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Environment

पर्यावरण प्रदूषण को संबोधित करने के लिए Extremophilic सूक्ष्मजीवों के bioprospecting

Published: December 30, 2021 doi: 10.3791/63453
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1,4, 1, 1,4
1Department of Biology, University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB), Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering, Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology, University of Napoli Federico II

Summary

भू-तापीय स्प्रिंग्स से भारी धातु-प्रतिरोधी रोगाणुओं का अलगाव बायोरेमेडिएशन और पर्यावरण निगरानी बायोसिस्टम के विकास के लिए एक गर्म विषय है। यह अध्ययन गर्म झरनों से भारी धातु सहिष्णु बैक्टीरिया को अलग करने और पहचानने के लिए एक पद्धतिगत दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Abstract

भू-तापीय स्प्रिंग्स गहरे जलभृत में होने वाले चट्टान और पानी के बीच बातचीत के कारण विभिन्न धातु आयनों में समृद्ध होते हैं। इसके अलावा, पीएच और तापमान में मौसमी भिन्नता के कारण, तत्व संरचना में उतार-चढ़ाव समय-समय पर इन चरम वातावरण के भीतर मनाया जाता है, जो पर्यावरणीय माइक्रोबियल समुदायों को प्रभावित करता है। ज्वालामुखीय थर्मल वेंट्स में पनपने वाले एक्सट्रेमोफिलिक सूक्ष्मजीवों ने पर्यावरण में मौजूद कई धातु आयनों को संभालने के लिए प्रतिरोध तंत्र विकसित किया है, इस प्रकार जटिल धातु जैव रासायनिक चक्रों में भाग ले रहा है। इसके अलावा, extremophiles और उनके उत्पादों को बाजार में एक व्यापक पैर जमाने के लिए पाया गया है, और यह विशेष रूप से उनके एंजाइमों के लिए सच है। इस संदर्भ में, उनका लक्षण वर्णन पर्यावरणीय निगरानी और बायोरेमेडिएशन के लिए बायोसिस्टम और बायोप्रोसेस के विकास के लिए कार्यात्मक है। आज तक, एक्सट्रीमोफिलिक सूक्ष्मजीवों की प्रयोगशाला स्थितियों के तहत अलगाव और खेती अभी भी उनकी जैव-तकनीकी क्षमता का पूरी तरह से शोषण करने के लिए एक बाधा का प्रतिनिधित्व करती है। यह काम गर्म स्प्रिंग्स से थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवों के अलगाव के साथ-साथ निम्नलिखित चरणों के माध्यम से उनके जीनोटाइपिकल और फेनोटाइपिक पहचान के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है: (1) भू-तापीय साइटों से सूक्ष्मजीवों का नमूना ("पिसियारेली", नेपल्स, इटली में कैम्पी फ्लेग्रेई का एक ज्वालामुखीय क्षेत्र); (2) भारी धातु प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों का अलगाव; (3) माइक्रोबियल आइसोलेट्स की पहचान; (4) आइसोलेट्स के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन। इस काम में वर्णित तरीकों को आम तौर पर अन्य चरम वातावरण से सूक्ष्मजीवों के अलगाव के लिए भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

हमारे ग्रह पर चरम वातावरण सूक्ष्मजीवों के उत्कृष्ट स्रोत हैं जो कठोर परिस्थितियों (यानी, तापमान, पीएच, लवणता, दबाव और भारी धातुओं) को सहन करने में सक्षम हैं 1,2, आइसलैंड, इटली, संयुक्त राज्य अमेरिका, न्यूजीलैंड, जापान, मध्य अफ्रीका और भारत होने के नाते, सबसे अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त और अध्ययन किए गए ज्वालामुखीय क्षेत्र 3,4,5,6,7,8,9 . थर्मोफाइल 45 डिग्री सेल्सियस से 80 डिग्री सेल्सियस10,11,12 तक के तापमान की एक सीमा में कठोर वातावरण में विकसित हुए हैं। थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव, या तो आर्कियल या बैक्टीरियल राज्यों से संबंधित हैं, जैव विविधता, फाइलोजेनेसिस और औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए अनन्य बायोमोलेक्यूल्स के उत्पादन के अध्ययन के लिए एक जलाशय हैं 13,14,15,16। दरअसल, पिछले दशकों में, वैश्विक बाजार में निरंतर औद्योगिक मांग ने कई जैव-तकनीकी क्षेत्रों में अपने विविध अनुप्रयोगों के लिए एक्सट्रीमोफाइल्स और थर्मोजाइम के शोषण को प्रोत्साहित किया है 17,18,19।

हॉट स्प्रिंग्स, जहां जीव कंसोर्शिया में रहते हैं, जैव विविधता के समृद्ध स्रोत हैं, इस प्रकार माइक्रोबियल पारिस्थितिकी20,21 का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक आवास का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, इन ज्वालामुखीय धातु-समृद्ध क्षेत्रों को आमतौर पर सूक्ष्मजीवों द्वारा उपनिवेशित किया जाता है जिन्होंने जीवित रहने और भारी धातुओं की उपस्थिति के अनुकूल होने के लिए सहिष्णुता प्रणालियों को विकसित किया है22,23 और इसलिए सक्रिय रूप से उनके जैव रासायनिक चक्रों में शामिल हैं। आजकल, भारी धातुओं को मनुष्यों और पर्यावरण के लिए प्राथमिकता प्रदूषक माना जाता है। भारी-धातु-प्रतिरोधी सूक्ष्मजीव धातुओं को बदलने और उनके पारिस्थितिक तंत्र24,25 को फिर से तैयार करके धातुओं को घुलनशील और अवक्षेपित करने में सक्षम हैं। भारी धातु प्रतिरोध के आणविक तंत्र की समझ उपन्यास हरे रंग के दृष्टिकोण 26,27,28 को विकसित करने की तात्कालिकता के लिए एक गर्म विषय है। इस संदर्भ में, नए सहिष्णु बैक्टीरिया की खोज पर्यावरणीय बायोरेमेडिएशन24,29 के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करती है। सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रक्रियाओं के माध्यम से हाइड्रोथर्मल वातावरण का पता लगाने और भारी धातु सहिष्णुता को रेखांकित करने वाले जीन (ओं) की भूमिका पर ज्ञान बढ़ाने के प्रयासों के साथ, इटली में कैम्पी फ्लेग्रेई के हॉट-स्प्रिंग क्षेत्र में एक माइक्रोबियल स्क्रीनिंग आयोजित की गई थी। यह भारी धातु-समृद्ध वातावरण एक शक्तिशाली हाइड्रोथर्मल गतिविधि, फ्यूमारोल, और उबलते पूल, पीएच में चर और मौसम, वर्षा और भूमिगत भूवैज्ञानिक आंदोलनों की निर्भरता में तापमान30 दिखाता है। इस परिप्रेक्ष्य में, हम भारी धातुओं के लिए प्रतिरोधी बैक्टीरिया को अलग करने के लिए एक आसान-से-लागू और प्रभावी तरीके का वर्णन करते हैं, उदाहरण के लिए, जियोबैसिलस स्टीयरोथर्मोफिलस जीएफ 1631 (आइसोलेट 1 के रूप में नामित) और एलिसिक्लोबैसिलस माली FL1832 (आइसोलेट 2 के रूप में नामित) कैम्पी फ्लेग्रेई के पिसियारेली क्षेत्र से।

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Protocol

1. भू-तापीय साइटों से सूक्ष्मजीवों का नमूना

  1. वांछित तापमान और पीएच के साथ मानदंड स्थानों के रूप में उपयोग करके नमूनाकरण के लिए साइट चुनें। एक डिजिटल थर्मोकपल जांच के माध्यम से भौतिक मापदंडों को मापें, इसे चयनित पूल या कीचड़ में डालें।
  2. मिट्टी के नमूनों के 20 ग्राम ले लीजिए (इस मामले में, Pisciarelli Solfatara के हाइड्रोथर्मल साइट में कीचड़ से), उन्हें एक निष्फल चम्मच के साथ उठा। चुने गए प्रत्येक साइट के लिए कम से कम दो नमूने लें।
  3. नमूने 50 मिलीलीटर बाँझ polypropylene ट्यूब में रखो और तुरंत बंद करो.
  4. सीधे नमूना साइट में डालने से एक डिजिटल थर्मोकपल जांच के साथ पीएच और तापमान को मापें। उपयोग के बाद, विआयनीकृत पानी के साथ जांच को ध्यान से कुल्ला करें।

2. भारी धातु प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों का अलगाव

नोट: एक बाँझ जैविक हुड के तहत 2.1-2.7 चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. ताजा तैयार लुरिया-बर्टानी माध्यम (एलबी) के 50 एमएल में प्रत्येक एकत्र किए गए नमूने के 2 ग्राम को संक्रमित करें, जिसमें पीएच को एचसीएल या एनएओएच के अतिरिक्त के माध्यम से 4 या 7 में समायोजित किया गया है।
  2. नमूने को नमूना स्थल के एक ही तापमान पर और ±5 डिग्री सेल्सियस (55 डिग्री सेल्सियस और पिसियारेली नमूनों के लिए 60 डिग्री सेल्सियस) पर 180 आरपीएम की हिलाने की दर के साथ 24 घंटे के लिए तापमान-नियंत्रित कक्षीय शेकर में इनक्यूबेट करें।
  3. एलबी आगर (पीएच 4 या पीएच 7) पर उगाए गए नमूनों की प्लेट 200 μL और 55 डिग्री सेल्सियस या 60 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए स्थिर स्थिति में इनक्यूबेट करें।
  4. एकल उपनिवेशों को अलग करें और कम से कम तीन बार लकीर-चढ़ाना चक्र (चरण 2.3 और 2.4) दोहराएं।
  5. -80 डिग्री सेल्सियस जमे हुए सेल स्टॉक तैयार करने के लिए, रातभर (ऑन) संस्कृतियों को बढ़ाएं और उगाई गई कोशिकाओं में 20% ग्लिसरॉल (1 एमएल की अंतिम मात्रा में) जोड़ें; तेजी से ठंड के लिए एसीटोन और सूखी बर्फ के मिश्रण का उपयोग करें।
  6. ग्लिसरॉल स्टॉक से एक इनोकुलम तैयार करने के लिए, एलबी (पीएच 4 या पीएच 6) के 50 मिलीलीटर में 50 μL को टीका लगाएं और 180 आरपीएम पर कक्षीय शेकर में 55 डिग्री सेल्सियस या 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. एक विकास प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए, एलबी (पीएच 4 या पीएच 6) के 10 मिलीलीटर में 0.1 ओडी600 एनएम तक एक प्रीकल्चर (चरण 2.6 से प्राप्त) को पतला करें, कक्षीय शेकर में 16 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस या 60 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएं, और 30 मिनट के अंतराल पर ओडी600 एनएम को मापें।
  8. X-अक्ष पर समय (मिनट) और Y-अक्ष पर OD600 nm के साथ चरण 2.7 में प्राप्त डेटा से एक वृद्धि वक्र बनाएँ।
  9. चरण 2.7 और 2.8 में वर्णित एक ही विकास वक्र का एहसास करें, लेकिन प्रयोगशाला की स्थिति के लिए इष्टतम पीएच निर्धारित करने के लिए संस्कृति माध्यम के पीएच (± 1 इकाई) (उदाहरण के लिए, पीएच 4 पर उगाए गए नमूनों के लिए पीएच 3 और 5) को अलग करना।

3. माइक्रोबियल आइसोलेट्स की पहचान

  1. जीनोमिक डीएनए की तैयारी
    1. एलबी माध्यम (पीएच 4 या पीएच 6) के 50 मिलीलीटर में ग्लिसरॉल स्टॉक से लकीरदार आइसोलेट को संक्रमित करें और 55 डिग्री सेल्सियस या 180 आरपीएम पर 60 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेकर में बढ़ें।
    2. 5000 x g पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा ON संस्कृति फसल. supernatant को छोड़ दें।
    3. बैक्टीरिया लाइसिस बफर के 10 मिलीलीटर तैयार करें: 20 mM Tris-HCl पीएच 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100, और लाइसोजाइम (20 mg / mL) उपयोग से तुरंत पहले।
    4. बैक्टीरिया लाइसिस बफर के 180 μL में गोली resuspend. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए जीनोमिक डीएनए शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिका) द्वारा इंगित दिशानिर्देशों का पालन करें।
    6. निकाले गए जीनोमिक डीएनए और इसकी शुद्धता को यूवी-विस माप द्वारा मापें। शुद्धता के लिए अनुपात निर्धारित करें-OD 260/280 nm और OD 260/230 nm।
    7. एक 0.8% agarose जेल पर प्रत्येक नमूने के 200 एनजी लोड करके जीनोमिक डीएनए की अखंडता का आकलन करें और एक उच्च वजन आणविक मार्कर के लिए आकार वितरण की तुलना करें।
    8. एक बाहरी सेवा के लिए आयोग 16S rRNA टुकड़ा तैयारी, अनुक्रमण, और प्राप्त अनुक्रम के तुलनात्मक विश्लेषण (1000 बीपी) यूएस नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन (एनसीबीआई) 33 के न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस में मौजूद लोगों के साथ।
  2. 16S rRNA अनुक्रमण के डेटा की पुष्टि करने के लिए, पचे हुए क्रोमोसोमल डीएनए (बाहरी सेवा, सामग्री की तालिका) पर स्वचालित राइबोटिपिंग भी करते हैं।
  3. उस मामले में जिसमें विशिष्ट पहचान केवल राइबोटिपिंग डेटा के साथ निर्धारित नहीं की जा सकती है, फैटी एसिड पहचान के लिए एक MALDI-TOF एमएस विश्लेषण कमीशन करें।
  4. पहचाने गए जीनस का एक फाइलोजेनेटिक विश्लेषण करने के लिए, BLASTn34 के साथ आइसोलेट के 16S rRNA अनुक्रम का विश्लेषण करें। CLUSTAL ओमेगा 35 का उपयोग करके एकाधिक अनुक्रम संरेखण बनाने के लिए 99% से 97% तक की पहचान वालेअनुक्रमों का उपयोग किया जाना चाहिए। ClustalW2 (सरल Phylogeny) के डिफ़ॉल्ट विकल्प का उपयोग करके एक पड़ोसी-शामिल होने वाले पेड़ का निर्माण करें।

4. भारी धातुओं और एंटीबायोटिक्स संवेदनशीलता

  1. ग्लिसरॉल स्टॉक से आइसोलेट को टीका लगाएं (चरण 2.5 देखें) और इसे पहले से निर्धारित इष्टतम पीएच और तापमान की स्थिति के तहत एलबी के 200 मिलीलीटर में बढ़ाएं।
  2. एलबी माध्यम (उपयुक्त पीएच पर) के 5 मिलीलीटर में0.1 ओडी 600 एनएम पर प्रत्येक प्रीकल्चर को पतला करें जिसमें भारी धातुओं की बढ़ती सांद्रता होती है। सांद्रता भारी धातुओं के लिए 0.01-120 mM से भिन्न होती है [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] या एंटीबायोटिक दवाओं के लिए 0.5-1 mg/mL [Ampicillin, Bacitracin, Chloramphenicol, Ciprofloxacin, Erythromycin, Kanamycin, Streptomycin, Tetracycline, और Vancomycin]।
  3. भारी धातु और एंटीबायोटिक उपचार अलग से करें। एक 50 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब का उपयोग करें और प्रत्येक स्थिति / उपचार के लिए 16 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस या 60 डिग्री सेल्सियस पर 180 आरपीएम की मिलाते हुए दर के साथ तापमान-नियंत्रित कक्षीय शेकर में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  4. न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) की गणना करें या तो एंटीबायोटिक दवाओं या भारी धातुओं के लिए ट्यूबों में एकाग्रता मूल्यों की पहचान करके जहां माइक्रोबियल विकास नहीं होता है, यानी, उन मूल्यों का निर्धारण करना जो 16 घंटे के बाद सेल विकास को पूरी तरह से रोकते हैं।
  5. जांचें कि एकाग्रता निरोधात्मक है और कोशिकाओं के लिए घातक नहीं है, उस मूल्य पर उगाई गई संस्कृति के 200 μL को चढ़ाना जो एलबी-आगर प्लेटों (उचित पीएच और तापमान पर) पर एमआईसी के रूप में माना जाता है और ऑन इनक्यूबेशन के बाद उपनिवेशों की उपस्थिति को सत्यापित करता है।
    नोट: चूंकि एलबी आगर प्लेट पर संस्कृति केवल कुछ हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर व्यवहार्य है, इसलिए लंबे समय तक आइसोलेट्स को संरक्षित करने के लिए, ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार किए गए थे और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। एमआईसी निर्धारण के लिए, स्वतंत्र संस्कृतियों का उपयोग करके कम से कम तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां की गई थीं। मानक विचलन की गणना तीन प्रतियों के प्रयोगों के बीच की गई थी।

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Representative Results

नमूना साइट
यह प्रोटोकॉल एक गर्म वसंत से भारी धातु प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अलगाव के लिए एक विधि को दर्शाता है। इस अध्ययन में, पिस्सिएरेली क्षेत्र, एक एसिड-सल्फिडिक भू-तापीय वातावरण, का उपयोग एक नमूना साइट (चित्रा 1) के रूप में किया गया था। इस पारिस्थितिकी तंत्र को ज्वालामुखीय गतिविधियों से प्राप्त आक्रामक सल्फरस तरल पदार्थों के प्रवाह की विशेषता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि एसिड-सल्फिडिक भू-तापीय प्रणालियों में माइक्रोबियल समुदायों को भारी धातुओं की उच्च सांद्रता की उपस्थिति से किए गए अत्यधिक चयनात्मक दबाव के अधीन किया जाता है। नमूने वर्ष की दो अलग-अलग अवधियों (अप्रैल और सितंबर) में2,21 से एकत्र किए गए थे, जो एक बुदबुदाते हुए मिट्टी के पूल के संबंध में सीमांत एक मिट्टी का पूल था। मिट्टी के पूल में, पीएच मूल्यों में उतार-चढ़ाव (अप्रैल में ~ पीएच 6 और सितंबर में ~ पीएच 5) दर्ज किए गए थे, जबकि दोनों मामलों में तापमान ~ 55 डिग्री सेल्सियस था। हालांकि,अन्य वर्षों में मिट्टी के पूल (~ 70 डिग्री सेल्सियस) में उच्च तापमान भी दर्ज किया गया था।

अलगाव और पहचान
एकत्र किए गए नमूनों को एलबी माध्यम में संक्रमित किया गया था और 55 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था, इसलिए पर्यावरणीय रासायनिक-भौतिक स्थितियों की नकल करने के लिए सेल नमूनों के विकास के लिए प्रयोगशाला की स्थिति निर्धारित की गई थी। सेल विकास के पक्ष में, एकल उपनिवेशों को प्लेट पर लकीरदार किया गया था और एक समृद्ध-तरल माध्यम में कई कमजोर पड़ने (कम से कम 3) के बाद अलग किया गया था; अलग उपभेदों ने 55 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2) पर अपने इष्टतम विकास तापमान को दिखाया। नए आइसोलेट्स की पहचान करने के लिए, एक जीनोमिक डीएनए तैयारी की गई थी और 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण और फैटी एसिड मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण को बाहरी सेवा के रूप में पूरा किया गया था। जैसा कि बताया गया है, फैटी एसिड का विश्लेषण एक शक्तिशाली बायोएनालिटिकल विधि है जो अन्यदृष्टिकोणों के साथ संयुक्त होने पर बैक्टीरिया की सटीक पहचान में मदद करती है। निकटतम रिश्तेदारों की पहचान करने के लिए फाइलोजेनेटिक ट्री बनाने के लिए 16S rRNA के एकाधिक संरेखणका उपयोग किया गया था।

भारी धातु संवेदनशीलता परीक्षण
विषाक्त अणुओं का सह-अस्तित्व सोल्फेटेरिक वातावरण की विशेषता है। विशेष रूप से, Pisciarelli में गर्म स्प्रिंग्स CO 2, H2 S, NH4 के उच्च स्तर की विशेषता है, As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38 के साथ सह-अस्तित्व में। इस कारण से, अलग-थलग सूक्ष्मजीवों का एक फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन भारी धातुओं की बढ़ती एकाग्रता की उपस्थिति में किया गया था, जैसा कि तालिका 1 में बताया गया है। दिलचस्प बात यह है कि आइसोलेट 1 ने एएस (वी) और वी (वी) के लिए उच्च सहिष्णुता दिखाई। आर्सेनेट और वैनाडेट दोनों के लिए उच्च प्रतिरोध उनकी रासायनिक संरचनाओं के कारण हो सकता है; वास्तव में, दोनों आयन फॉस्फेट आयनों के समान हैं, यह सुझाव देते हुए कि वी (वी) और एएस (वी) को फॉस्फेट परिवहन प्रणालियों के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है। ये आइसोलेट्स सीडी (II) के लिए भी प्रतिरोधी साबित हुए, हालांकि एमआईसी मान अपेक्षाकृत कम था। इस परिणाम को पूल में Cd(II) की अनुपस्थिति से समझाया जा सकता है। हालांकि दो सूक्ष्मजीवों को एक ही साइट में नमूना लिया गया था, लेकिन उन्होंने अलग-अलग भारी धातु प्रतिरोध प्रोफाइल दिखाए। हालांकि, उन्हें विभिन्न अवधियों में नमूना लिया गया था, इस प्रकार माइक्रोबियल समुदायों की संरचना को आकार देने वाले मुख्य प्रेरक बल के रूप में भारी धातुओं की एकाग्रता में मौसम-निर्भर भिन्नता की ओर इशारा किया गया था और भारी धातुओं के लिए उनके विभेदक प्रतिरोध39। इस तुलनात्मक डेटा से, यह दिखाया गया है कि आइसोलेट 1 में As(V) के लिए एक मजबूत प्रतिरोध है, जबकि As(III) के लिए 2 को अलग करें। आणविक प्रतिरोध तंत्र को सुलझाने और बेहतर ढंग से समझने के लिए आगे की आनुवंशिक जांच की आवश्यकता होती है कि फेनोटाइप गर्म स्प्रिंग्स के चयनात्मक दबाव से कैसे प्रभावित होते हैं।

एंटीबायोटिक्स प्रतिरोध परीक्षण
चरम वातावरण में विकसित माइक्रोबियल उपभेद आमतौर पर विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध का प्रदर्शन करते हैं। भारी धातु प्रतिरोध और एंटीबायोटिक दवाओं के बीच सहसंबंध अच्छी तरह से ज्ञातहै 40। इस कारण से, हमने दोनों आइसोलेट्स के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध का परीक्षण किया (तालिका 2)। आइसोलेट 1 ने सभी परीक्षण किए गए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उच्च संवेदनशीलता दिखाई, तब भी जब कम सांद्रता का उपयोग किया गया था। इसके विपरीत, आइसोलेट 2 परीक्षण किए गए सभी एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी है, क्लोरैम्फेनिकोल और टेट्रासाइक्लिन के अपवाद के साथ। दिलचस्प बात यह है कि एम्पीसिलिन, एरिथ्रोमाइसिन, कानामायसिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और वैनकोमाइसिन की ओर निर्धारित एमआईसी मूल्य अन्य एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी बैक्टीरिया के तुलनीय थे और यहां तक कि बैसिट्रासिन और सिप्रोफ्लोक्सासिन41 के लिए भी अधिक थे। ये आकर्षक डेटा आगे की जांच के लायक हैं; शायद, यादृच्छिक उत्परिवर्तन या क्षैतिज जीन हस्तांतरण के कारण, सूक्ष्मजीव ने एंटीबायोटिक प्रतिरोध हासिल कर लिया है, जो इस तरह की चरम पर्यावरणीय स्थितियों में चयनात्मक लाभ का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

Figure 1
चित्र 1. नमूना साइट: Pisciarelli, Campi Flegrei (नेपल्स, इटली) के solfataric क्षेत्र. नमूना साइट 40 ° 49 '45.3" N - 14 ° 08 ' 49.9 E पर स्थित है, Pisciarelli fumarole के भू-तापीय क्षेत्र में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. प्रयोगात्मक प्रक्रिया का योजनाबद्ध निरूपण। सूक्ष्मजीवों को गर्म झरनों में नमूना दिया जाता है, प्रयोगशाला में खेती की जाती है, बार-बार लकीर और चढ़ाना के माध्यम से अलग किया जाता है, और 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण पर जीनोटाइपिक रूप से पहचाना जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

धातु आयनों 1 को अलग करें 2 को अलग करें
के रूप में (III) 1.9 mM 41 mM
के रूप में (V) 117 mM 11 mM
CD (II) 0.9 mM 0.8 μM
Co (II) 2 mM 3 mM
Co (III) 2.75 mM एनए
Cr (VI) 0.25 mM एनए
Cu (II) 4.1 mM 0.5 mM
Hg (II) 20 μM 17 μM
Ni (II) 1.3 mM 30 mM
V (V) 128 mM n.a.

तालिका 1. आइसोलेट्स के भारी धातु आयनों की ओर एमआईसी मान। एमआईसी को न्यूनतम एकाग्रता मूल्यों के रूप में माना जाता है जो 16 घंटे के बाद सेल विकास को पूरी तरह से रोकते हैं; मूल्यों को तीन प्रयोगों के औसत के रूप में रिपोर्ट किया गया है।

एंटीबायोटिक दवाओं 1 को अलग करें 2 को अलग करें
एम्पिसिलिन एन.डी. 20 μg/mL
बेसिट्रासिन एन.डी. 700 μg/mL
Chloramphenicol एन.डी. <.5 μg/mL
सिप्रोफ्लोक्सासिन एन.डी. >1 mg/mL
इरिथ्रोमाइसिन एन.डी. 70 μg/mL
कानामाइसिन एन.डी. 80 μg/mL
स्ट्रेप्टोमाइसिन एन.डी. 70 μg/mL
टेट्रासाइक्लिन एन.डी. <.5 μg/mL
वैंकोमाइसिन एन.डी. 1 μg/mL

तालिका 2. आइसोलेट्स के एंटीबायोटिक दवाओं की ओर एमआईसी मूल्यों। एमआईसी को न्यूनतम सांद्रता के रूप में माना जाता है जो 16 घंटे के बाद सेल विकास को पूरी तरह से रोकता है; मूल्यों को तीन प्रयोगों के औसत के रूप में रिपोर्ट किया गया है।

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Discussion

हॉट स्प्रिंग्स में समान रूप से विविध चयापचय क्षमताओं के साथ माइक्रोबायोम की एक अप्रयुक्त विविधता होतीहै। सूक्ष्मजीवों के अलगाव के लिए रणनीतियों का विकास जो कुशलतापूर्वक भारी धातुओं को कम विषाक्त यौगिकों में परिवर्तित कर सकता है10 दुनिया भर में बढ़ती रुचि के एक शोध क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। इस पेपर का उद्देश्य विषाक्त रसायनों का विरोध करने की क्षमता के साथ रोगाणुओं की स्क्रीनिंग और अलगाव के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करना है। वर्णित विधि को आसानी से विभिन्न पर्यावरणीय स्रोतों जैसे पानी, भोजन, मिट्टी या तलछट से रोगाणुओं को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक में कुछ सीमाएं हैं जो माइक्रोबियल कल्चरिंग पर निर्भरता से संबंधित हैं। इसलिए, यह सेटअप एक ऐसे वातावरण से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए उपयुक्त नहीं होगा जो आसानी से खेती योग्य नहीं है। इस मुद्दे को दूर करने का एक तरीका विभिन्न जीवाणु मीडिया (यानी, चयनात्मक मीडिया या पूर्व-अनुकूलन रणनीतियों) का उपयोग करना है और लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार42।

फिर भी, बायोरेमेडिएशन के लिए ब्याज की अधिकांश प्रजातियों को यहां वर्णित शर्तों के तहत बढ़ने की उम्मीद है। इस प्रोटोकॉल के पारंपरिक चढ़ाना तकनीकों पर कुछ फायदे हैं, यह देखते हुए कि रसायनों के लिए चयनात्मक अगर मीडिया अब तक अज्ञात हैं। प्रतिरोधी रोगाणुओं की पहचान करने के लिए एमआईसी का उपयोग एक त्वरित रणनीति है जो व्यक्तिगत आइसोलेट्स पर शोषण करने के लिए है जो नई प्रजातियों या नए उपभेदों के लक्षण वर्णन का रास्ता खोलती है। यह अध्ययन पर्यावरणीय सूक्ष्मजीवों का चयन करने के लिए ऐसी विधि की उपयोगिता को दर्शाता है जो प्रदूषकों को निष्क्रिय करके और उन्हें हानिरहित उत्पादों में परिवर्तित करके प्रभावी बायोरेमेडिएशन में योगदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम ERA-NET Cofund MarTERA द्वारा समर्थित था: "FLAshMoB: समुद्री बायोसेंसिंग के लिए कार्यात्मक अमाइलॉइड चिमेरा", PRIN 2017-रामबाण कप: E69E19000530001 और GoodbyWaste द्वारा: प्राप्त करेंGOOD उत्पादों-शोषण द्वारा उत्पादों को कम अपशिष्ट, MIUR 2017-JTNK78.006, इटली। हम डॉ मोनिका Piochi और डॉ एंजेला Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, इटली) की पहचान और भूतापीय साइट के लक्षण वर्णन के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732

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References

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

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पर्यावरण विज्ञान अंक 178
पर्यावरण प्रदूषण को संबोधित करने के लिए Extremophilic सूक्ष्मजीवों के bioprospecting
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Gallo, G., Aulitto, M., Contursi,… More

Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).

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