Summary
يعد عزل الميكروبات المقاومة للمعادن الثقيلة عن الينابيع الحرارية الأرضية موضوعا ساخنا لتطوير المعالجة الحيوية والنظم الحيوية للرصد البيئي. توفر هذه الدراسة نهجا منهجيا لعزل وتحديد البكتيريا التي تتحمل المعادن الثقيلة من الينابيع الساخنة.
Abstract
الينابيع الحرارية الأرضية غنية بأيونات المعادن المختلفة بسبب التفاعل بين الصخور والمياه التي تحدث في طبقة المياه الجوفية العميقة. علاوة على ذلك ، بسبب التباين الموسمي في درجة الحموضة ودرجة الحرارة ، لوحظ بشكل دوري تقلب في تكوين العناصر داخل هذه البيئات القاسية ، مما يؤثر على المجتمعات الميكروبية البيئية. طورت الكائنات الحية الدقيقة المتطرفة التي تزدهر في الفتحات الحرارية البركانية آليات مقاومة للتعامل مع العديد من أيونات المعادن الموجودة في البيئة ، وبالتالي المشاركة في الدورات البيوجيوكيميائية المعدنية المعقدة. علاوة على ذلك ، وجدت الكائنات المتطرفة ومنتجاتها موطئ قدم واسع النطاق في السوق ، وهذا ينطبق بشكل خاص على إنزيماتها. وفي هذا السياق، فإن توصيفها وظيفي لتطوير النظم الحيوية والعمليات البيولوجية للرصد البيئي والمعالجة البيولوجية. وحتى الآن، لا يزال عزل الكائنات الحية الدقيقة المتطرفة وزراعتها تحت ظروف مختبرية يمثل عنق الزجاجة لاستغلال إمكاناتها التكنولوجية الحيوية استغلالا كاملا. ويصف هذا العمل بروتوكولا مبسطا لعزل الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة عن الينابيع الساخنة، فضلا عن تحديدها الجيني والظاهري من خلال الخطوات التالية: (1) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية ("Pisciarelli"، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية ("Pisciarelli"، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية ("Pisciarelli"، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية ("Pisciarelli"، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية ("Pisciarelli"، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات (2) عزل الكائنات الحية الدقيقة المقاومة للمعادن الثقيلة؛ (3) تحديد العزلات الميكروبية؛ (4) التوصيف الظاهري للعزلات. ويمكن تطبيق المنهجيات الموصوفة في هذا العمل عموما أيضا على عزل الكائنات الحية الدقيقة عن البيئات القاسية الأخرى.
Introduction
البيئات القاسية على كوكبنا هي مصادر ممتازة للكائنات الحية الدقيقة القادرة على تحمل الظروف القاسية (أي درجة الحرارة ودرجة الحموضة والملوحة والضغط والمعادن الثقيلة)1،2 ، كونها أيسلندا وإيطاليا والولايات المتحدة الأمريكية ونيوزيلندا واليابان ووسط أفريقيا والهند ، أفضل المناطق البركانية المعترف بها والدراسة3،4،5،6،7،8،9 . تطورت محبة الحرارة في بيئات قاسية في مجموعة من درجات الحرارة من 45 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية10،11،12. الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة ، إما التي تنتمي إلى الممالك القديمة أو البكتيرية ، هي خزان لدراسة التنوع البيولوجي ، والتكاثر ، وإنتاج جزيئات حيوية حصرية للتطبيقات الصناعية 13،14،15،16. في الواقع ، في العقود الماضية ، شجع الطلب الصناعي المستمر في السوق العالمية على استغلال المحبة للمتطرفات والإنزيمات الحرارية لتطبيقاتها المتنوعة في العديد من مجالات التكنولوجيا الحيوية 17،18،19.
الينابيع الساخنة ، حيث تعيش الكائنات الحية في اتحادات ، هي مصادر غنية للتنوع البيولوجي ، وبالتالي تمثل موئلا جذابا لدراسة البيئة الميكروبية20،21. علاوة على ذلك ، فإن هذه المناطق الغنية بالمعادن البركانية تستعمرها عادة الكائنات الحية الدقيقة التي طورت أنظمة التسامح للبقاء والتكيف مع وجود المعادن الثقيلة22,23 وبالتالي تشارك بنشاط في دوراتها البيوجيوكيميائية. في الوقت الحاضر ، تعتبر المعادن الثقيلة ملوثات ذات أولوية للبشر والبيئة. الكائنات الحية الدقيقة المقاومة للمعادن الثقيلة قادرة على إذابة المعادن وترسيبها عن طريق تحويلها وإعادة تشكيل نظمها الإيكولوجية24,25. إن فهم الآليات الجزيئية لمقاومة المعادن الثقيلة هو موضوع ساخن للحاجة الملحة لتطوير نهج خضراء جديدة 26،27،28. في هذا السياق ، يمثل اكتشاف بكتيريا جديدة متسامحة نقطة انطلاق لتطوير استراتيجيات جديدة للمعالجة البيولوجية البيئية24,29. وبمرافقة الجهود المبذولة لاستكشاف البيئات الحرارية المائية من خلال الإجراءات الميكروبيولوجية وزيادة المعرفة بدور الجين (الجينات) التي تدعم تحمل المعادن الثقيلة، أجري فحص ميكروبي في منطقة الينابيع الساخنة في كامبي فليغري في إيطاليا. تظهر هذه البيئة الغنية بالمعادن الثقيلة نشاطا حراريا مائيا قويا ، وفومارول ، وبركا مغلية ، متغيرة في درجة الحموضة ودرجة الحرارة في الاعتماد على الموسمية ، وهطول الأمطار ، والحركات الجيولوجية تحت الأرض30. في هذا المنظور ، نصف طريقة سهلة التطبيق وفعالة لعزل البكتيريا المقاومة للمعادن الثقيلة ، على سبيل المثال ، Geobacillus stearothermophilus GF1631 (المسمى باسم المعزول 1) و Alicyclobacillus mali FL1832 (المسمى باسم المعزول 2) من منطقة Pisciarelli في Campi Flegrei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية
- اختر الموقع لأخذ العينات باستخدام أماكن معيارية مع درجة الحرارة والرقم الهيدروجيني المطلوبين. قم بقياس المعلمات الفيزيائية من خلال مسبار مزدوج حراري رقمي ، وإدخاله في المسابح أو الطين المحدد.
- جمع 20 غرام من عينات التربة (في هذه الحالة ، من الطين في الموقع الحراري المائي ل Pisciarelli Solfatara) ، والتقاطها بملعقة معقمة. خذ عينتين على الأقل لكل موقع تم اختياره.
- ضع العينات في أنابيب بولي بروبيلين معقمة سعة 50 مل وأغلقها على الفور.
- قم بقياس درجة الحموضة ودرجة الحرارة باستخدام مسبار مزدوج حراري رقمي عن طريق إدخاله مباشرة في موقع أخذ العينات. بعد الاستخدام ، اشطف المسبار بعناية بالماء منزوع الأيونات.
2. عزل الكائنات الحية الدقيقة المقاومة للمعادن الثقيلة
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 2.7 تحت غطاء محرك أقراص بيولوجي معقم.
- قم بتلقيح 2 غرام من كل عينة تم جمعها في 50 مل من وسط لوريا بيرتاني الطازج (LB) ، حيث تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 4 أو 7 من خلال إضافة HCl أو NaOH.
- احتضان العينات في نفس درجة حرارة موقع أخذ العينات وعند ±5 درجة مئوية (55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية لعينات Pisciarelli) في شاكر مداري يتم التحكم في درجة حرارته لمدة 24 ساعة بمعدل اهتزاز يبلغ 180 دورة في الدقيقة.
- لوحة 200 ميكرولتر من العينات المزروعة على LB agar (الرقم الهيدروجيني 4 أو الرقم الهيدروجيني 7) وتحضن في حالة ثابتة لمدة 48 ساعة عند 55 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية.
- اعزل مستعمرات مفردة وكرر دورات الطلاء المستقيم (الخطوتان 2.3 و 2.4) ثلاث مرات على الأقل.
- لإعداد مخزونات الخلايا المجمدة -80 درجة مئوية ، تنمو الثقافات بين عشية وضحاها (ON) وتضيف إلى الخلايا المزروعة 20 ٪ من الجلسرين (في حجم نهائي من 1 مل) ؛ استخدم مزيجا من الأسيتون والثلج الجاف للتجميد السريع.
- لإعداد لقاح من مخزون الجلسرين ، قم بتلقيح 50 ميكرولتر في 50 مل من LB (الرقم الهيدروجيني 4 أو الرقم الهيدروجيني 6) واحتضان عند 55 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية في الاهتزاز المداري عند 180 دورة في الدقيقة ON.
- للحصول على ملف تعريف النمو ، قم بتخفيف مرحلة ما قبل الزراعة (التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.6) إلى 0.1 OD 600nm في 10 مل من LB (الرقم الهيدروجيني 4 أو الرقم الهيدروجيني 6) ، وتنمو الخلايا عند 55 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في الهزاز المداري ، وقياس OD600 نانومتر على فترات 30 دقيقة.
- قم بإنشاء منحنى نمو من البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.7 مع الوقت (دقيقة) على المحور X و OD600 نانومتر على المحور Y.
- تحقيق نفس منحنى النمو الموصوف في الخطوتين 2.7 و 2.8 مع تغيير الرقم الهيدروجيني (± 1 وحدة) لوسط الاستزراع (على سبيل المثال ، الرقم الهيدروجيني 3 و 5 للعينات المزروعة عند الرقم الهيدروجيني 4) لتحديد الرقم الهيدروجيني الأمثل للظروف المختبرية.
3. تحديد العزلات الميكروبية
- تحضير الحمض النووي الجينومي
- قم بتلقيح المعزول من مخزون الجلسرين في 50 مل من وسط LB (الرقم الهيدروجيني 4 أو الرقم الهيدروجيني 6) وينمو في اهتزاز مداري عند 55 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة ON.
- حصاد ثقافة ON عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 5000 × جم. تخلص من السوبرناتانت.
- تحضير 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل البكتيريا يتكون من: 20 mM Tris-HCl pH 8.0 و 2 mM EDTA و 1.2٪ Triton X-100 و lysozyme (20 mg / mL) مباشرة قبل الاستخدام.
- أعد تعليق الكريات في 180 ميكرولتر من مخزن تحلل البكتيريا. تحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- اتبع الإرشادات المشار إليها في مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية (جدول المواد) لاستخراج الحمض النووي الجينومي.
- تحديد كمية الحمض النووي الجينومي المستخرج ونقائه عن طريق قياس الأشعة فوق البنفسجية. لتحديد النقاء نسب OD 260/280 نانومتر و OD 260/230 نانومتر.
- تقييم سلامة الحمض النووي الجينومي عن طريق تحميل 200 نانوغرام من كل عينة على هلام الأغاروز بنسبة 0.8٪ ومقارنة توزيع الحجم بعلامة جزيئية عالية الوزن.
- تكليف خدمة خارجية بإعداد شظايا 16S rRNA وتسلسلها وتحليلها المقارن للتسلسل الذي تم الحصول عليه (1000 نقطة أساس) مع تلك الموجودة في قاعدة بيانات النيوكليوتيدات التابعة للمركز الوطني الأمريكي لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI)33.
- لتأكيد بيانات تسلسل 16S rRNA ، قم أيضا بإجراء الريبوتايب الآلي على الحمض النووي الكروموسومي المهضوم (الخدمة الخارجية ، جدول المواد).
- في الحالة التي لا يمكن فيها تحديد تحديد العينة فقط باستخدام بيانات الريبو ، قم بإجراء تحليل MALDI-TOF MS لتحديد الأحماض الدهنية.
- لإجراء تحليل جيني للجنس الذي تم تحديده ، قم بتحليل تسلسل 16S rRNA للعزل باستخدام BLASTn34. يجب استخدام التسلسلات ذات الهويات من 99٪ إلى 97٪ لبناء محاذاة تسلسل متعددة باستخدام CLUSTAL Omega35. قم بإنشاء شجرة مجاورة متصلة باستخدام الخيار الافتراضي ClustalW2 (Simple Phylogeny).
4. المعادن الثقيلة والمضادات الحيوية القابلية
- قم بتلقيح العزل من مخزون الجلسرين (انظر الخطوة 2.5) وقم بزراعته في 200 مل من LB تحت ظروف الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة المثلى المحددة مسبقا.
- تمييع كل زراعة مسبقة عند 0.1 OD600 نانومتر في 5 مل من وسط LB (عند درجة الحموضة المناسبة) تحتوي على تركيزات متزايدة من المعادن الثقيلة. وتتراوح التركيزات بين 0.01 و120 مللي متر للمعادن الثقيلة [As(V) وAs(III) وCd(II) وCo(III) وCr(VI) وCu(II) وHg(II) وNi(II) وV(V)] أو 0.5-1 ملغم/مل للمضادات الحيوية [الأمبيسلين، والباسيتراسين، والكلورامفينيكول، وسيبروفلوكساسين، والإريثروميسين، والكاناميسين، والستربتومايسين، والتتراسيكلين، والفانكومايسين].
- إجراء علاجات المعادن الثقيلة والمضادات الحيوية بشكل منفصل. استخدم أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل وقم بزراعة الخلايا في شاكر مداري يتم التحكم في درجة حرارته بمعدل اهتزاز يبلغ 180 دورة في الدقيقة عند 55 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لكل حالة / علاج.
- حساب الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) إما للمضادات الحيوية أو المعادن الثقيلة عن طريق تحديد قيم التركيز في الأنابيب التي لا يحدث فيها نمو ميكروبي ، أي تحديد القيم التي تمنع نمو الخلايا تماما بعد 16 ساعة.
- تحقق من أن التركيز مثبط وغير قاتل للخلايا عن طريق طلاء 200 ميكرولتر من المزرعة المزروعة بالقيمة التي تعتبر MIC على ألواح LB-agar (عند درجة الحموضة ودرجة الحرارة المناسبة) والتحقق من وجود مستعمرات بعد حضانة ON.
ملاحظة: نظرا لأن الثقافة الموجودة على صفيحة LB agar قابلة للحياة عند 4 درجات مئوية فقط لبضعة أسابيع ، من أجل الحفاظ على العزلات لفترة أطول ، تم تحضير مخزون الجلسرين وتخزينه عند -80 درجة مئوية. لتحديد MIC ، تم إجراء ما لا يقل عن ثلاث نسخ متماثلة مستقلة باستخدام ثقافات مستقلة. تم حساب الانحراف المعياري بين التجارب الثلاثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
موقع أخذ العينات
يوضح هذا البروتوكول طريقة لعزل البكتيريا المقاومة للمعادن الثقيلة من الينابيع الساخنة. في هذه الدراسة ، تم استخدام منطقة Pisciarelli ، وهي بيئة حرارية أرضية حمضية كبريتية ، كموقع لأخذ العينات (الشكل 1). يتميز هذا النظام البيئي بتدفق السوائل الكبريتية العدوانية المشتقة من الأنشطة البركانية. وقد ثبت أن المجتمعات الميكروبية في نظم الطاقة الحرارية الأرضية الحمضية الكبريتية تتعرض لضغط انتقائي شديد ناتج عن وجود تركيزات عالية من المعادن الثقيلة. تم جمع العينات في فترتين مختلفتين من السنة (أبريل وسبتمبر) من 2,21 بركة طينية هامشية فيما يتعلق ببركة الطين الفقاعي. في بركة الطين ، تم تسجيل تقلبات في قيم الرقم الهيدروجيني (~ الرقم الهيدروجيني 6 في أبريل و ~ الرقم الهيدروجيني 5 في سبتمبر) ، في حين كانت درجة الحرارة ~ 55 درجة مئوية في كلتا الحالتين. ومع ذلك ، تم تسجيل درجات حرارة أعلى أيضا في بركة الطين (~ 70 درجة مئوية) في سنوات أخرى32.
العزل وتحديد الهوية
تم تلقيح العينات التي تم جمعها في وسط LB وتحضينها لمدة 24 ساعة عند 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية كما ذكر سابقا ، وبالتالي وضع الظروف المختبرية لنمو عينات الخلايا لمحاكاة الظروف الكيميائية الفيزيائية البيئية. لصالح نمو الخلايا ، تم ربط مستعمرات مفردة على الصفيحة وعزلها بعد عدة تخفيفات (3 على الأقل) في وسط غني بالسائل ؛ أظهرت السلالات المعزولة درجة نموها المثلى عند 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية (الشكل 2). لتحديد العزلات الجديدة ، تم إجراء إعداد الحمض النووي الجيني وتم إنجاز تسلسل 16S rRNA وتحليل الطيف الكتلي للأحماض الدهنية كخدمة خارجية. كما ورد في التقارير ، فإن تحليل الأحماض الدهنية هو طريقة تحليل حيوي قوية تساعد في التحديد الدقيق للبكتيريا عند دمجها مع أساليب أخرى36. تم استخدام محاذاة متعددة من 16S rRNA لبناء شجرة التكاثر لتحديد أقرب الأقارب37.
اختبار قابلية المعادن الثقيلة
التعايش بين الجزيئات السامة يميز البيئات الانفرادية. على وجه الخصوص ، تتميز الينابيع الساخنة في Pisciarelli بمستويات عالية من CO 2 و H2 Sو NH4 في التعايش مع As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. ولهذا السبب، أجري توصيف ظاهري نموذجي للكائنات الحية الدقيقة المعزولة في وجود تركيز متزايد من المعادن الثقيلة، على النحو الوارد في الجدول 1. ومن المثير للاهتمام أن العزل 1 أظهر تسامحا أعلى مع As(V) و V(V). يمكن أن تكون المقاومة العالية لكل من الزرنيخات والفانادات بسبب هياكلها الكيميائية. في الواقع ، يشبه كلا الأيونين أيونات الفوسفات ، مما يشير إلى أن V(V) و As(V) يمكن أن تتناولهما الخلايا من خلال أنظمة نقل الفوسفات. تبين أن هذه العزلات مقاومة أيضا ل Cd (II) ، على الرغم من أن قيمة MIC كانت منخفضة نسبيا. يمكن تفسير هذه النتيجة بعدم وجود CD (II) في المجموعة. على الرغم من أن اثنين من الكائنات الحية الدقيقة تم أخذ عينات منها في نفس الموقع ، إلا أنهما أظهرا ملامح مختلفة لمقاومة المعادن الثقيلة. ومع ذلك، فقد تم أخذ عينات منها في فترات مختلفة، مما يشير إلى التباين المعتمد على الموسم في تركيز المعادن الثقيلة باعتباره القوة الدافعة الرئيسية التي تشكل تكوين المجتمعات الميكروبية ومقاومتها التفاضلية للمعادن الثقيلة39. من هذه البيانات المقارنة ، تبين أن العزل 1 لديه مقاومة قوية ل As(V) ، بينما يعزل 2 ل As(III). هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات الجينية لكشف آليات المقاومة الجزيئية وفهم أفضل لكيفية تأثر الأنماط الظاهرية بالضغط الانتقائي للينابيع الساخنة.
اختبارات مقاومة المضادات الحيوية
عادة ما تظهر السلالات الميكروبية التي تطورت في البيئات القاسية مقاومة للمضادات الحيوية المختلفة. العلاقة بين مقاومة المعادن الثقيلة والمضادات الحيوية معروفةجيدا 40. لهذا السبب ، اختبرنا مقاومة المضادات الحيوية لكلا العزلين (الجدول 2). أظهر Isolate 1 حساسية عالية لجميع المضادات الحيوية التي تم اختبارها ، حتى عند استخدام تركيزات منخفضة. في المقابل ، فإن العزل 2 مقاوم لجميع المضادات الحيوية التي تم اختبارها ، باستثناء الكلورامفينيكول والتتراسيكلين. ومن المثير للاهتمام أن قيم MIC المحددة تجاه الأمبيسلين والإريثروميسين والكاناميسين والستربتومايسين والفانكومايسين كانت قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في البكتيريا الأخرى المقاومة للمضادات الحيوية وحتى أعلى من ذلك بالنسبة للباسيتراسين وسيبروفلوكساسين41. هذه البيانات الرائعة تستحق المزيد من التحقيقات. ربما ، بسبب الطفرات العشوائية أو نقل الجينات الأفقي ، اكتسبت الكائنات الحية الدقيقة مقاومة للمضادات الحيوية ، والتي يمكن أن تمثل ميزة انتقائية في مثل هذه الظروف البيئية القاسية.
الشكل 1. موقع أخذ العينات: منطقة سولفاتاريك في بيشياريللي، كامبي فليغري (نابولي، إيطاليا). يقع موقع أخذ العينات في 40 ° 49' 45.3" N - 14 ° 08' 49.9 E ، في منطقة الطاقة الحرارية الأرضية في Pisciarelli fumarole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التمثيل التخطيطي للإجراء التجريبي. يتم أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة في الينابيع الساخنة ، وتزرع في المختبر ، ويتم عزلها من خلال التدرج والطلاء المتكرر ، ويتم تحديدها وراثيا على تسلسل 16S rRNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أيونات المعادن | عزل 1 | عزل 2 |
| كما (III) | 1.9 ملليمتر | 41 مللي متر |
| ك (V) | 117 مللي متر | 11 مللي متر |
| القرص المضغوط (II) | 0.9 ملليمتر | 0.8 ميكرومتر |
| شركة (II) | 2 مللي متر | 3 مللي متر |
| شركة (III) | 2.75 ملليمتر | ن.أ. |
| Cr (VI) | 0.25 مللي متر | ن.أ. |
| Cu (II) | 4.1 مللي متر | 0.5 مللي متر |
| الزئبق (الثاني) | 20 ميكرومتر | 17 ميكرومتر |
| ني (II) | 1.3 ملليمتر | 30 مللي متر |
| الخامس (الخامس) | 128 ملليمتر | ن.أ |
الجدول 1. قيم MIC نحو أيونات المعادن الثقيلة للعزلات. تعتبر MICs قيم التركيز الدنيا التي تمنع نمو الخلايا تماما بعد 16 ساعة ؛ يتم الإبلاغ عن القيم كمتوسط ثلاث تجارب.
| المضادات الحيويه | عزل 1 | عزل 2 |
| الأمبيسلين | بدون تاريخ. | 20 ميكروغرام/مل |
| باسيتراسين | بدون تاريخ. | 700 ميكروغرام/مل |
| الكلورامفينيكول | بدون تاريخ. | <0.5 ميكروغرام / مل |
| سيبروفلوكساسين | بدون تاريخ. | >1 ملغم/مل |
| الاريثروميسين | بدون تاريخ. | 70 ميكروغرام/مل |
| كاناميسين | بدون تاريخ. | 80 ميكروغرام/مل |
| ستربتومايسين | بدون تاريخ. | 70 ميكروغرام/مل |
| التتراسيكلين | بدون تاريخ. | <0.5 ميكروغرام / مل |
| فانكومايسين | بدون تاريخ. | 1 ميكروغرام/مل |
الجدول 2. قيم MIC تجاه المضادات الحيوية للعزلات. تعتبر MICs الحد الأدنى من التركيزات التي تمنع نمو الخلايا تماما بعد 16 ساعة ؛ يتم الإبلاغ عن القيم كمتوسط ثلاث تجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحتوي الينابيع الساخنة على تنوع غير مستغل من الميكروبات ذات قدرات استقلابية متنوعة بنفس القدر12. ويمثل وضع استراتيجيات لعزل الكائنات الحية الدقيقة التي يمكنها تحويل المعادن الثقيلة بكفاءة إلى مركبات أقل سمية10 مجالا بحثيا يحظى باهتمام متزايد في جميع أنحاء العالم. تهدف هذه الورقة إلى وصف نهج مبسط لفحص وعزل الميكروبات مع القدرة على مقاومة المواد الكيميائية السامة. يمكن تعديل الطريقة الموصوفة بسهولة لعزل الميكروبات من مصادر بيئية متنوعة مثل الماء أو الغذاء أو التربة أو الرواسب. ومع ذلك ، هناك بعض القيود في هذه التقنية المتعلقة بالاعتماد على زراعة الميكروبات. لذلك ، لن يكون هذا الإعداد مناسبا لعزل البكتيريا عن بيئة لا يمكن زراعتها بسهولة. تتمثل إحدى طرق التغلب على هذه المشكلة في استخدام وسائط بكتيرية مختلفة (أي وسائط انتقائية أو استراتيجيات ما قبل التكيف) وأوقات حضانة أطول42.
ومع ذلك، من المتوقع أن تنمو غالبية الأنواع ذات الأهمية للمعالجة البيولوجية في ظل الظروف الموصوفة هنا. يتمتع هذا البروتوكول ببعض المزايا مقارنة بتقنيات الطلاء التقليدية ، بالنظر إلى أن وسائط الأجار الانتقائية للمواد الكيميائية غير معروفة حتى الآن. إن استخدام MIC لتحديد الميكروبات المقاومة هو استراتيجية سريعة يمكن استغلالها على العزلات الفردية التي تفتح الطريق أمام توصيف أنواع جديدة أو سلالات جديدة. توضح هذه الدراسة فائدة هذه الطريقة لاختيار الكائنات الحية الدقيقة البيئية التي يمكن أن تسهم في المعالجة الحيوية الفعالة عن طريق تعطيل الملوثات وتحويلها إلى منتجات غير ضارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing" ، PRIN 2017-PANACEA CUP: E69E19000530001 و GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-BY-WASTE - reduce WASTE ، MIUR 2017-JTNK78.006 ، إيطاليا. نشكر الدكتورة مونيكا بيوتشي والدكتورة أنجيلا مورمون (المعهد الوطني للجيوفيسيكا وعلم الفولكانولوجيا، Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano، إيطاليا) على تحديد وتوصيف موقع الطاقة الحرارية الأرضية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
