastocystvätska i odlingsmediet för att förbättra den totala mängden embryonalt DNA, och amplifieringshastigheten för de kombinerade medium/BF-proverna efter WGA var 100 % respektive 97,5 %. Jiao et al.25 uppnådde också en 100% förstärkningsframgångsfrekvens genom att använda samma metod.

Den aktuella studien rapporterar ett detaljerat protokoll som inkluderar provberedning av förbrukade medier, NGS-beredning och dataanalys. Genom att försiktigt avlägsna cumulusceller från oocyter utförde den aktuella studien intracytoplasmatisk injektion av enstaka spermier (ICSI) och blastocystodling. Dagen 4-dagars 5/dag 6 spenderade medium samlades in för WGA och NGS bibliotek förberedelse. Genom att använda NICS-teknik effektiviserade den aktuella studien WGA- och NGS-bibliotekens förberedelsesteg på cirka 3 timmar och erhöll CCS-resultat icke-invasivt på cirka 9 timmar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiskt tillstånd erhölls från den etiska kommittén vid Pekings universitets tredje sjukhus.

1. Förberedelse

OBS: De material och den utrustning som krävs anges i materialförteckningen.

  1. Reagenser
    1. Förvärm och jämvikt (balanserad) 20–30 μL könscellsmedium/gödningsmedium och odlingsmedium i klyvnings-/blastocyststadiet (täckt med mineralolja) och hyaluronidas (i ett tätt förslutet rör) vid 37 °C, 5 % CO2 och 5 % O2 i en Tri-gas inkubator över natten före användning.
    2. Förvärm hyaluronidas till 37 °C på en arbetsyta i ett dragskåp.
    3. Förbered förglasningsbuffert och provuppsamlingsreagens enligt tillverkarens instruktioner.
  2. Arbetsredskap
    1. Förbered provtagnings- och överföringspipetter (innerdiameter på ~200 till 250 μm), denudations-/stripperpipetter (innerdiameter på ≥150 μm, ~130-140 μm och ~120 μm) och pipetter för tvätt (innerdiameter på ~150 μm) genom att dra i Pasteur-pipetter av glas för att generera eldpolerade öppna fina spetsar.
      OBS: Pipetterna som används för sample insamling/överföring, denudation och tvätt kan köpas direkt. Hållnålarna och injektionsnålarna kan också köpas direkt.

2. Protokoll 1: Provtagning

  1. Förbehandling av oocyt-korona-cumuluskomplex (OCCC) före matsmältning med hyaluronidas
    1. Uppnå äggstocksstimulering med både follikelstimulerande hormon (FSH) och humant menopausalt gonadotropin (hMG) preparat. När blyfollikeln är >18 mm, använd 10 000 IE koriongonadotropin (hCG) för slutlig oocytmognad.
    2. Utför ägghämtning 36 timmar efter avtryckarskottet. Plocka upp och överför oocyter till vävnadsodlingsskålar med 2,5 ml förvärmd m-HTF täckt av mineralolja.
    3. Överför snabbt OCCC:erna till den centrala brunnen i en organodlingsskål som innehåller 1 ml befruktningsmedium med hjälp av en överföringspipett och inkubera sedan med oocyterna vid 37 °C i en inkubator med 5 %CO och 5 % O 2 i2-4 timmar.
  2. Smält OCCC med hyaluronidas genom att tillsätta 1 ml 37 °C förvärmt hyaluronidas (80 IE/ml) till den centrala brunnen i en organodlingsskål innehållande OCCC (steg 2.1.3). Håll den slutliga koncentrationen av hyaluronidas på 40 IE/ml och blanda noggrant.
    1. Inkubera OCCC:erna på en 37 °C termisk plattform i 2 minuter. Observera förändringarna i mikroskop var 30:e sekund tills endast 1-2 lager granulosaceller återstod.
  3. Denudation av granulosaceller
    1. Överför snabbt de smälta OCCC:erna i odlingsskålen för hantering av oocyter och täck med mineralolja i varje brunn.
    2. Observera de separerade granulosacellerna i mikroskop. Aspirera försiktigt och släpp oocyterna 5 gånger för att ta bort kvarvarande granulosaceller runt oocyterna.
    3. Upprepa föregående steg i de återstående 3 brunnarna för att helt ta bort granulosacellerna.
      OBS: Ovanstående steg (2.1-2.3) kan utföras enligt rutindriften i varje laboratorium.
  4. Utvärdering av oocyten
    1. Utvärdera fullständigheten av avlägsnande av granulosaceller med hjälp av ett mikroskop. Om cellerna inte kunde avlägsnas helt, är kvarhållandet av 5 eller färre granulosaceller acceptabelt vid denna tidpunkt.
      OBS: Om cumulusceller fortfarande är fästa vid oocyten kan resterna avlägsnas senare på dag 3 innan embryot överförs från odlingsmedium i klyvningsstadiet till odlingsmedium i blastocyststadiet.
  5. Efter intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI)26 överförs oocyterna till mikrodroppar med 20–30 μL klyvning av embryokulturer (en oocyt motsvarar en mikrodroppe) med hjälp av överföringspipetter och inkuberas i en inkubator för 37 °C, 5 %CO och 5 % O2 .
    1. Anteckna dagen för ICSI som dag 0. Kontrollera embryona och poängsätt enligt Istanbuls konsensusworkshop om embryobedömning dag 1 för befruktning (cirka 18 timmar), dag 2 (cirka 45 timmar) och dag 3 (cirka 68 timmar) för embryoklyvning27.
  6. Tvätt av embryon
    1. Bered 20–30 μl mikrodroppar av blastocystodlingsmedium för varje embryo täckt med mineralolja i vävnadsodlingsskålar dag 2 i en inkubator med 37 °C, 5 % CO2 och 5 % O2 .
    2. Förbered ytterligare tre mikrodroppar täckta med mineralolja och märk de nya vävnadsodlingsskålarna för tvätt nr 1-3.
    3. Överför dag 3-embryona till tvättmikrodropparna. Aspirera försiktigt och släpp embryona 3 gånger i varje droppe med hjälp av denudationspipetter.
      OBS: Denna procedur kan också hjälpa till att ta bort de kvarvarande granulära cellerna som är fästa vid embryot.
    4. Observera och utvärdera embryona under ett mikroskop på dag 3 innan mediet byttes från odlingsmedium i klyvningsstadiet till blastocystodlingsmedium för morfologisk poängsättning. Om cumuluscellerna fortfarande var fästa vid embryot, pipettera på lämpligt sätt upp och ner i en annan förvärmd och balanserad blastocystodlingsdroppe täckt med mineralolja med en stripperpipett tills cumuluscellerna var helt avlägsnade.
      OBS: Alla fastsittande cumulusceller måste avlägsnas helt på dag 3 innan embryot överfördes från odlingsmediumplattan i klyvningsstadiet till odlingsmedieplattan i blastocyststadiet. Eventuella kvarvarande cumulusceller kommer att störa den slutliga analysen och ge falskt negativa resultat.
  7. Två alternativ för odling av medium
    OBS: IVF-centret kan välja mellan en av två metoder för insamling av odlingsmedium baserat på centrets resurser, krav och preferenser.
    1. Alternativ 1: Embryotvätt och odling
      OBS: Det här alternativet är för IVF -laboratorier som utför vitrifiering på morgonen dag 5.
      1. Överför embryot till förvärmda (37 °C) mikrodroppar av odlingsmedium och tvätta försiktigt varje embryo i serie i 3 mikrodroppar genom pipettering på dag 4 på eftermiddagen.
      2. Överför varje embryo till en unik förvärmd (37 °C) enda mikrodroppe odlingsmedium för provtagning. Volymen av en enda droppe odlingsmedium får inte överstiga 25 μL.
      3. Utför blastocystembryoodling på dag 5/dag 6 vid 37 °C, 5 % CO 2 och 5 % O2 %.
    2. Alternativ 2: Embryotvätt och odling
      OBS: Det här alternativet är för IVF -laboratorier som utför vitrifiering på dag 5 eftermiddag eller dag 6.
      1. Överför embryot till förvärmda (37 °C) mikrodroppar på 10-15 μL odlingsmedium och tvätta försiktigt varje embryo i serie i 3 mikrodroppar genom pipettering på dag 5.
      2. Överför varje embryo till en unik förvärmd (37 °C) enda mikrodroppe odlingsmedium för provtagning. Volymen av en enda droppe odlingsmedium får inte överstiga 15 μL.
      3. Utför blastocystembryoodling på dag 5/dag 6 vid 37 °C och 5 % CO2 .
  8. Provtagning
    1. Justera försiktigt ICM på ett betydande avstånd från laserstrålens målpunkt, som fokuserar på trofyktodermets cellkorsning för att generera ett litet hål i trofektodermet för att frigöra vätskan från blastocoelhålan. Därefter flyttas embryona till fryslösning för kryokonservering enligt den konventionella processen.
    2. Överför odlingsmediet från varje odlat embryo till ett RNas/DNasfritt PCR-rör som innehåller 5 μl celllysbuffert.
    3. Samla in samma mängd odlingsmedium utan att användas för embryoodling som en negativ kontroll. Frys omedelbart alla insamlade prover i flytande kväve och förvara dem sedan vid −80 °C efter insamlingen tills de genomgår NICS-analysen.
  9. Utför vitrifiering enligt beskrivningen i protokollet.

3. Protokoll 2: Bibliotekskonstruktion

  1. Odling medium lys
    1. Späd 1 μl positiv kontroll (10 ng humant gDNA) med 199 μL färskt odlingsmedium. Blanda noggrant och centrifugera röret kort (200 x g i 5 s).
    2. Överför 10 μl av dag 5-dagars 6 blastocystodlingsmedium, utspädd positiv kontroll och färskt odlingsmedium till nya 0,2 ml PCR-rör.
    3. Tillsätt 1 μl MT Enzyme Mix till varje PCR-rör och blanda noggrant genom pipettering och centrifugera omedelbart i 2-3 s vid 200 x g.
    4. Sätt PCR-rören från steg 3.1.3 i en förvärmd NICS Sample Prep Station och kör lyseringsprogrammet enligt följande: 10 min vid 75 °C; 4 min vid 95 °C; 22 °C.
      OBS: Provberedningsstationen är jämförbar med en vanlig PCR-maskin.
      1. Klicka på lysikonen för att öppna inställningsskärmen.
      2. Välj Tube för kontrollläge; ingång 10 μL för provvolym; välj På för Hotlid-kontroll och ange 105 °C för temperaturen. Välj Nej för Paus vid första seg-skärmen. Klicka på OK för att fortsätta.
      3. Vänta tills Återstående tid visar --:-- :--, vilket indikerar slutet på programmet, och klicka sedan på Stopp för att avsluta programmet.
    5. Stoppa programmet när processen är klar. Gå omedelbart vidare till nästa steg.
  2. Förberedelse före biblioteket
    1. Tina Pre-Lib-bufferten till RT. Blanda noggrant genom pipettering och centrifugera omedelbart i 2-3 s vid 200 x g.
    2. Bered en masterblandning för förbiblioteksreaktion enligt följande: tillsätt 2 μL Pre-Lib Enzyme Mix till 60 μL Pre-Lib Buffer, blanda reaktionen noggrant och centrifugera kort.
    3. Tillsätt 60 μL förbiblioteksreaktionsblandning till varje förbehandlat mediumprov från föregående steg. Blanda noggrant med pipettering och centrifugera omedelbart i 2-3 s vid 200 x g.
    4. Placera PCR-rören från steg 3.2.3 i Sample Prep Station och kör förbiblioteksprogrammet enligt följande: 95 °C i 2 min; 12 cykler med 15 °C i 40 s, 22 °C i 40 s, 33 °C i 30 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 40 s, 95 °C i 10 s och 63 °C i 10 s. och håll vid 4 °C.
      1. Klicka på ikonen Pre_Lib för att öppna inställningsskärmen.
      2. Välj Tube för kontrollläge; 70 μL för provvolym. välj På för Kontroll av varmt lock och ange 105 °C för temperaturen. Välj Nej för Paus vid första seg-skärmen. Klicka på OK för att fortsätta.
      3. Vänta tills Återstående tid visar --:-- :--, vilket indikerar slutet på programmet, och klicka på Stopp för att avsluta programmet.
    5. Stoppa programmet när processen är klar. Gå omedelbart vidare till nästa steg.
  3. Förberedelse av bibliotek
    1. Tina biblioteksbufferten till RT. Blanda noggrant genom pipettering och centrifugera omedelbart i 2-3 s vid 200 x g.
    2. Bered en masterblandning för biblioteksreaktion enligt följande: tillsätt 1,6 μl biblioteksenzymblandning till 60 μl biblioteksbuffert, blanda reaktionen noggrant och centrifugera kort.
    3. Tillsätt 60 μL biblioteksreaktionsblandning och 2 μL streckkodsprimer till varje förbiblioteksprodukt från steg 3.2.3. Blanda reaktionen noggrant och centrifugera kort.
    4. Placera PCR-rören från steg 3.2.3 i termocyklern och kör biblioteksförberedelseprogrammet enligt följande: 94 °C i 30 s; 17 cykler med 94 °C under 25 s, 62 °C under 30 s och 72 °C under 45 s). och håll sedan vid 4 °C.
      1. Klicka på Lib_Prep ikonen för att öppna inställningsskärmen.
      2. Välj Tube för kontrollläge; ingång 130 μL för provvolym; välj På för Hotlid-kontroll och ange 105 °C för motsvarande temperatur. Välj Nej för Paus vid första seg-skärmen. Klicka på OK för att fortsätta.
      3. Vänta tills Återstående tid visar --:-- :--, vilket indikerar slutet på programmet, och klicka på Stopp för att avsluta programmet.
  4. Rening av bibliotek
    1. Ta bort Magbeads från förvaring vid 2-8 °C i minst 20 minuter före reningssteget. Virvla och blanda Magbeads i 20 s. Fördela tillräckligt med pärlor för reningssteget i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör och värm pärlorna till RT.
    2. Lägg till 1x Magbeads i varje bibliotek. Blanda genom att pipettera upp och ner ≥10 gånger och inkubera vid RT i 5 min.
      OBS: Tillsätt till exempel 100 μL Magbeads till 100 μL biblioteksprov.
    3. Efter inkubation, centrifugera röret kort och placera det på ett magnetiskt stativ.
    4. Vänta i cirka 5 minuter tills lösningen blir klar. Medan du håller röret på magnetstativet, aspirera försiktigt lösningen och kassera.
    5. Tillsätt 200 μL nyberedd 80 % etanol i röret. Inkubera vid RT i 30 s och avlägsna försiktigt supernatanten. Upprepa en gång till.
    6. Ta bort etanolen så fullständigt som möjligt. Lufttorka pärlorna på magnetstativet i ca 5-10 min vid RT.
    7. Ta bort röret från det magnetiska stativet, tillsätt 17.5 μL elueringsbuffert och virvla röret för att återsuspendera pärlorna. Centrifugera röret kort och inkubera vid RT i 5 minuter.
    8. Placera röret på magnetstativet och vänta tills lösningen blir klar. Överför försiktigt 15 μL supernatanten till ett nytt rör.
  5. Kvantifiering av bibliotek
    1. Kvantifiera renade bibliotek genom att använda fluorometern enligt användarhandboken för qubit dsDNA HS Assay kits28. Bibliotekens avkastning varierar från ~15 till 300 ng.
  6. Poolning av bibliotek
    1. Använd 10 nanogram av varje biblioteksprov för poolning.
  7. Sekvensering
    1. Se användarhandboken för sekvensering (15027617 v01)29.
    2. Renade bibliotekssekvenser på 50 bp i en enda ände på plattformen gav cirka 2 miljoner läsningar för varje prov, och ett sekvenseringsdjup på 0,03 × rekommenderades.
  8. Analys av data
    1. Ange användarnas namn och lösenord på inloggningssidan
    2. När du har loggat in i systemet klickar du på Analys så visas en ny sida. Klicka på Skapa överföring under fliken NICS-A. Välj sedan NGS för plattformen, välj företag, välj NICSInst för reagens, ange projektinformationen i rutan under Projekt-ID, ställ in analysinställningarna och ladda upp filerna. När alla sekvenseringsfiler har laddats upp klickar du på Skicka för att starta analysen (bild 3A).
    3. Klicka på Visa inlämningar för att visa listan över inlämnade projekt. När analysen är klar blir statusen för ett projekt Slutförd och knappen Visa visas i rapportfältet. Klicka på knappen Visa för att visa sammanfattningstabellen för NICS-analys (bild 3B).
    4. Klicka på knappen Exportera rapport för att spara rapporterna (bild 3C).
      OBS: Tre typer av filer kommer att exporteras för varje analys. En grafisk fil som innehåller alla CNV-diagram (Copy Number Variation) för varje kromosom och hela genom, som kommer att lagras under mappen "graph". ett kalkylblad som innehåller exempel på QC-information för den här analyskörningen; En dokumentfil som innehåller de NICS-rapporter som anpassats av användaren. och ett kalkylblad som innehåller exempelsammanfattningsinformationen för den här analyskörningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den aktuella studien tillämpades den föreslagna metoden på en patient. IRB-godkännande och informerat samtycke erhölls före tillämpningen av NICS-analys. Den aktuella studien erhöll 6 blastocyster från patienter och utförde NICS på alla 6 embryon på dag 4 till dag 5 medium. Kromosomavvikelser orsakade av föräldrarnas balanserade translokation upptäcktes i fem av kromosomerna med NICS-analysen; De kunde därför inte användas för överföring (figur 4A–E). NICS-resultaten för de två embryona visade samma karyotyp 45, och XN och -18 (×1) var båda kromosom 18-deletioner (Figur 4A, B). Karyotypen 46, XN, -1p (pter→p21.1, ×1) är bara den korta armen av kromosom 1 pter→p21.1 regiondeletion (Figur 4D).

NICS-resultaten visade karyotyp 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3) och -18(q21.32→qter, ×1), vilket indikerade att både den långa armen på kromosom 18 q21.32→qter-regiondeletion och den korta armen på kromosom 1 pter→p21.2-regionen duplicerades (Figur 4E). Även om karyotyperna 46, XN, +5q (×4) och -8 (×1, mos) är kromosom 5-duplikationer och visar 8 mosaikskillnader, kan NICS-analysen screena alla 24 kromosomer för aneuploidi. Denna process ger en ny metod för överföring av enstaka normala blastocyster av karyotyp.

Figure 1
Figur 1. Avlägsnandet av cumulusceller. A) Oocyter med cumulusceller. B) Oocyterna utan cumulusceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2. Cumulusceller avlägsnas från ett embryo vid D3 innan de överförs till BM. Alla fastsittande cumulusceller måste avlägsnas innan mediet byts ut från den ursprungliga klyvningsmedelplattan för embryoodling till blastocystodlingsplattan, vilket är på dag 3 efter att embryona når 8-cellsstadiet. Cumulusceller som inte avlägsnas kommer att störa den slutliga analysen och ge falskt negativa resultat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3. Analys av data. (A) Det finns olika alternativ för användarapplikationen. För sekvenseringsplattformsföretag kan användare välja Illumina, Ion Torrent eller MGI. Användarna kan välja om könsinformationen ska rapporteras. När du är klar med parameterinställningen ovan klickar du på rutan under Filuppladdning och väljer lämpliga sekvenseringsfiler att ladda upp. För Illumina väljer du filerna med filändelsen fastq.gz. Klicka på Skicka för att starta analysen när du har laddat upp. (B) Vyn i sammanfattningstabellen. Sammanfattningstabellen består av följande information: Exempelnamn: Namnet på varje NICS-exempel visas. Data-QC: Anger om sekvenseringsfilen klarar QC för NICS-analys. AI-betyg: Betyget (A, B eller C) för varje NICS-prov. AI_Rating Tolkning: Utvärdering av embryoimplantationspotential; AI-bedömning: Poängen för varje NICS-exempel; CNV-diagram (hela genomet): Visa CNV-profilerna för alla kromosomer; (C) Sidan Spara rapport. Klicka på knappen Exportera rapport bredvid resultatsammanfattningen. Markera den information som du vill visa i slutrapporten och klicka på Exportera. Rapporterna sparas i mappen Ladda ner på din dator. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4. Embryoscreening och urval med hjälp av NICS från en patient. Totalt sex embryon utvecklades framgångsrikt till blastocyststadiet, och Day4-Day5-odlingsmedium från varje embryo samlades in för NICS-analysen. (A) och (B) är NICS-resultaten för de två blastocystembryona visade samma karyotyp 45, XN, -18(×1) är båda kromosom 18-deletion. (C) visade karyotyp 46, XN, +5q (×4), -8(×1, mos) är kromosom 5 duplikation och 8 mosaik. (D) visade karyotyp 46, XN, -1p (pter→p21.1, ×1) är bara den korta armen av kromosom 1 pter→p21.1 regiondeletion, medan (E) visade karyotyp 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3), -18(q21.32→qter, ×1) är kort arm av kromosom 1 pter→p21.2 regionduplikation och lång arm av kromosom 18 q21.32 → qterregion (F) visade balanserad kromosomsammansättning. X-axeln betyder 22 autosomer i rött och blått, y-axeln anger kopieringsnumret för varje autosom. De grå prickarna är linjalskalan för kopienummer, svar på varje fackfönster och normal karyotyp av kopienummer måste vara 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell S1. Framgångsgraden för DNA-detektion alternativ 1 och alternativ 2. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell S2. Konkordansen mellan NICS och PGT-A i olika alternativ. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modifieringar och felsökning

Om NICS-resultaten är kontaminerade med föräldrarnas genetiska material, se till att alla cumulus-corona radiata-celler tas bort och se till att ICSI utförs för befruktning. Felaktig medielagring eller mallberedningsprocesser undviks, vilket kan försämra DNA. Arbetsutrymmet renades grundligt med DNase- och RNas-reagenser. För att undvika kontaminering från andra embryon odlades alltid ett embryo i en enda droppe medium för att undvika korskontaminering från och med dag 4. Fenomenet med kontaminering minimeras när man fördröjer placeringen av embryon i den slutliga kulturdroppen30,31,32,33. För att minimera kontaminering från modern modifierade Kuznyetsov34 procedurerna för embryoodling från dag 0 till dag 4, inklusive noggrant avlägsnande av kvarvarande koronaceller genom pipettering och spolning.

Lane et al.30 visar att när man tar embryoodlingsmediet från dag 4 till dag 5 förbättras noggrannheten för euploididetektion, embryots ploidikonsistens är mer än 95 % och könskromosomens konsistens når 100 %. Lledo et al.33 fann att koincidensfrekvensen mellan odlingsmediet dag 3-dag 5 och TE-proverna var 74,6 % och 92,0 % när embryon odlades från dag 4 till dag 6.

Våra interna data stöder också denna slutsats, vilket framgår av tabell S1. Jämfört med den konventionella odlingsmetoden dag 3-dag 5 avlägsnades granulosacellerna ytterligare på grund av ytterligare ett byte av odlingsmedium dag 4 eller dag 5. Vi tillhandahåller interna data (tabell S1) som visar att våra två metoder (alternativ 1 och alternativ 2) har god konsistens jämfört med PGT-A, vilket är bättre än provtagningsmetoden utan att ta bort CC grundligt.

IF-amplifierade produkter dök upp i den negativa kontrollen, och externa DNA-material kan ha kontaminerat reagenset eller arbetsutrymmet. Arbetsytan ska rengöras med DNA/RNA-avlägsnande reagenser, nukleasfria material ska användas och reagenserna ska aliciteras efter första användningen.

Skillnaderna i framgångsgrad mellan alternativ 1 och alternativ 2 diskuteras i tabell S1 och tabell S2.

Begränsningar för NICS-analysen

Det finns två huvudsakliga begränsningar för nätverkskort. 1) Före ICSI måste alla cumulusceller (vanligtvis maternellt ursprung, vanligtvis normal kromosomsammansättning) avlägsnas. Om avlägsnandet är ofullständigt kan cumuluscellerna frigöra DNA under embryoutvecklingen och det externa DNA:t förstärks, vilket kan vara orsaken till falskt negativ upptäckt. 2) Det är svårt att ta bort spermierna som är fästa vid zona pellucida, och NICS-proceduren rekommenderas starkt att utföras med ICSI. Även om regelbundet byte av klyvningsmedia på dag 3 kan minska risken för kontaminering på grund av cumulusceller och överflödiga spermier, måste denna kontaminering minimeras om NICS används i klinisk IVF. En metod för att detektera NICS i IVF-embryon har dock utvecklats, inklusive funktionen att känna igen exogent DNA, vilket kommer att demonstreras inom en snar framtid.

I denna studie jämfördes inte skillnaderna mellan olika medier eftersom storskaliga kliniska prövningar har jämfört odlingsmedier. Åtta centra använde 4 olika odlingsmedier, sekventiella och kontinuerliga, och 2 olika procentandelar albumintillskott (5 % och 10 %), och dessa skillnader hade inga signifikanta effekter på noggrannheten hos embryonala cfDNA-resultat31. Dessa fynd stöder den potentiella tillämpligheten av embryonal cfDNA-analys på alla IVF-laboratorier när de arbetar enligt det specifika protokollet.

Betydelse i förhållande till befintliga metoder

NICS-metoden undviker embryobiopsi och förbättrar därmed säkerheten vid användning avsevärt. Jämfört med blastocyster är NICS en enkel, tidsbesparande, känslig och reproducerbar preimplantatorisk screeningteknik som är lämplig för assisterad befruktning av populationer med hög sannolikhet för aneuploidi. Till skillnad från invasiv biopsi, som kräver betydande och professionell kunskap för blastocystbiopsiproceduren, kan NICS användas i stor utsträckning eftersom dess enkla insamling av använt medium endast följer den vanliga driften av IVF19 och det kräver inte PGS/PGD-kvalificering i vissa länder.

Framtida användningsområden

NICS har potential för bred tillämpbarhet för kromosomscreening vid klinisk IVF, inte bara för ICSI utan även för IVF-embryon. Även om ICSI rekommenderas starkt, krävs metoder för att ta bort spermier som är fästa vid zona pellucida för att förhindra påverkan av spermier.

Morfologisk bedömning är en traditionell metod för embryoutvärdering, men i de flesta fall kan kromosomalt onormala embryon se morfologiskt lika kromosomalt normala (euploida) embryon. Att kombinera morfologisk bedömning med NICS-analysen vid överföring av ploida embryon med god morfologi till livmodern kan förbättra den pågående graviditetsfrekvensen och antalet levande födslar. En randomiserad klinisk prövning kommer att genomföras för att utvärdera den kliniska effekten av överföring av enstaka embryon med hjälp av NICS-teknik.

Kritiska steg i protokollet

Alla cumulus-corona radiata-celler måste avlägsnas från oocyterna före befruktningen. Oocyterna befruktades genom intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI). Man undvek att tillsätta proteiner/kosttillskott av mänskligt ursprung till odlingsmediet. Odlingsmediet byttes ut dag 4 och samlades in dag 5-dag 6 när blastocysterna expanderade helt. Embryon odlades i individuella droppar av odlingsmedium med början dag 4. Vid uppsamling av odlingsmediet byttes överföringspipetter mellan proverna för att undvika kontaminering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang och Sijia Lu är anställda av Yikon Genomics Co., Ltd.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Shiping Bo och Shujie Ma för deras hjälp med NGS-dataanalys. Finansiering: detta arbete stöddes av National Key Research and Development Program (Grant No. 2018YFC1003100).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
  10. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicine. 94 (12), e669 (2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015).
  29. Miseq system use guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html (2016).
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).

Tags

Kromosomscreening humana preimplantatolära embryon använt odlingsmedium provinsamling kromosomal ploidyanalys in vitro-fertilisering (IVF) preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) trofektoderm (TE) inre cellmassa (ICM) falska positiva och negativa NICS-teknik DNA-sekvensering odlingsmediumprovtagning helgenomamplifiering (WGA) biblioteksförberedelse NGS-dataanalys kryokonservering IVF-laboratorium

Erratum

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Kromosomscreening av humana preimplantatoriska embryon med hjälp av använt odlingsmedium: provsamling och kromosomal ploidyanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu,… More

Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter