Summary
Isolering af tungmetalresistente mikrober fra geotermiske kilder er et varmt emne for udviklingen af bioremediering og miljøovervågningsbiosystemer. Denne undersøgelse giver en metodologisk tilgang til isolering og identifikation af tungmetaltolerante bakterier fra varme kilder.
Abstract
Geotermiske kilder er rige på forskellige metalioner på grund af samspillet mellem sten og vand, der finder sted i det dybe akvifer. På grund af sæsonvariation i pH og temperatur observeres der desuden periodisk udsving i elementsammensætningen inden for disse ekstreme miljøer, hvilket påvirker de miljømæssige mikrobielle samfund. Ekstremofile mikroorganismer, der trives i vulkanske termiske ventilationskanaler, har udviklet resistensmekanismer til at håndtere flere metalioner, der er til stede i miljøet, og dermed deltage i komplekse metalbiogeokemiske cyklusser. Desuden har ekstremofiler og deres produkter fundet et omfattende fodfæste på markedet, og det gælder især for deres enzymer. I denne sammenhæng er deres karakterisering funktionel for udviklingen af biosystemer og bioprocesser til miljøovervågning og bioremediering. Hidtil udgør isolering og dyrkning under laboratorieforhold af ekstremofile mikroorganismer stadig en flaskehals for fuldt ud at udnytte deres bioteknologiske potentiale. Dette arbejde beskriver en strømlinet protokol for isolering af termofile mikroorganismer fra varme kilder samt deres genotypiske og fænotypiske identifikation gennem følgende trin: (1) Prøveudtagning af mikroorganismer fra geotermiske steder ("Pisciarelli", et vulkansk område i Campi Flegrei i Napoli, Italien); 2) Isolering af tungmetalresistente mikroorganismer 3) Identifikation af mikrobielle isolater (4) Fænotypisk karakterisering af isolaterne. De metoder, der er beskrevet i dette arbejde, kan generelt også anvendes til isolering af mikroorganismer fra andre ekstreme miljøer.
Introduction
De ekstreme miljøer på vores planet er fremragende kilder til mikroorganismer, der er i stand til at tolerere barske forhold (dvs. temperatur, pH, saltholdighed, tryk og tungmetaller)1,2, idet de er Island, Italien, USA, New Zealand, Japan, Centralafrika og Indien, de bedst anerkendte og studerede vulkanske områder 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiler har udviklet sig i barske miljøer i en række temperaturer fra 45 ° C til 80 ° C 10,11,12. Termofile mikroorganismer, der enten tilhører de arkæale eller bakterielle kongeriger, er et reservoir til undersøgelse af biodiversitet, fylogenese og produktion af eksklusive biomolekyler til industrielle anvendelser 13,14,15,16. Faktisk har den fortsatte industrielle efterspørgsel på det globale marked i de sidste årtier tilskyndet til udnyttelse af ekstremofiler og termozymer til deres diversificerede anvendelser inden for flere bioteknologiske områder 17,18,19.
Varme kilder, hvor organismer lever i konsortier, er rige kilder til biodiversitet og repræsenterer således et attraktivt levested for at studere mikrobiel økologi20,21. Desuden koloniseres disse vulkanske metalrige områder almindeligvis af mikroorganismer, der har udviklet tolerancesystemer til at overleve og tilpasse sig tilstedeværelsen af tungmetaller22,23 og er derfor aktivt involveret i deres biogeokemiske cyklusser. I dag betragtes tungmetaller som prioriterede forurenende stoffer for mennesker og miljø. De tungmetalresistente mikroorganismer er i stand til at opløse og udfælde metaller ved at omdanne dem og ombygge deres økosystemer24,25. Forståelsen af de molekylære mekanismer for tungmetalresistens er et varmt emne for det presserende behov for at udvikle nye grønne tilgange 26,27,28. I den forbindelse udgør opdagelsen af nye tolerante bakterier udgangspunktet for at udvikle nye strategier for miljømæssig bioremediering24,29. Som led i bestræbelserne på at udforske hydrotermiske miljøer gennem mikrobiologiske procedurer og øge kendskabet til den rolle, som genet/generne, der understøtter tungmetaltolerancen, spiller, blev der foretaget en mikrobiel screening i det varme kildeområde Campi Flegrei i Italien. Dette tungmetalrige miljø viser en kraftig hydrotermisk aktivitet, fumarol og kogende puljer, variabel i pH og temperatur i afhængighed af sæsonbestemthed, nedbør og underjordiske geologiske bevægelser30. I dette perspektiv beskriver vi en let anvendelig og effektiv måde at isolere bakterier, der er resistente over for tungmetaller, for eksempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (navngivet som isolat 1) og Alicyclobacillus mali FL1832 (navngivet som isolat 2) fra Pisciarelli-området i Campi Flegrei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveudtagning af mikroorganismer fra geotermiske steder
- Vælg stedet for prøveudtagning ved hjælp af som kriterium steder med ønsket temperatur og pH. Mål de fysiske parametre gennem en digital termoelementsonde, indsæt den i de valgte puljer eller mudder.
- Saml 20 g jordprøver (i dette tilfælde fra mudder i det hydrotermiske sted Pisciarelli Solfatara), og saml dem op med en steriliseret ske. Tag mindst to prøver for hvert valgt sted.
- Kom prøverne i 50 ml sterile polypropylenrør og luk straks.
- Mål pH og temperatur med en digital termoelementsonde ved direkte at indsætte den i prøveudtagningsstedet. Efter brug skylles sonden forsigtigt med deioniseret vand.
2. Isolering af tungmetalresistente mikroorganismer
BEMÆRK: Udfør trin 2.1-2.7 under en steril biologisk hætte.
- Inokuler 2 g af hver indsamlet prøve i 50 ml frisklavet Luria-Bertani-medium (LB), hvori pH-værdien er blevet justeret til 4 eller 7 ved tilsætning af HCl eller NaOH.
- Prøverne inkuberes ved samme temperatur på prøveudtagningsstedet og ved ±5 °C (55 °C og 60 °C for Pisciarelli-prøver) i en temperaturstyret orbitalryster i 24 timer med en rystehastighed på 180 o/min.
- Plade 200 μL af de dyrkede prøver på LB-agar (pH 4 eller pH 7) og inkuberes i statisk tilstand i 48 timer ved 55 °C eller 60 °C.
- Isoler enkelte kolonier, og gentag stribebelægningscyklusser (trin 2.3 og 2.4) mindst tre gange.
- For at forberede -80 ° C frosne cellelagre skal kulturerne dyrkes natten over (ON) og tilsættes 20% glycerol til de dyrkede celler (i et endeligt volumen på 1 ml); Brug en blanding af acetone og tøris til hurtig frysning.
- For at fremstille et inokulum fra en glycerolstamme inokuleres 50 μL i 50 ml LB (pH 4 eller pH 6) og inkuberes ved 55 °C eller 60 °C i orbitalrysteren ved 180 o / min ON.
- For at opnå en vækstprofil fortyndes en forkultur (opnået fra trin 2.6) til 0,1 OD600 nm i 10 ml LB (pH 4 eller pH 6), cellerne dyrkes ved 55 °C eller 60 °C i 16 timer i orbitalrysteren, og OD600 nm måles med 30 minutters mellemrum.
- Konstruer en vækstkurve ud fra de data, der er opnået i trin 2.7 med tid (min) på X-aksen og OD600 nm på Y-aksen.
- Realiser den samme vækstkurve beskrevet i trin 2,7 og 2,8, men varierer pH (± 1 enhed) af kulturmediet (f.eks. pH 3 og 5 for prøver dyrket ved pH 4) for at bestemme den optimale pH for laboratorieforhold.
3. Identifikation af mikrobielle isolater
- Fremstilling af genomisk DNA
- Inokuler isolatet stribet fra glycerolstammen i 50 ml LB-medium (pH 4 eller pH 6) og vokse i en orbitalryster ved 55 ° C eller 60 ° C ved 180 o / min ON.
- Høst ON-kulturen ved centrifugering i 10 min ved 5000 x g. Kassér supernatanten.
- Forbered 10 ml bakterielysebuffer sammensat af: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 og lysozym (20 mg / ml) umiddelbart før brug.
- Resuspend pellet i 180 μL af bakterier lysis buffer. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Følg de retningslinjer, der er angivet af et genomisk DNA-oprensningssæt (Table of Materials) for at ekstrahere genomisk DNA.
- Kvantificer det ekstraherede genomiske DNA og dets renhed ved UV-Vis-måling. For renhed bestemmes forhold-OD 260/280 nm og OD 260/230 nm.
- Vurder integriteten af det genomiske DNA ved at indlæse 200 ng af hver prøve på en 0,8% agarosegel og sammenligne størrelsesfordelingen med en højvægtsmolekylmarkør.
- Kommissionen til en ekstern tjeneste 16S rRNA-fragmentforberedelse, sekventering og komparativ analyse af den opnåede sekvens (1000 bp) med dem, der er til stede i nukleotiddatabasen fra US National Center for Biotechnology Information (NCBI)33.
- For at bekræfte data om 16S rRNA-sekventering skal du også udføre automatiseret ribotyping på det fordøjede kromosomale DNA (ekstern service, Table of Materials).
- I det tilfælde, hvor artsidentifikationen ikke kun kan bestemmes med ribotypingdata, skal der bestilles en MALDI-TOF MS-analyse til identifikation af fedtsyrer.
- For at udføre en fylogenetisk analyse af den identificerede slægt analyseres 16S rRNA-sekvensen af isolatet med BLASTn34. Sekvenser med identiteter fra 99% til 97% skal bruges til at opbygge en multipel sekvensjustering ved hjælp af CLUSTAL Omega35. Konstruer et naboslutningstræ ved hjælp af standardindstillingen ClustalW2 (Simple Phylogeny).
4. Modtagelighed for tungmetaller og antibiotika
- Inokuler isolatet fra en glycerolstamme (se trin 2.5) og dyrk det i 200 ml LB under de optimale pH- og temperaturforhold, der tidligere er bestemt.
- Fortynd hver forkultur ved 0,1 OD600 nm i 5 ml LB-medium (ved passende pH) indeholdende stigende koncentrationer af tungmetaller. Koncentrationerne varierer fra 0,01-120 mM for tungmetaller [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] eller 0,5-1 mg/ml for antibiotika [Ampicillin, Bacitracin, Chloramphenicol, Ciprofloxacin, Erythromycin, Kanamycin, Streptomycin, Tetracyclin og Vancomycin].
- Udfør tungmetal- og antibiotikabehandlinger separat. Brug et 50 ml polypropylenrør og dyrk cellerne i en temperaturstyret orbitalryster med en rystehastighed på 180 o / min ved 55 ° C eller 60 ° C i 16 timer for hver tilstand / behandling.
- Beregn minimum hæmmende koncentration (MIC) enten for antibiotika eller tungmetaller ved at identificere koncentrationsværdierne i rørene, hvor mikrobiel vækst ikke forekommer, dvs. bestemme de værdier, der fuldstændigt hæmmer cellevæksten efter 16 timer.
- Kontrollér, at koncentrationen er hæmmende og ikke dødelig for cellerne, ved at udlægge 200 μL af den dyrkning, der dyrkes til den værdi, der betragtes som MIC på LB-agarplader (ved passende pH og temperatur) og verificere tilstedeværelsen af kolonier efter ON-inkubation.
BEMÆRK: Da dyrkningen på LB agarplade kun er levedygtig ved 4 °C i et par uger, blev glycerollagrene fremstillet og opbevaret ved -80 °C for at bevare isolaterne i længere tid. Til MIC-bestemmelse blev der udført mindst tre uafhængige replikater ved hjælp af uafhængige kulturer. Standardafvigelsen blev beregnet blandt tredobbelte eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøveudtagningssted
Denne protokol illustrerer en metode til isolering af tungmetalresistente bakterier fra en varm kilde. I denne undersøgelse blev Pisciarelli-området, et syre-sulfidisk geotermisk miljø, anvendt som prøveudtagningssted (figur 1). Dette økosystem er kendetegnet ved strømmen af aggressive svovlholdige væsker afledt af vulkanske aktiviteter. Det er blevet påvist, at de mikrobielle samfund i syre-sulfidiske geotermiske systemer udsættes for ekstremt selektivt tryk forårsaget af tilstedeværelsen af høje koncentrationer af tungmetaller. Prøverne blev indsamlet i to forskellige perioder af året (april og september) fra2,21 en mudderpøl marginal med hensyn til en boblende mudderpøl. I mudderbassinet blev der registreret udsving i pH-værdierne (~pH 6 i april og ~pH 5 i september), mens temperaturen var ~55 °C i begge tilfælde. Imidlertid blev der også registreret højere temperaturer i mudderbassinet (~ 70 ° C) i andre år32.
Isolation og identifikation
De indsamlede prøver blev podet i LB-medium og inkuberet i 24 timer ved 55 °C og 60 °C som tidligere rapporteret, hvorefter laboratoriebetingelserne for celleprøvernes vækst blev sat i hælene, så de kunne efterligne de kemisk-fysiske forhold i miljøet. For at favorisere cellevækst blev enkeltkolonier stribet på pladen og isoleret efter flere fortyndinger (mindst 3) i et rigt flydende medium; de isolerede stammer viste deres optimale væksttemperatur ved 55 °C og 60 °C (figur 2) . For at identificere de nye isolater blev der udført et genomisk DNA-præparat, og 16S rRNA-sekventering og fedtsyremassespektrometrianalyse blev udført som en ekstern tjeneste. Som rapporteret er analysen af fedtsyrerne en kraftfuld bioanalytisk metode, der hjælper med præcis identifikation af bakterier, når de kombineres med andre tilgange36. Flere justeringer af 16S rRNA blev brugt til at bygge det fylogenetiske træ for at identificere de nærmeste slægtninge37.
Test af følsomhed over for tungmetaller
Sameksistensen af giftige molekyler karakteriserer solfataririske miljøer. Især er varme kilder i Pisciarelli kendetegnet ved høje niveauer af CO2,H2S,NH4 i sameksistens med As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Af denne grund blev en fænotypisk karakterisering af de isolerede mikroorganismer udført i nærvær af en stigende koncentration af tungmetaller, som rapporteret i tabel 1. Interessant nok viste isolat 1 højere tolerance over for As (V) og V (V). Den høje modstandsdygtighed over for både arsenat og vanadat kan skyldes deres kemiske strukturer; faktisk ligner begge ioner fosfationerne, hvilket tyder på, at V (V) og As (V) kunne tages op af celler gennem fosfattransportsystemer. Disse isolater viste sig også at være resistente over for Cd(II), selv om MIC-værdien var relativt lav. Dette resultat kan forklares med fraværet af Cd(II) i puljen. Selvom de to mikroorganismer blev udtaget på samme sted, viste de forskellige tungmetalresistensprofiler. De blev imidlertid udtaget i forskellige perioder, hvilket peger på den sæsonafhængige variation i tungmetalkoncentrationen som den vigtigste drivkraft, der former sammensætningen af de mikrobielle samfund og deres differentielle modstandsdygtighed over for tungmetaller39. Ud fra disse sammenlignende data har det vist sig, at isolat 1 har en stærk resistens over for As(V), mens isolat 2 for As(III). Yderligere genetiske undersøgelser er nødvendige for at optrævle de molekylære resistensmekanismer og bedre forstå, hvordan fænotyperne påvirkes af det selektive tryk fra varme kilder.
Test af antibiotikaresistens
De mikrobielle stammer, der udvikles i ekstreme miljøer, udviser normalt resistens over for forskellige antibiotika. Sammenhængen mellem tungmetalresistensen og antibiotika er velkendt40. Derfor testede vi resistensen over for antibiotika for begge isolater (tabel 2). Isolat 1 viste høj følsomhed over for alle de testede antibiotika, selv når der blev anvendt lave koncentrationer. I modsætning hertil er isolat 2 resistent over for alle de testede antibiotika, med undtagelse af chloramphenicol og tetracyclin. Interessant nok var de bestemte MIC-værdier over for ampicillin, erythromycin, kanamycin, streptomycin og vancomycin sammenlignelige med dem for andre antibiotikaresistente bakterier og endnu højere for bacitracin og ciprofloxacin41. Disse fascinerende data fortjener yderligere undersøgelser; Sandsynligvis har mikroorganismen på grund af tilfældige mutationer eller horisontal genoverførsel erhvervet antibiotikaresistens, hvilket kan repræsentere en selektiv fordel under sådanne ekstreme miljøforhold.
Figur 1. Prøveudtagningssted: solfatært område i Pisciarelli, Campi Flegrei (Napoli, Italien). Prøveudtagningsstedet er placeret ved 40° 49' 45,3" N - 14° 08' 49,9 E, i det geotermiske område Af Pisciarelli fumarole. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Skematisk repræsentation af den eksperimentelle procedure. Mikroorganismer udtages prøver i varme kilder, dyrkes i laboratoriet, isoleres gennem gentagen striber og plettering og genotypisk identificeres ved 16S rRNA-sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Metal ioner | Isoler 1 | Isoler 2 |
| Som (III) | 1,9 mM | 41 mM |
| Som (V) | 117 mM | 11 mM |
| Cd (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | n.a. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | n.a. |
| Cu (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 mM | n.a |
Tabel 1. MIC-værdier over for tungmetalioner af isolaterne. IC'er betragtes som de minimale koncentrationsværdier, der fuldstændigt hæmmer cellevækst efter 16 timer; værdierne rapporteres som gennemsnit af tre eksperimenter.
| Antibiotika | Isoler 1 | Isoler 2 |
| Ampicillin | u.å. | 20 μg/ml |
| Bacitracin | u.å. | 700 μg/ml |
| Chloramphenicol | u.å. | <0,5 μg/ml |
| Ciprofloxacin | u.å. | >1 mg/ml |
| Erythromycin | u.å. | 70 μg/ml |
| Kanamycin | u.å. | 80 μg/ml |
| Streptomycin | u.å. | 70 μg/ml |
| Tetracyklin | u.å. | <0,5 μg/ml |
| Vancomycin | u.å. | 1 μg/ml |
Tabel 2. MIC-værdier mod antibiotika af isolaterne. MIC'er betragtes som de minimale koncentrationer, der fuldstændigt hæmmer cellevæksten efter 16 timer; værdierne rapporteres som gennemsnit af tre eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varme kilder indeholder en uudnyttet mangfoldighed af mikrobiomer med lige så forskellige metaboliske kapaciteter12. Udviklingen af strategier for isolering af mikroorganismer, der effektivt kan omdanne tungmetaller til mindre giftige forbindelser10 , repræsenterer et forskningsområde af stigende interesse på verdensplan. Dette papir har til formål at beskrive en strømlinet tilgang til screening og isolering af mikrober med evnen til at modstå giftige kemikalier. Den beskrevne metode kan let ændres til at isolere mikrober fra forskellige miljøkilder såsom vand, mad, jord eller sediment. Der er dog nogle begrænsninger i denne teknik relateret til afhængigheden af mikrobiel dyrkning. Derfor ville denne opsætning ikke være egnet til isolering af bakterier fra et miljø, der ikke let kan dyrkes. En måde at overvinde dette problem på er at bruge forskellige bakteriemedier (dvs. selektive medier eller prætilpasningsstrategier) og længere inkubationstider42.
Ikke desto mindre forventes størstedelen af de arter, der er af interesse for bioremediering, at vokse under de betingelser, der er beskrevet heri. Denne protokol har nogle fordele i forhold til traditionelle pletteringsteknikker, i betragtning af at selektive agarmedier til kemikalier hidtil er ukendte. Brugen af MIC til at identificere resistente mikrober er en hurtig strategi, der skal udnyttes på individuelle isolater, der åbner vejen for karakterisering af nye arter eller nye stammer. Denne undersøgelse viser nytten af en sådan metode til at udvælge miljømikroorganismer, der kan bidrage til effektiv bioremediering ved at inaktivere de forurenende stoffer og omdanne dem til harmløse produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 og af GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italien. Vi takker Dr. Monica Piochi og Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italien) for identifikation og karakterisering af geotermisk sted.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
