Summary
O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.
Abstract
As nascentes geotérmicas são ricas em vários íons metálicos devido à interação entre rocha e água que ocorre no aquífero profundo. Além disso, devido à variação sazonalidade do pH e da temperatura, a flutuação na composição do elemento é observada periodicamente dentro desses ambientes extremos, influenciando as comunidades microbianas ambientais. Microrganismos extreílicos que prosperam em aberturas térmicas vulcânicas desenvolveram mecanismos de resistência para lidar com vários íons metálicos presentes no ambiente, participando assim de ciclos biogeoquímicos metálicos complexos. Além disso, os extremófilos e seus produtos têm encontrado uma ampla base no mercado, e isso vale especialmente para suas enzimas. Nesse contexto, sua caracterização é funcional para o desenvolvimento de biossistemas e bioprocessos para monitoramento ambiental e bioremediação. Até o momento, o isolamento e o cultivo em condições laboratoriais de microrganismos extreílicos ainda representam um gargalo para a exploração plena de seu potencial biotecnológico. Este trabalho descreve um protocolo simplificado para o isolamento de microrganismos termofílicos de fontes termais, bem como sua identificação genotípica e fenotípica através das seguintes etapas: (1) Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos ("Pisciarelli", uma área vulcânica de Campi Flegrei em Nápoles, Itália); (2) Isolamento de microrganismos resistentes ao metal pesado; (3) Identificação de isolados microbianos; (4) Caracterização fenotípica dos isolados. As metodologias descritas neste trabalho podem ser geralmente aplicadas também para o isolamento de microrganismos de outros ambientes extremos.
Introduction
Os ambientes extremos do nosso planeta são excelentes fontes de microrganismos capazes de tolerar condições severas (ou seja, temperatura, pH, salinidade, pressão e metais pesados)1,2, sendo Islândia, Itália, EUA, Nova Zelândia, Japão, África Central e Índia, as áreas vulcânicas mais reconhecidas e estudadas 3,4,5,6,7,8,9 . Os termófilos evoluíram em ambientes severos em uma faixa de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Os microrganismos termofílicos, pertencentes aos reinos arqueais ou bacterianos, são um reservatório para o estudo da biodiversidade, filogênese e produção de biomoléculas exclusivas para aplicações industriais 13,14,15,16. De fato, nas últimas décadas, a contínua demanda industrial no mercado global tem incentivado a exploração de extremófilos e termozymes para suas aplicações diversificadas em diversos campos biotecnológicos 17,18,19.
As fontes termais, onde os organismos vivem em consórcios, são ricas fontes de biodiversidade, representando assim um habitat atraente para estudar a ecologia microbiana20,21. Além disso, essas áreas ricas em metais vulcânicos são comumente colonizadas por microrganismos que evoluíram sistemas de tolerância para sobreviver e se adaptar à presença de metais pesados22,23 e, portanto, estão ativamente envolvidos em seus ciclos biogeoquímicos. Atualmente, metais pesados são considerados poluentes prioritários para os seres humanos e para o meio ambiente. Os microrganismos resistentes ao metal pesado são capazes de solubilizar e precipitar metais transformando-os e remodelando seus ecossistemas24,25. A compreensão dos mecanismos moleculares da resistência ao metal pesado é um tema quente para a urgência de desenvolver novas abordagens verdes 26,27,28. Nesse contexto, a descoberta de novas bactérias tolerantes representa o ponto de partida para o desenvolvimento de novas estratégias de bioremediação ambiental24,29. Ao acompanhar os esforços para explorar ambientes hidrotérmicos através de procedimentos microbiológicos e aumentar o conhecimento sobre o papel dos genes que sustentam a tolerância ao metal pesado, foi realizada uma triagem microbiana na área de primavera quente de Campi Flegrei, na Itália. Este ambiente rico em metais pesados mostra uma poderosa atividade hidrotérmica, fumarole e piscinas de ebulição, variável em pH e temperatura em dependência de sazonalidade, chuvas e movimentos geológicos subterrâneos30. Nessa perspectiva, descrevemos uma maneira fácil de aplicar e eficaz de isolar bactérias resistentes a metais pesados, por exemplo, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (nomeado como isolado 1) e Alicyclobacillus mali FL1832 (nomeado como isolado 2) da área de Pisciarelli de Campi Flegrei.
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Protocol
1. Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos
- Escolha o local para amostragem usando como critério locais com temperatura e pH desejados. Meça os parâmetros físicos através de uma sonda termopar digital, inserindo-a nas piscinas ou lamas selecionadas.
- Coletar 20 g de amostras de solos (neste caso, de lama no sítio hidrotérmico de Pisciarelli Solfatara), recolhendo-os com uma colher esterilizada. Pegue pelo menos duas amostras para cada local escolhido.
- Coloque as amostras em tubos de polipropileno estéreis de 50 mL e feche imediatamente.
- Meça pH e temperatura com uma sonda termopar digital inserindo-a diretamente no local de amostragem. Após o uso, enxágue a sonda cuidadosamente com água deionizada.
2. Isolamento de microrganismos resistentes ao metal pesado
NOTA: Realizar etapas 2.1-2.7 sob um capô biológico estéril.
- Inocular 2 g de cada amostra coletada em 50 mL de meio Luria-Bertani recém-preparado (LB), no qual o pH foi ajustado para 4 ou 7 através da adição de HCl ou NaOH.
- Incubar as amostras na mesma temperatura do local de amostragem e a ±5 °C (55 °C e 60 °C para amostras de Pisciarelli) em um agitador orbital controlado pela temperatura por 24 h com uma taxa de agitação de 180 rpm.
- Placa 200 μL das amostras cultivadas em ágar LB (pH 4 ou pH 7) e incubar em condição estática por 48 h a 55 °C ou 60 °C.
- Isole colônias únicas e repita ciclos de revestimento de raia (passos 2.3 e 2.4) pelo menos três vezes.
- Para preparar -80 °C de estoques de células congeladas, cresça as culturas durante a noite (ON) e adicione às células cultivadas 20% glicerol (em um volume final de 1 mL); use uma mistura de acetona e gelo seco para congelamento rápido.
- Para preparar um inóculo de um estoque de glicerol, inocular 50 μL em 50 mL de LB (pH 4 ou pH 6) e incubar a 55 °C ou 60 °C no agitador orbital a 180 rpm ON.
- Para obter um perfil de crescimento, diluir uma pré-cultura (obtida da etapa 2.6) a 0,1 OD600 nm em 10 mL de LB (pH 4 ou pH 6), crescer as células a 55 °C ou 60 °C por 16 horas no agitador orbital, e medir o OD600 nm em intervalos de 30 minutos.
- Construa uma curva de crescimento a partir dos dados obtidos na etapa 2.7 com tempo (min) no eixo X e OD600 nm no eixo Y.
- Realize a mesma curva de crescimento descrita nas etapas 2.7 e 2.8, mas variando o pH (± unidade 1) do meio de cultura (por exemplo, pH 3 e 5 para amostras cultivadas em pH 4) para determinar o pH ideal para condições laboratoriais.
3. Identificação de isolados microbianos
- Preparação de DNA genômico
- Inocular o isolado listrado do estoque de glicerol em 50 mL de meio LB (pH 4 ou pH 6) e crescer em um agitador orbital a 55 °C ou 60 °C a 180 rpm ON.
- Colher a cultura ON por centrifugação por 10 min a 5000 x g. Descarte o supernatante.
- Prepare 10 mL de tampão de lise bacteriana composto por: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 e lysozyme (20 mg/mL) imediatamente antes do uso.
- Resuspense a pelota em 180 μL de tampão de lise bacteriana. Incubar por 30 min a 37 °C.
- Siga as diretrizes indicadas por um kit de purificação de DNA genômico (Tabela de Materiais) para extrair DNA genômico.
- Quantifique o DNA genômico extraído e sua pureza pela medição UV-Vis. Para razões de determinação de pureza-OD 260/280 nm e OD 260/230 nm.
- Avalie a integridade do DNA genômico carregando 200 ng de cada amostra em um gel de 0,8% de agarose e comparando a distribuição de tamanho com um marcador molecular de alto peso.
- Comissão para um serviço externo a preparação, sequenciamento e análise comparativa do fragmento de rRNA 16S e análise comparativa da sequência obtida (1000 bp) com os presentes no banco de dados nucleotídeos do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia dos EUA (NCBI)33.
- Para corroborar dados do sequenciamento de rRNA 16S, também realizar ribotipagem automatizada no DNA cromossômico digerido (serviço externo, Tabela de Materiais).
- No caso em que a identificação da espécie não pode ser determinada apenas com dados de ribotipagem, comissione uma análise MALDI-TOF MS para identificação de ácidos graxos.
- Para realizar uma análise filogenética do gênero identificado, analise a sequência de rRNA 16S do isolado com BLASTn34. Sequências com identidades de 99% a 97% devem ser usadas para construir um alinhamento de sequência múltipla usando CLUSTAL Ômega35. Construa uma árvore de junção de vizinhos usando a opção padrão de ClustalW2 (Simple Phylogeny).
4. Suscetibilidade de metais pesados e antibióticos
- Inocular o isolado de um estoque de glicerol (ver passo 2.5) e cultivá-lo em 200 mL de LB sob o pH ideal e condições de temperatura previamente determinadas.
- Diluir cada pré-cultura a 0,1 OD600 nm em 5 mL de meio LB (no pH apropriado) contendo concentrações crescentes de metais pesados. As concentrações variam de 0,01-120 mM para metais pesados [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] ou 0,5-1 mg/mL para os antibióticos [Ampicillin, Bacitracina, Clorofilicol, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Estreptomicina, Tetraciclina e Vancomicina].
- Realize tratamentos de metais pesados e antibióticos separadamente. Use um tubo de polipropileno de 50 mL e cresça as células em um agitador orbital controlado pela temperatura com uma taxa de agitação de 180 rpm a 55 °C ou 60°C para 16 h para cada condição/tratamento.
- Calcule a Concentração Inibitória Mínima (MIC) seja para antibióticos ou metais pesados, identificando os valores de concentração nos tubos onde o crescimento microbiano não ocorre, ou seja, determinando os valores que inibem completamente o crescimento celular após 16 h.
- Verifique se a concentração é inibitória e não letal para as células, emplacando 200 μL da cultura cultivada pelo valor que é considerado como MIC em placas lb-ágar (no pH e temperatura apropriados) e verificando a presença de colônias após a incubação ON.
NOTA: Como a cultura na placa de ágar LB é viável a 4 °C apenas por algumas semanas, a fim de preservar os isolados por mais tempo, os estoques de glicerol foram preparados e armazenados a -80 °C. Para determinação mic, pelo menos três réplicas independentes utilizando culturas independentes foram realizadas. O desvio padrão foi calculado entre os experimentos triplicados.
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Representative Results
Local de amostragem
Este protocolo ilustra um método para o isolamento de bactérias resistentes a metais pesados de uma fonte termal. Neste estudo, a área de Pisciarelli, um ambiente geotérmico ácido-sulfísico, foi utilizada como local de amostragem (Figura 1). Este ecossistema é caracterizado pelo fluxo de fluidos sulfúricos agressivos derivados de atividades vulcânicas. Foi demonstrado que as comunidades microbianas em sistemas geotérmicos ácido-sulfísicos estão sujeitas a extrema pressão seletiva feita pela presença de altas concentrações de metais pesados. As amostras foram coletadas em dois períodos diferentes do ano (abril e setembro) de 2,21 por uma piscina de lama marginal em relação a uma piscina de lama borbulhante. Na piscina de lama, foram registradas flutuações nos valores de pH (~pH 6 em abril e ~pH 5 em setembro), enquanto a temperatura foi de ~55 °C em ambos os casos. No entanto, temperaturas mais altas também foram registradas na piscina de lama (~70 °C) em outros anos32.
Isolamento e identificação
As amostras coletadas foram inoculadas em meio LB e incubadas por 24h a 55 °C e 60 °C, conforme relatado anteriormente, estabelecendo assim as condições laboratoriais para o crescimento das amostras de células para imitar as condições químicas-físicas ambientais. Para favorecer o crescimento celular, as colônias únicas foram listradas na placa e isoladas após várias diluições (pelo menos 3) em um meio líquido rico; as cepas isoladas mostraram sua temperatura de crescimento ideal a 55 °C e 60 °C (Figura 2). Para identificar os novos isolados, foi realizada uma preparação genômica de DNA e realizado uma análise de espectrometria de massa de rRNA de 16S e ácidos graxos como serviço externo. Como relatado, a análise dos ácidos graxos é um poderoso método bioanalítico que ajuda na identificação precisa de bactérias quando combinado com outras abordagens36. Múltiplos alinhamentos de rRNA 16S foram utilizados para a construção da árvore filogenética para identificar os parentes mais próximos37.
Teste de suscetibilidade de metais pesados
A coexistência de moléculas tóxicas caracteriza ambientes solfataricos. Em particular, as fontes termais em Pisciarelli são caracterizadas por altos níveis de CO2, H2S, NH4 em convivência com As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Por essa razão, foi realizada uma caracterização fenotípica dos microrganismos isolados na presença de uma concentração crescente de metais pesados, conforme relatado na Tabela 1. Curiosamente, o isolado 1 mostrou maior tolerância a As(V) e V(V). A alta resistência tanto ao arsenato quanto ao vanadate pode ser devido às suas estruturas químicas; na verdade, ambos os íons são semelhantes aos íons fosfatos, sugerindo que V(V) e As(V) poderiam ser tomados por células através de sistemas de transporte fosfato. Esses isolados também se mostraram resistentes ao Cd(II), embora o valor mic fosse relativamente baixo. Esse resultado pode ser explicado pela ausência de Cd(II) na piscina. Embora os dois microrganismos tenham sido amostrados no mesmo local, eles apresentaram diferentes perfis de resistência ao metal pesado. No entanto, foram amostrados em diferentes períodos, apontando assim a variação dependente da estação na concentração de metais pesados como a principal força motriz moldando a composição das comunidades microbianas e sua resistência diferencial aos metais pesados39. A partir destes dados comparativos, foi demonstrado que o isolado 1 tem forte resistência a As(V), enquanto isolado 2 para As(III). Investigações genéticas adicionais são necessárias para desvendar os mecanismos de resistência molecular e entender melhor como os fenótipos são afetados pela pressão seletiva das fontes termais.
Testes de resistência a antibióticos
As cepas microbianas evoluíram em ambientes extremos geralmente exibem resistência a diferentes antibióticos. A correlação entre a resistência ao metal pesado e os antibióticos é bem conhecida40. Por essa razão, testamos a resistência a antibióticos para ambos os isolados (Tabela 2). O isolado 1 apresentou alta sensibilidade a todos os antibióticos testados, mesmo quando foram utilizadas baixas concentrações. Em contraste, o isolado 2 é resistente a todos os antibióticos testados, com exceção de clorofenicol e tetraciclina. Curiosamente, os valores mic determinados para ampicilina, eritromicina, kanamicina, estreptomicina e vancomicina foram comparáveis aos de outras bactérias resistentes a antibióticos e ainda maiores para bacitracina e ciprofloxacina41. Esses dados fascinantes merecem investigações adicionais; provavelmente, devido a mutações aleatórias ou transferência de genes horizontais, o microrganismo adquiriu resistência a antibióticos, o que poderia representar uma vantagem seletiva em condições ambientais tão extremas.
Figura 1. Local de amostragem: área solfatarica de Pisciarelli, Campi Flegrei (Nápoles, Itália). O local de amostragem está localizado a 40° 49' 45,3" N - 14° 08' 49,9 E, na área geotérmica de Pisciarelli fumarole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Representação esquemática do procedimento experimental. Os microrganismos são amostrados em fontes termais, cultivados em laboratório, isolados através de repetidos streaking e plating, e genotipicamente identificados no sequenciamento de rRNA 16S. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Íons metálicos | Isolado 1 | Isolado 2 |
| Como (III) | 1,9 mM | 41 mM |
| Como (V) | 117 mM | 11 mM |
| Cd (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | N.A. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | N.A. |
| (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 mM | n.a |
Mesa 1. Valores MIC para íons de metal pesado dos isolados. As MICs são consideradas como os valores mínimos de concentração que inibem completamente o crescimento celular após 16 h; os valores são relatados como média de três experimentos.
| Antibióticos | Isolado 1 | Isolado 2 |
| Ampicilina | N.D. | 20 μg/mL |
| Bacitracina | N.D. | 700 μg/mL |
| Cloranfenicol | N.D. | <0,5 μg/mL |
| Ciprofloxacina | N.D. | >1 mg/mL |
| Eritromicina | N.D. | 70 μg/mL |
| Canamicina | N.D. | 80 μg/mL |
| Estreptomicina | N.D. | 70 μg/mL |
| Tetraciclina | N.D. | <0,5 μg/mL |
| Vancomicina | N.D. | 1 μg/mL |
Mesa 2. Valores MIC para antibióticos dos isolados. As MICs são consideradas como as concentrações mínimas que inibem completamente o crescimento celular após 16 h; os valores são relatados como média de três experimentos.
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Discussion
As fontes termais contêm uma diversidade inexplorada de microbiomas com capacidades metabólicas igualmente diversas12. O desenvolvimento de estratégias para o isolamento de microrganismos que possam converter eficientemente metais pesados em compostos menos tóxicos10 representa uma área de pesquisa de crescente interesse em todo o mundo. Este artigo tem como objetivo descrever uma abordagem simplificada para a triagem e isolamento de micróbios com a capacidade de resistir a produtos químicos tóxicos. O método descrito pode ser facilmente modificado para isolar micróbios de diversas fontes ambientais, como água, alimentos, solo ou sedimentos. No entanto, existem algumas limitações nesta técnica relacionadas à dependência da cultura microbiana. Portanto, essa configuração não seria adequada para isolar bactérias de um ambiente que não é facilmente cultural. Uma maneira de superar esse problema é usar diferentes mídias bacterianas (ou seja, mídia seletiva ou estratégias de pré-adaptação) e mais vezes de incubação42.
No entanto, espera-se que a maioria das espécies de interesse para a bioremediação cresça nas condições aqui descritas. Este protocolo tem algumas vantagens em relação às técnicas tradicionais de chapeamento, considerando que as mídias seletivas de ágar para produtos químicos são desconhecidas até agora. O uso de MIC para identificar micróbios resistentes é uma estratégia rápida a ser explorada em isolados individuais que abre caminho para a caracterização de novas espécies ou novas cepas. Este estudo demonstra a utilidade de tal método para selecionar microrganismos ambientais que podem contribuir para a bioremediação eficaz, inativando os poluentes e convertendo-os em produtos inofensivos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 e pela GoodbyWaste: Obtaingood produtos-exploram por produtos-reduzir resíduos, MIUR 2017-JTNK78.006, Itália. Agradecemos ao Dr. Monica Piochi e à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
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