Summary
Ağır metale dayanıklı mikropların jeotermal kaynaklardan izole edilmesi, biyoremediasyon ve çevresel izleme biyosistemlerinin geliştirilmesi için sıcak bir konudur. Bu çalışma, kaplıcalardan ağır metal toleranslı bakterilerin izole edilmesi ve tanımlanması için metodolojik bir yaklaşım sunmaktadır.
Abstract
Jeotermal kaynaklar, derin akiferde meydana gelen kaya ve su arasındaki etkileşim nedeniyle çeşitli metal iyonları bakımından zengindir. Ayrıca, pH ve sıcaklıktaki mevsimsellik değişimi nedeniyle, bu aşırı ortamlarda element bileşimindeki dalgalanma periyodik olarak gözlenir ve çevresel mikrobiyal toplulukları etkiler. Volkanik termal menfezlerde gelişen ekstremofilik mikroorganizmalar, çevrede bulunan birkaç metal iyonunu işlemek için direnç mekanizmaları geliştirmiş ve böylece karmaşık metal biyojeokimyasal döngülerine katılmışlardır. Dahası, ekstremofiller ve ürünleri pazarda geniş bir dayanak noktası bulmuşlardır ve bu özellikle enzimleri için geçerlidir. Bu bağlamda, karakterizasyonları, çevresel izleme ve biyoremediasyon için biyosistemlerin ve biyosüreçlerin geliştirilmesinde işlevseldir. Bugüne kadar, ekstremofilik mikroorganizmaların laboratuvar koşullarında izolasyonu ve yetiştirilmesi, biyoteknolojik potansiyellerini tam olarak kullanmak için hala bir darboğazı temsil etmektedir. Bu çalışma, termofilik mikroorganizmaların kaplıcalardan izole edilmesinin yanı sıra genotipik ve fenotipik tanımlamaları için aşağıdaki adımlarla kolaylaştırılmış bir protokolü açıklamaktadır: (1) Jeotermal bölgelerden mikroorganizmaların örneklenmesi ("Pisciarelli", Napoli, İtalya'daki Campi Flegrei'nin volkanik bir alanı); (2) Ağır metal dirençli mikroorganizmaların izolasyonu; (3) Mikrobiyal izolatların tanımlanması; (4) İzolatların fenotipik karakterizasyonu. Bu çalışmada açıklanan metodolojiler genellikle mikroorganizmaların diğer aşırı ortamlardan izolasyonu için de uygulanabilir.
Introduction
Gezegenimizdeki aşırı ortamlar, sert koşulları (yani sıcaklık, pH, tuzluluk, basınç ve ağır metalleri) tolere edebilen mükemmel mikroorganizma kaynaklarıdır1,2, İzlanda, İtalya, ABD, Yeni Zelanda, Japonya, Orta Afrika ve Hindistan, en iyi tanınan ve çalışılan volkanik alanlar 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiller zorlu ortamlarda 45 °C ila 80 °C 10,11,12 arasındaki sıcaklıklarda evrimleşmiştir. Arkeal veya bakteri krallıklarına ait termofilik mikroorganizmalar, biyoçeşitliliğin, filogenezin incelenmesi ve endüstriyel uygulamalar için özel biyomoleküllerin üretimi için bir rezervuardır 13,14,15,16. Gerçekten de, son yıllarda, küresel pazardaki sürekli endüstriyel talep, ekstremofillerin ve termozimlerin çeşitli biyoteknolojik alanlardaki çeşitlendirilmiş uygulamaları için sömürülmesini teşvik etmiştir 17,18,19.
Organizmaların konsorsiyumlarda yaşadığı kaplıcalar, zengin biyolojik çeşitlilik kaynaklarıdır, bu nedenle mikrobiyal ekolojiyi incelemek için çekici bir yaşam alanını temsil eder20,21. Dahası, bu volkanik metal bakımından zengin alanlar, hayatta kalmak ve ağır metallerin varlığına uyum sağlamak için tolerans sistemleri geliştiren mikroorganizmalar tarafından yaygın olarak kolonize edilir22,23 ve bu nedenle biyojeokimyasal döngülerine aktif olarak katılırlar. Günümüzde, ağır metaller insanlar ve çevre için öncelikli kirleticiler olarak kabul edilmektedir. Ağır metale dirençli mikroorganizmalar, metalleri dönüştürerek ve ekosistemlerini yeniden şekillendirerek çözündürebilir ve çökeltebilir24,25. Ağır metal direncinin moleküler mekanizmalarının anlaşılması, yeni yeşil yaklaşımların geliştirilmesinin aciliyeti için sıcak bir konudur26,27,28. Bu bağlamda, yeni toleranslı bakterilerin keşfi, çevresel biyoremediasyon için yeni stratejiler geliştirmenin başlangıç noktasını temsil etmektedir24,29. Mikrobiyolojik prosedürler yoluyla hidrotermal ortamları keşfetme ve ağır metal toleransını destekleyen gen (ler) in rolü hakkındaki bilgileri artırma çabalarına eşlik ederken, İtalya'daki Campi Flegrei'nin kaplıca bölgesinde mikrobiyal bir tarama yapıldı. Bu ağır metal bakımından zengin ortam, mevsimsellik, yağış ve yeraltı jeolojik hareketlerine bağlı olarak pH ve sıcaklıkta değişken olan güçlü bir hidrotermal aktivite, fumarol ve kaynar havuzlar gösterir30. Bu perspektifte, Campi Flegrei'nin Pisciarelli bölgesinden Geobacillus stearothermophilus GF16 31 (izolat 1 olarak adlandırılır) ve Alicyclobacillus mali FL1832 (izolat2 olarak adlandırılır) gibi ağır metallere dirençli bakterileri izole etmenin uygulaması kolay ve etkili bir yolunu açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Jeotermal alanlardan mikroorganizmaların örneklenmesi
- İstenilen sıcaklık ve pH'a sahip yerleri kriter olarak kullanarak örnekleme için yeri seçin. Fiziksel parametreleri, seçilen havuzlara veya çamurlara yerleştirerek dijital bir termokupl probu ile ölçün.
- 20 g toprak örneği toplayın (bu durumda, Pisciarelli Solfatara'nın hidrotermal bölgesindeki çamurdan), sterilize edilmiş bir kaşıkla toplayın. Seçilen her site için en az iki örnek alın.
- Numuneleri 50 mL steril polipropilen tüplere koyun ve hemen kapatın.
- Dijital termokupl probu ile pH ve sıcaklığı doğrudan numune alma sahasına yerleştirerek ölçün. Kullandıktan sonra, probu deiyonize su ile dikkatlice durulayın.
2. Ağır metale dirençli mikroorganizmaların izolasyonu
NOT: 2.1-2.7 arasındaki adımları steril bir biyolojik başlık altında gerçekleştirin.
- Toplanan her numunenin 2 gramını, HCl veya NaOH ilavesiyle pH'ın 4 veya 7'ye ayarlandığı 50 mL'lik taze hazırlanmış Luria-Bertani ortamına (LB) aşılayın.
- Numuneleri, numune alma sahasının aynı sıcaklığında ve ±5 °C'de (Pisciarelli numuneleri için 55 °C ve 60 °C), sıcaklık kontrollü bir yörüngesel çalkalayıcıda 24 saat boyunca 180 rpm'lik bir sarsıntı hızıyla inkübe edin.
- LB agar (pH 4 veya pH 7) üzerinde yetiştirilen numunelerin 200 μL'lik plakası ve 55 °C veya 60 °C'de 48 saat boyunca statik durumda inkübe edilir.
- Tek kolonileri izole edin ve çizgi kaplama döngülerini (adım 2.3 ve 2.4) en az üç kez tekrarlayın.
- -80 °C dondurulmuş hücre stokları hazırlamak için, kültürleri gece boyunca (AÇIK) büyütün ve yetiştirilen hücrelere% 20 gliserol ekleyin (1 mL'lik son hacimde); hızlı dondurma için aseton ve kuru buz karışımı kullanın.
- Bir gliserol stoğundan bir inokülum hazırlamak için, 50 mL LB (pH 4 veya pH 6) içinde 50 μL aşılayın ve 180 rpm AÇIK'ta orbital çalkalayıcıda 55 ° C veya 60 ° C'de inkübe edin.
- Bir büyüme profili elde etmek için, bir ön kültürü (adım 2.6'dan elde edilen) 10 mL LB (pH 4 veya pH6 ) içinde 0.1 OD 600 nm'ye kadar seyreltin, hücreleri yörüngesel çalkalayıcıda 16 saat boyunca 55 ° C veya 60 ° C'de büyütün ve OD600 nm'yi 30 dakikalık aralıklarla ölçün.
- Adım 2.7'de elde edilen verilerden, X ekseninde zaman (min) ve Y ekseninde OD600 nm ile bir büyüme eğrisi oluşturun.
- Adım 2.7 ve 2.8'de açıklanan aynı büyüme eğrisini gerçekleştirin, ancak laboratuvar koşulları için en uygun pH'ı belirlemek üzere kültür ortamının pH'ını (± 1 birim) (örneğin, pH 4'te yetiştirilen numuneler için pH 3 ve 5) değiştirin.
3. Mikrobiyal izolatların tanımlanması
- Genomik DNA'nın hazırlanması
- Gliserol stoğundan çizgilenen izolatı 50 mL LB ortamında (pH 4 veya pH 6) aşılayın ve 180 rpm AÇIK'ta 55 ° C veya 60 ° C'de bir yörüngesel çalkalayıcıda büyüyün.
- ON kültürünü 5000 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleme ile hasat edin. Süper natantı atın.
- Kullanımdan hemen önce 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA,% 1.2 Triton X-100 ve lizozim (20 mg / mL) içeren 10 mL bakteri lizis tamponu hazırlayın.
- Peleti 180 μL bakteri lizis tamponunda yeniden askıya alın. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Genomik DNA'yı çıkarmak için bir Genomik DNA Saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) tarafından belirtilen yönergeleri izleyin.
- Ekstrakte edilen genomik DNA'yı ve saflığını UV-Vis ölçümü ile ölçün. Saflık için -OD 260/280 nm ve OD 260/230 nm oranlarını belirleyin.
- Her bir numunenin 200 ng'sini % 0.8'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyerek ve boyut dağılımını yüksek ağırlıklı bir moleküler belirteçle karşılaştırarak genomik DNA'nın bütünlüğünü değerlendirin.
- ABD Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'nin (NCBI) nükleotid veritabanında bulunanlarla elde edilen dizinin (1000 bp) 16S rRNA fragmanının hazırlanması, dizilenmesi ve karşılaştırmalı analizini harici bir hizmete komisyon33.
- 16S rRNA diziliminin verilerini doğrulamak için, sindirilmiş kromozomal DNA üzerinde otomatik ribotipleme de yapın (harici hizmet, Malzeme Tablosu).
- Tür tanımlamasının sadece ribotipleme verileriyle belirlenemediği durumlarda, yağ asidi tanımlaması için bir MALDI-TOF MS analizi yaptırın.
- Tanımlanan cinsin filogenetik analizini yapmak için, BLASTn34 ile izolatın 16S rRNA dizisini analiz edin. CLUSTAL Omega35 kullanılarak çoklu dizi hizalaması oluşturmak için %99 ile %97 arasında kimliğe sahip diziler kullanılmalıdır. Varsayılan ClustalW2 (Basit Filogeni) seçeneğini kullanarak komşu birleştirme ağacı oluşturun.
4. Ağır metallere ve antibiyotiklere duyarlılık
- İzolatın bir gliserol stoğundan aşılanması (bkz. adım 2.5) ve daha önce belirlenen optimal pH ve sıcaklık koşulları altında 200 mL LB içinde büyütün.
- Her bir ön kültürü, artan konsantrasyonlarda ağır metal içeren 5 mL LB ortamında (uygun pH'ta)0,1 OD 600 nm'de seyreltin. Konsantrasyonlar ağır metaller için 0.01-120 mM arasında değişmektedir [As (V), As (III), Cd (II), Co (III), Cr (VI), Cu (II), Hg (II), Ni (II), V (V)] veya antibiyotikler için 0.5-1 mg / mL [Ampisilin, Basitrasin, Kloramfenikol, Siprofloksasin, Eritromisin, Kanamisin, Streptomisin, Tetrasiklin ve Vankomisin].
- Ağır metal ve antibiyotik tedavilerini ayrı ayrı yapın. 50 mL'lik bir polipropilen tüp kullanın ve hücreleri, her koşul / tedavi için 55 ° C'de 180 rpm veya 16 saat boyunca 60 ° C'de sallama hızına sahip sıcaklık kontrollü bir orbital çalkalayıcıda büyütün.
- Mikrobiyal büyümenin gerçekleşmediği tüplerdeki konsantrasyon değerlerini tanımlayarak, yani 16 saat sonra hücre büyümesini tamamen inhibe eden değerleri belirleyerek antibiyotikler veya ağır metaller için Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MIC) hesaplayın.
- LB-agar plakalarında (uygun pH ve sıcaklıkta) MIC olarak kabul edilen değerde yetiştirilen kültürün 200 μL'sini kaplayarak ve ON inkübasyonundan sonra kolonilerin varlığını doğrulayarak konsantrasyonun inhibitör olduğunu ve hücreler için ölümcül olmadığını kontrol edin.
NOT: LB agar plakasındaki kültür 4 ° C'de sadece birkaç hafta boyunca canlı olduğundan, izolatları daha uzun süre korumak için gliserol stokları -80 ° C'de hazırlandı ve saklandı. MIC tayini için, bağımsız kültürler kullanılarak en az üç bağımsız replikasyon gerçekleştirildi. Standart sapma üçlü deneyler arasında hesaplandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnekleme sitesi
Bu protokol, ağır metale dirençli bakterilerin bir kaplıcadan izole edilmesi için bir yöntem göstermektedir. Bu çalışmada örnekleme alanı olarak asit-sülfidik jeotermal ortam olan Pisciarelli alanı kullanılmıştır (Şekil 1). Bu ekosistem, volkanik faaliyetlerden türetilen agresif kükürtlü sıvıların akışı ile karakterizedir. Asit-sülfidik jeotermal sistemlerdeki mikrobiyal toplulukların, yüksek konsantrasyonlarda ağır metallerin varlığı ile yapılan aşırı seçici basınca maruz kaldığı gösterilmiştir. Örnekler yılın iki farklı döneminde (Nisan ve Eylül)2,21 adet çamur havuzundan köpüren bir çamur havuzuna göre marjinal olarak toplanmıştır. Çamur havuzunda, pH değerlerindeki dalgalanmalar (Nisan ayında ~pH 6 ve Eylül ayında ~pH 5) kaydedilirken, sıcaklık her iki durumda da ~ 55 ° C idi. Bununla birlikte, diğer yıllarda32 yılında çamur havuzunda (~ 70 ° C) daha yüksek sıcaklıklar da kaydedilmiştir.
İzolasyon ve tanımlama
Toplanan örnekler LB ortamında aşılandı ve daha önce bildirildiği gibi 55 ° C ve 60 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edildi, böylece hücre örneklerinin büyümesi için laboratuvar koşullarının çevresel kimyasal-fiziksel koşulları taklit etmesi sağlandı. Hücre büyümesini desteklemek için, tek koloniler plaka üzerine çizildi ve zengin sıvı bir ortamda birkaç seyreltmeden sonra (en az 3) izole edildi; izole suşlar optimal büyüme sıcaklıklarını 55 °C ve 60 °C'de göstermiştir (Şekil 2). Yeni izolatları tanımlamak için genomik DNA preparatı yapıldı ve harici bir hizmet olarak 16S rRNA dizilimi ve yağ asitleri kütle spektrometrisi analizi yapıldı. Bildirildiği gibi, yağ asitlerinin analizi, diğer yaklaşımlarla birleştirildiğinde bakterilerin kesin olarak tanımlanmasına yardımcı olan güçlü bir biyoanalitik yöntemdir36. En yakın akrabaları tanımlamak için filogenetik ağacı oluşturmak için 16S rRNA'nın çoklu hizalamaları kullanıldı37.
Ağır metal duyarlılık testi
Toksik moleküllerin bir arada bulunması solfatarik ortamları karakterize eder. Özellikle, Pisciarelli'deki kaplıcalar, As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38 ile birlikte bulunan yüksek CO2, H2S, NH4 seviyeleri ile karakterize edilir. Bu nedenle, izole mikroorganizmaların fenotipik bir karakterizasyonu, Tablo 1'de bildirildiği gibi, artan bir ağır metal konsantrasyonunun varlığında gerçekleştirilmiştir. İlginç bir şekilde, izolat 1, As (V) ve V (V) 'ye karşı daha yüksek tolerans göstermiştir. Hem arsenat hem de vanadat için yüksek direnç kimyasal yapılarından kaynaklanabilir; Aslında, her iki iyon da fosfat iyonlarına benzer, bu da V (V) ve As (V) 'nin fosfat taşıma sistemleri aracılığıyla hücreler tarafından alınabileceğini düşündürmektedir. Bu izolatların, MIC değeri nispeten düşük olmasına rağmen, Cd (II) 'ye de dirençli olduğu ortaya çıktı. Bu sonuç havuzda Cd(II)'nin bulunmaması ile açıklanabilir. İki mikroorganizma aynı bölgede örneklenmiş olmasına rağmen, farklı ağır metal direnç profilleri gösterdiler. Bununla birlikte, farklı dönemlerde örneklenmişlerdir, böylece mikrobiyal toplulukların bileşimini ve ağır metallere karşı diferansiyel dirençlerini şekillendiren ana itici güç olarak ağır metal konsantrasyonundaki mevsime bağlı varyasyona işaret etmişlerdir39. Bu karşılaştırmalı verilerden, izolatın 1'in As(V)'ye karşı güçlü bir dirence sahip olduğu, As(III) için ise 2'nin güçlü bir dirence sahip olduğu gösterilmiştir. Moleküler direnç mekanizmalarını çözmek ve fenotiplerin kaplıcaların seçici basıncından nasıl etkilendiğini daha iyi anlamak için daha ileri genetik araştırmalara ihtiyaç vardır.
Antibiyotik direnç testleri
Aşırı ortamlarda evrimleşen mikrobiyal suşlar genellikle farklı antibiyotiklere direnç gösterir. Ağır metal direnci ile antibiyotikler arasındaki korelasyon iyi bilinmektedir40. Bu nedenle her iki izolatta da antibiyotiklere direnci test ettik (Tablo 2). İzolat 1, düşük konsantrasyonlar kullanıldığında bile, test edilen tüm antibiyotiklere karşı yüksek duyarlılık gösterdi. Buna karşılık, izolat 2, kloramfenikol ve tetrasiklin hariç, test edilen tüm antibiyotiklere dirençlidir. İlginç bir şekilde, ampisilin, eritromisin, kanamisin, streptomisin ve vankomisin yönünde belirlenen MIC değerleri, diğer antibiyotiğe dirençli bakterilerinkilerle karşılaştırılabilir ve hatta bacitracin ve siprofloksasin41 için daha yüksekti. Bu büyüleyici veriler daha fazla araştırmayı hak ediyor; Muhtemelen, rastgele mutasyonlar veya yatay gen transferi nedeniyle, mikroorganizma, bu tür aşırı çevresel koşullarda seçici bir avantajı temsil edebilecek antibiyotik direnci kazanmıştır.
Şekil 1. Örnekleme alanı: Pisciarelli'nin solfatarik alanı, Campi Flegrei (Napoli, İtalya). Örnekleme alanı, Pisciarelli fumarole'nin jeotermal bölgesinde, 40° 49' 45.3" N - 14° 08' 49.9 E'de yer almaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Deneysel prosedürün şematik gösterimi. Mikroorganizmalar kaplıcalarda örneklenir, laboratuvarda yetiştirilir, tekrarlanan çizgi ve kaplama yoluyla izole edilir ve 16S rRNA dizilimi üzerine genotipik olarak tanımlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Metal iyonları | İzolat 1 | İzolat 2 |
| (III) olarak | 1,9 mM | 41 mM |
| (V) olarak | 117 mM | 11 mM |
| Cd (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | n.a. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | n.a. |
| Cu (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 mM | n.a |
Tablo 1. İzolatların ağır metal iyonlarına yönelik MIC değerleri. MIC'ler, 16 saat sonra hücre büyümesini tamamen inhibe eden minimum konsantrasyon değerleri olarak kabul edilir; değerler üç deneyin ortalaması olarak raporlanır.
| Antibiyotik | İzolat 1 | İzolat 2 |
| Ampisilin | n.d. | 20 μg/mL |
| Bacitracin (Bacitracin) | n.d. | 700 μg/mL |
| Kloramfenikol | n.d. | <0,5 μg/mL |
| Siprofloksasin | n.d. | >1 mg/mL |
| Eritromisin | n.d. | 70 μg/mL |
| Kanamisin | n.d. | 80 μg/mL |
| Streptomisin | n.d. | 70 μg/mL |
| Tetrasiklin | n.d. | <0,5 μg/mL |
| Vankomisin | n.d. | 1 μg/mL |
Tablo 2. İzolatların antibiyotiklere yönelik MIC değerleri. MIC'ler, 16 saat sonra hücre büyümesini tamamen inhibe eden minimum konsantrasyonlar olarak kabul edilir; değerler üç deneyin ortalaması olarak raporlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kaplıcalar, eşit derecede çeşitli metabolik kapasitelere sahip kullanılmayan mikrobiyom çeşitliliği içerir12. Ağır metalleri daha az toksik bileşiklere verimli bir şekilde dönüştürebilen mikroorganizmaların izolasyonu için stratejilerin geliştirilmesi10, dünya çapında artan ilgi alanına sahip bir araştırma alanını temsil etmektedir. Bu yazıda, toksik kimyasallara direnme kabiliyetine sahip mikropların taranması ve izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım tanımlanmaktadır. Açıklanan yöntem, mikropları su, gıda, toprak veya tortu gibi çeşitli çevresel kaynaklardan izole etmek için kolayca değiştirilebilir. Bununla birlikte, bu teknikte mikrobiyal kültüre olan bağımlılıkla ilgili bazı sınırlamalar vardır. Bu nedenle, bu kurulum, bakterileri kolayca kültürlenemeyen bir ortamdan izole etmek için uygun olmayacaktır. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir yolu, farklı bakteri ortamları (yani, seçici ortam veya ön adaptasyon stratejileri) ve daha uzun inkübasyon sürelerikullanmaktır 42.
Bununla birlikte, biyoremediasyon için ilgi duyulan türlerin çoğunluğunun burada açıklanan koşullar altında büyümesi beklenmektedir. Bu protokolün, kimyasallar için seçici agar ortamının şu ana kadar bilinmediği göz önüne alındığında, geleneksel kaplama tekniklerine göre bazı avantajları vardır. Dirençli mikropları tanımlamak için MIC kullanımı, yeni türlerin veya yeni suşların karakterizasyonuna giden yolu açan bireysel izolatlarda sömürülecek hızlı bir stratejidir. Bu çalışma, kirleticileri inaktive ederek ve zararsız ürünlere dönüştürerek etkili biyoremediasyona katkıda bulunabilecek çevresel mikroorganizmaları seçmek için böyle bir yöntemin yararlılığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amiloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 ve GoodbyWaste: Obtain GoodbyWaste: Obtain GOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, İtalya tarafından desteklenmiştir. Jeotermal alanın tanımlanması ve karakterizasyonu için Dr. Monica Piochi ve Dr. Angela Mormone'ye (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, İtalya) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
