Name: 허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성 계층화된 신경 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 성 계층화된 해마 신경 배양법으로 허혈성 세포 사멸 경로를 연구하는 방법입니다. 태아 18일째 성별 분리 후 신경 조직을 분리 배양하여 남녀 특이적 신호 전달 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

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Walter S. and Lucienne Driskill Foundation 및 NIH R01NS058792에서 부분적으로 지원하는 작업입니다.

이 프로토콜의 모든 절차는 동물의 윤리적 대우 및 관리에 대한 미국 국립보건원(National Institute of Health) 지침과 승인된 IACUC 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 조직 배양 접시, 배양 배지 및 해부 기구의 준비는 해부 최소 하루 전에 수행해야 합니다.
<ol>
	<li>1L 붕산염 완충액을 준비합니다: 이중 증류된 H2O에 3.1g/L 붕산 및 4.75g/L 붕사를 넣고 pH를 8.4로 조정합니다. 필터 멸균하고 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>폴리-D-라이신을 0.1mg/ml로 희석합니다.
	<ol>
		<li>층류 조직 배양 후드 아래에 다중 웰, 배양 처리, 멸균 조직 배양 플레이트의 각 웰 바닥을 넉넉하게 덮을 수 있도록 충분히 희석된 poly-D-lysine을 배치합니다. (원하는 경우 폴리-D-라이신을 추가하기 전에 사전 세척된 멸균 유리 덮개 슬립을 각 웰의 바닥에 추가할 수 있습니다. 커버 슬립은 poly-D-lysine을 첨가한 후 뜨를 수 있으므로 필요한 경우 멸균 집게로 아래로 눌러야 합니다.)</li>
		<li>37°C의 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ca, Mg, 피루브산 나트륨 또는 페놀 레드가 없는 1x Hanks Balanced Salt Solution에 350mg/L NaHCO3, 2.38g/L HEPES, 1.44g/L MgSO4 및 300mg/L BSA의 해부 완충액 1L를 준비합니다. pH를 7.3으로 조정합니다. 필터 멸균하고 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>500ml 도금 배지를 준비합니다: 10% 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신 각 100단위/ml, 페놀 레드가 없는 MEM의 2.5mM 글루타민. 필터 살균. 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오. 사용하지 않은 매체는 1개월 후에 폐기하십시오.</li>
	<li>500ml 공급 매체를 준비합니다 : 2 % B-27 보충제, 페니실린 및 스트렙토 마이신 각각 100 units / ml, 페놀 레드가없는 Neurobasal의 2.0mM GlutaMAX (글루타민 아님). 필터 살균. 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오. 1개월 후에 남아 있는 공급 매체를 버리십시오.</li>
	<li>표준 방법에 따라 필요에 따라 100mM CaCl2, 500mM EDTA 및 1M NaOH 10ml를 준비합니다.</li>
	<li>수술/절개 기구를 고압멸균하고 필요할 때까지 멸균 상태로 보관하십시오. 이 절차에는 두 개의 날카로운 매우 미세한 각도 집게, 끝이 가는 미세한 곡선 집게, 톱니 모양의 곡선 집게, 작은 쥐 이빨 집게, 한 쌍의 미세 수술 가위, 끝이 좁은 가위 한 쌍, 중간 끝 가위 한 쌍 및 뭉툭한 해부 프로브가 필요합니다. 개인 취향에 따라 멸균 기구를 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 해부 당일 수행할 조직 배양 접시, 배양 배지, 해부 기구 및 해부 영역의 준비
<ol>
	<li>poly-D-lysine 코팅된 조직 배양 플레이트를 세척합니다. 층류 생물 안전 캐비닛 아래에서 진공 라인 또는 피펫으로 poly-D-lysine을 흡인하고 각 웰에 물을 첨가한 다음 실온에서 ~5분 동안 배양합니다. 물을 흡입하고 깨끗하고 멸균된 물로 교체하십시오. 3회 반복합니다.
	<ol>
		<li>접시를 실온에서 완전히 건조시키십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>카운터와 해부 범위를 70% 에탄올로 닦아 해부 영역을 준비합니다.
	<ol>
		<li>큰 Kimwipe에 70% 에탄올을 적시고 오토클레이브 해부 도구를 배치합니다. 다른 Kimwipe로 덮으십시오.</li>
		<li>크고 평평한 접시에 얼음을 채웁니다. 라벨을 붙이고 적절한 수의 60mm 배양 접시에 냉간 해부 용액을 채웁니다. 남성과 여성의 머리, 뇌, 해마(해당되는 경우)를 분리할 수 있도록 충분한 요리를 준비합니다.</li>
		<li>두 개의 더 큰 100mm 배양 접시를 냉간 해부 버퍼로 채웁니다.</li>
		<li>버퍼가 없는 별도의 100mm 접시(건조)를 따로 보관하십시오.</li>
		<li>생물학적 위험 폐기물을 위한 구역과 동물 조직을 위한 구역을 설정합니다(해부 후 제도적 기준에 따라 적절하게 처리).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>37°C 수조에서 30ml 도금 매체를 데웁니다. 이 웜 용액은 프로토콜의 세포 분리 단계에서 사용됩니다.</li>
	<li>1ml의 도금 매체를 24웰, 폴리-D-라이신으로 코팅된 조직 배양 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 더 작은 플레이트를 사용하는 경우 적절한 더 작은 부피를 사용하십시오. 덮인 플레이트를 37% CO2의 5°C 인큐베이터에 넣어 해부하는 동안 CO2와 평형을 이루고 가열합니다.</li>
	<li>파파인 용액을 준비합니다.
	<ol>
		<li>두 개의 15ml 멸균 원뿔형 튜브에 하나는 "남성"으로, 다른 하나는 "여성"으로 표시합니다.</li>
		<li>각 튜브에 해부 완충액 10ml, 150μl 100mM CaCl2, 10μl 500mM EDTA, 10μl 1M NaOH 및 파파인 150U를 추가합니다.</li>
		<li>튜브를 세 번 뒤집어 부드럽게 섞은 다음 37°C의 수조에서 데웁니다. 참고: 파파인의 각 바이알은 파파인 mg당 다른 활성 단위를 가지므로 용액에 첨가되는 파파인의 양은 바이알마다 다릅니다. 파파인은 처음에는 뿌옇지만 파파인이 완전히 녹으면서 용액이 깨끗해집니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. E18 배아의 채취, 성교 및 해부
<ol>
	<li>임신한 암컷 쥐를 이소플루란 또는 기타 적절한 마취로 마취합니다. 깊은 마취 상태에서 쥐를 참수 또는 경추 탈구로 안락사시킵니다.</li>
	<li>빠르게 작업하여 70 % 에탄올로 여성의 복부를 청소하십시오. 원하는 경우 오염 위험을 줄이기 위해 에탄올을 분사하기 전에 복부를 면도할 수 있습니다. 쥐 이빨 집게로 복부 피부를 들어 올립니다. 끝이 중간 정도인 가위로 복부를 크게 절개하여 피부와 복부 근육을 잘라 내부 장기를 노출시킵니다.</li>
	<li>배아를 조심스럽게 제거하고, 복부에서 자궁 뿔 전체를 들어 올리고, 가능하면 외부 조직에 닿지 않도록 주의한다(오염을 피하기 위해). 배아가 들어 있는 자궁 뿔을 차가운 해부 식염수가 담긴 접시에 넣고 얼음으로 옮깁니다.</li>
	<li>자궁 뿔과 배아 주머니에서 각 새끼를 조심스럽게 제거합니다. 새끼는 연약하기 때문에 각 배아 사이의 자궁 조직을 잘라 배아 주머니를 드러낸 다음 작고 좁은 가위의 가장자리로 표면의 주머니를 조심스럽게 자르는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 배아액과 새끼는 배아에 손상을 주지 않고 구멍을 통해 부드럽게 밀어 넣을 수 있습니다.
	<ol>
		<li>배아 주머니의 절개 부위가 액체와 새끼가 쉽게 나올 만큼 크지 않은 경우 새끼가 최소한의 힘으로 미끄러져 나올 때까지 절개 부위를 조심스럽게 확대합니다.</li>
		<li>배아를 강제로 빼내기 위해 주머니를 너무 세게 쥐어짜지 마십시오. 이 역시 배아를 손상시킬 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단일 배아에서 머리를 제거합니다. 얼음 위에 해부 식염수 접시에 머리를 남겨 둡니다. 배아의 시체를 해부 내시경 아래의 마른 100mM 접시에 등을 대고 놓습니다. 한 손에는 구부러진 중간 끝의 집게를, 다른 손에는 톱니 모양의 구부러진 집게를 사용하여 강아지를 부드럽게 평평하게 펴고 뒷다리와 복부를 아래로 밀고 앞다리를 아래로 내리고 등쪽을 밀어 냅니다.</li>
	<li>필요하다면 가위로 꼬리를 제거한다. 꼬리는 복부 위로 말리는 경향이 있어 해부를 방해할 수 있다.</li>
	<li>뒷다리를 풀고 배꼽이라고 하는 탯줄 뿌리에서 복부를 꼬집습니다. 부드럽게 들어 올립니다. 앞다리를 풀고 다른 손과 마이크로 가위로 배꼽 바로 위의 복부에 "v"가 두개골을 가리키도록 작은 거꾸로 "v"자를 만듭니다.</li>
	<li>가위를 구부러진 집게로 다시 교체하십시오. 집게를 뒤집어 점이 동물로부터 위로 향하고 멀어지도록 합니다. 부드러운 힘으로 구부러진 집게의 닫힌 둥근 가장자리로 흉곽을 아래로 누르고 등쪽을 누르면서 다른 집게로 당기고 배쪽을 당겨 강아지를 배쪽에서 등쪽으로 벌립니다. 이 퍼지는 움직임은 복강을 열어 장, 간 및 기타 내부 장기를 노출시킵니다.</li>
	<li>구부러진 집게를 사용하여 반복적인 쓸기 동작을 사용하여 장과 간을 두개골로 매우 부드럽게 밀어 넣습니다. 이것은 점차적으로 신장, 방광, 그리고 가장 중요하게는 내부 성기를 노출시킬 것입니다.
	<ol>
		<li>수컷 새끼는 양쪽의 신장 바로 아래에 있는 줄무늬 고환의 존재로 식별됩니다. 고환은 신장 크기의 약 1/3-1/2 크기이며 때때로 방광 바로 위에 위치합니다.</li>
		<li>암컷은 고환이 없는 것으로 가장 쉽게 식별할 수 있지만, 방광 위에 있는 작은 자궁과 신장 쪽으로 뻗어 있는 나팔관으로도 식별할 수 있습니다. 박리 범위의 높은 강도 하에서, 난소는 또한 바로 아래 나팔관 끝에 있는 작고 어두운 기관으로 식별될 수 있으며, 때로는 양측으로 신장 아래에 있는 기관으로 식별될 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>성별이 결정되면 시체를 버리고 머리를 적절하게 표시된 접시(남성 또는 여성)에 넣습니다. 머리를 해부 용액에 얼음 위에 두십시오.</li>
	<li>각 강아지가 성별을 지정할 때까지 3.5-3.10단계를 반복합니다. 최상의 결과를 얻으려면 각 해부 사이에 Kimwipe로 접시를 깨끗이 닦으십시오. 액체는 새끼를 미끄럽고 해부를 위해 잡기 어렵게 만듭니다.</li>
	<li>모든 배아를 성교시키고 수컷과 암컷의 머리를 분리한 후에는 모든 남성과 암컷 유래 조직을 분리하기 위해 각별한 주의를 기울여 나머지 해부를 진행한다.</li>
	<li>한 번에 하나의 뇌를 저온 해부 완충액으로 채워진 100mM 접시에 옮깁니다. 해부 범위 아래에서 구부러진 집게를 사용하여 배아의 눈을 뚫어 해부를 위해 배아를 고정합니다. 미세수술용 가위를 사용하여 얕은 정중선 절개를 만들어 두개골 기저부에서 비강 바로 위의 머리 꼭대기까지 피부와 두개골을 정중선 아래로 분할합니다.</li>
	<li>피부와 두개골을 양측으로 부드럽게 밀어내고 마이크로 수술용 가위의 바닥이나 닫힌 각도의 집게로 전뇌에서 뇌간 쪽으로 조심스럽게 퍼올려 뇌를 아주 부드럽게 추출합니다.
	<ol>
		<li>추출된 뇌를 조심스럽게 사용하여 차가운 해부 완충액으로 채워진 깨끗하고 라벨이 붙은 접시에 옮깁니다. 접시를 얼음에 보관하십시오.</li>
		<li>모든 뇌가 적출될 때까지 이 과정을 반복합니다.</li>
		<li>이 단계에서는 해부 완충액에 전체 뇌 두 개의 플레이트, 즉 남성 조직과 여성 조직을 위한 두 개의 플레이트가 생성되어야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해부 범위 아래에 깨끗한 접시를 놓고 해부 버퍼를 채웁니다. 해마를 해부하는 동안 뇌가 촉촉하게 유지될 수 있을 만큼만 용액을 붓습니다. 너무 많으면 뇌가 떠다니고 다루기가 어려워집니다. 원하는 경우 멸균 왁스로 해부 접시를 사전 코팅합니다. 왁스는 작업할 수 있는 미끄럼 방지 표면을 제공하고 섬세한 해부 기구의 끝을 보호합니다. 코팅되지 않은 접시의 바닥을 긁으면 도구의 날카로운 모서리가 구부러지거나 무뎌질 수 있습니다.</li>
	<li>해부 범위를 고출력 설정으로 변경하고 그에 따라 초점을 조정합니다. 한 번에 하나의 뇌를 조심스럽게 옮겨 접시를 해부합니다. 끝이 매우 미세한 집게를 사용하여 각 뇌 반구를 분리하고 뇌간에서 집어냅니다.</li>
	<li>매우 조심스럽게 각 반구에서 수막을 제거하십시오. (수막은 혈관이 풍부한 분홍빛이 도는 막이며, 뉴런 배양에서 신경교세포 오염의 흔한 원인입니다.)
	<ol>
		<li>수막을 제거하려면 막을 섬세하게 꼬집고, 들어 올리고, 당기면서 아래에 있는 뇌 조직을 뚫지 않도록 주의합니다.</li>
		<li>뇌막을 뇌에서 떼어내면 뇌가 겸자 아래로 약간 굴러갈 수 있지만 막을 떼어낼 수 있도록 제자리에 유지합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이 시점에서 선택한 조직을 사용하기 위해 뇌를 추가로 해부할 수 있습니다.예를 들어, 각 반구에서 해마를 해부합니다. 한쪽 반구를 측면이 아래로 향하게 하여 배치합니다. 해마를 덮고 있는 플랩을 만드는 큰 심실강을 관찰하십시오. 초승달 모양의 해마가 관찰될 때까지 이 플랩을 부드럽게 뒤로 놀립니다. 해마는 약간 융기되어 있으며 중뇌와 피질 사이에 있습니다.</li>
	<li>두 쌍의 날카롭고 매우 미세한 집게를 사용하여 한 손으로는 뇌 반구를 열고 다른 손으로는 해마를 피질과 중뇌에서 잘라냅니다.
	<ol>
		<li>해마를 올바르게 표시된 접시(남성 또는 여성)에 넣고 해부 완충액으로 채우고 얼음 위에 보관합니다.</li>
		<li>나머지 반구에서 해마를 해부하고 각 뇌에 이 과정을 반복합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해마를 적절하게 라벨링된 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
	<ol>
		<li>차가운 해부 버퍼로 부드럽게 두 번 씻으십시오. 이 단계에서 진공 흡입을 매우 조심스럽게 사용하십시오. 해마는 작아서 진공 속으로 돌이킬 수 없게 사라질 수 있습니다. 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고, 피펫으로 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거하고, 용액을 버리고, 새롭고 깨끗한 해부 버퍼로 교체하여 이를 방지합니다.</li>
		<li>3.20.1단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 신경 세포 해리
<ol>
	<li>해마를 적절하게 라벨링되고 예열된 파파인 용액으로 옮깁니다. 37 °C의 수조에 넣고 8-10분 동안 배양하고 2-3분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다.</li>
	<li>수조에서 파파인 믹스와 조직을 제거합니다. 조직이 가라앉을 때까지 기다린 다음 피펫으로 파파인 용액을 최대한 조심스럽게 제거하고 조직은 튜브 바닥에 남겨둡니다. 도금 매체로 조직을 3x 씻습니다. 도금 매체의 세럼은 파파인 효소 소화를 억제합니다. 트립신 억제제는 도금 매체에 혈청이 사용되지 않는 경우 필요합니다.</li>
	<li>도금 매체를 제거합니다.
	<ol>
		<li>2 ml의 신선한 neurobasal 배지를 추가하고 가장 느린 속도로 설정된 5 ml 혈청학 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 해리합니다.</li>
		<li>해리는 부드럽게 위아래로 8회 피펫팅하여 수행됩니다. 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 피펫에서 용액과 조직을 집은 다음 용액을 원뿔형 튜브의 측면으로 풀어 조직이 측면에서 아래로 미끄러져 튜브 바닥으로 다시 돌아갈 수 있도록 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8번째 트리투레이션 후 조직이 가라앉고 위에 흐린 매체를 모으도록 합니다. 이 배지에는 분리된 세포가 포함되어 있습니다.
	<ol>
		<li>라벨이 붙은 새 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>분리되지 않은 조직에 2ml를 더 추가합니다.</li>
		<li>다시 8번 더 트리추레이션합니다.</li>
		<li>흐린 매체를 수확합니다.</li>
		<li>이 과정을 3-5회 반복합니다. 일부 해리되지 않은 조직이 남아 있습니다. 모든 조직이 해리될 때까지 triturate를 할 수 있지만, 과도한 trituation은 신경 세포의 건강을 악화시키므로 권장되지 않습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>남성과 여성 조직 사이의 부피와 무게를 균등화하기 위해 필요에 따라 원뿔형 튜브에 추가 매체를 추가합니다. 회전하는 양동이 원심분리기에서 228 x g으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>2ml의 새로운 도금 매체에 세포를 부드럽게 재현탁시키고 메쉬 세포 스트레이너를 통해 용액을 여과하여 레이블이 지정된 깨끗한 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>450μl의 0.4% Trypan Blue에 50μl 세포 현탁액을 추가합니다. Trypan Blue에서 세포를 2분 동안 배양하고 부드럽게 섞은 다음 혈구계에 10μl를 로드합니다. Trypan Blue 염료를 채택한 세포를 제외한 세포를 세십시오. 짙은 파란색 세포는 죽었거나 죽어가고 있습니다.</li>
</ol>
5. 도금 및 배양 유지
<ol>
	<li>조직 배양 플레이트의 각 웰에 추가할 세포 현탁액의 정확한 부피를 계산하여 원하는 세포 밀도를 산출합니다. 뉴런 배양은 세포 밀도에 매우 민감하며, 신경교세포(glia)와 공동 배양하거나 신경교세포(glial conditioning) 배지를 공급하지 않는 한 중간에서 높은 밀도에서 가장 잘 작동합니다. 이 프로토콜에서 세포는 150,000-200,000 cells/cm 2로 도금됩니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 도금 매체가 미리 채워진 조직 배양 플레이트를 제거합니다(위의 2단계에서 준비).
	<ol>
		<li>50ml 원뿔형 튜브에서 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이친 다음 원하는 부피의 세포 현탁액(위의 5.1단계에서 계산)을 각 웰의 중앙에 피펫팅합니다.</li>
		<li>피펫팅하기 전에 매번 세포 현탁액을 소용돌이치며 반복하여 각 웰에서 동일한 세포 밀도를 보장합니다. 세포는 빠르게 정착하고 소용돌이 단계를 건너뛸 경우 세포 밀도가 웰에서 웰로 바뀔 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>각 웰에 세포가 추가되면 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포를 분산시킨 다음 즉시 인큐베이터에서 접시를 교체합니다. 적어도 24시간 동안 세포를 방해받지 않고 그대로 두십시오.</li>
	<li>세포를 도금한 후 최소 24시간이 지나면 완전한 신경기저 공급 매체를 37°C로 가열합니다. 각 웰에서 도금 매체를 흡입하고 공급 매체로 교체합니다. 한 번에 하나의 웰에서 흡인 및 교체하여 신경 스트레스를 최소화하고 세포 생존을 개선합니다.</li>
	<li>뉴런 배양물은 4-7일마다 배지의 절반을 조심스럽게 제거하고 동일한 부피의 신선한 배지를 다시 추가하여 공급해야 합니다. 이러한 조건에서 배양은 2주 동안 유지될 수 있습니다. 1차 신경 세포 배양에서는 일부 세포 사멸이 예상됩니다. 따라서 배양이 성숙해짐에 따라 밀도가 감소합니다. 이 프로토콜에서 세포 밀도는 in vitro 10일까지 약 30% 감소합니다.</li>
</ol>

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남성과 여성의 해마를 별도로 해부, 분리 및 배양하는 성별 계층화된 1차 분리된 해마 신경 배양은 뉴런 세포 사멸에서 성별 특이적 세포 신호 전달을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 신경과학자들은 일반적으로 일차 신경 배양을 사용하지만 프로토콜은 특정 실험 목표와 관심 사항에 따라 실험실마다 다릅니다. 많은 연구자들은 혼합 배양에서 또는 미리 확립된 성상세포 층에 매달린 유리 커버 슬립에 뉴런을 도금하여 뉴런을 아교세포와 공동 배양하기로 선택합니다. 성상세포는 배양에서 뉴런 생존에 유익한 성장 호르몬을 분비하는 것으로 생각됩니다. 그러나 실험 시스템을 단순화하기 위해 이 연구에서 설명한 프로토콜은 실질적인 신경교 영향(10% 미만의 신경교 오염)이 없는 신경 세포 배양을 초래합니다.
프로토콜은 또한 해마를 채취하는 배아의 나이와 관련하여 실험실마다 다르며, 그 문제에 대해 프로토콜은 뇌의 어느 영역을 채취하는지에 따라 다릅니다. 이 프로토콜은 해부를 위해 E18 배아를 사용...

포유류는 수컷과 암컷이 서로 다른 특성과 특성을 나타내며 성적으로 이형성입니다. 성별의 차이는 뇌에까지 미치며, 부상과 질병에 대한 뉴런의 민감성에서 명백하게 드러난다(1-5에서 검토). 예를 들어, 남성의 뇌는 뇌졸중이나 심정지로 인한 허혈성 뉴런 손상에 더 취약한 후 소생술을 받는다(6에서 검토). 파킨슨병(7번 리뷰)과 정신분열증(8번 리뷰)은 여성보다 남성에서 더 흔한 반면, 여성의 뇌는 알츠하이머병(9번 리뷰)과 우울증(10번 리뷰)과 같은 기분 장애에 더 취약한 것으로 보인다. 신경 손상과 질병에 대한 감수성에서 성별 간의 관찰 가능한 차이에도 불구하고, 대부분의 치료 패러다임은 성별을 고려하지 않으며 남성과 여성 모두에서 유사합니다. 성차가 고려되고 이해된다면 더 큰 성공을 거둘 수 있을 것이다.
신경 손상 및 질병에 대한 생체 내 동물 모델은 인간과 유사한 성적 이형성을 보여주며 성 차이에 대한 이해를 높이고 이러한 차이가 신경 세포의 생존 및 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 예를 들어, 증거는 수컷 설치류가 암컷보다 허혈성 신경 손상에 더 취약하다는 것을 입증했습니다11-15. 이 차이는 테스토스테론, 1 차적인 남성 성 스테로이드 호르몬 및 에스트로겐, 1 차적인 여성 성 스테로이드 호르몬의 분자 신호에 적어도 부분적으로 의존하는 것을 생각된다. gonectomized 수컷과 암컷 설치류를 사용한 연구는 테스토스테론과 테스토스테론 대사 산물, 디 하이드로 테스토스테론 (DHT)이 뇌허혈 후 신경 세포 손상을 악화시키고 에스트로겐이 감소한다는 것을 보여줍니다12-14,16-18. 그러나 뇌허혈의 성별 차이는 신생아와 성체 동물 모두에서 나타난다19,20. 신생아는 발달 과정에서 자궁에서 에스트로겐이나 테스토스테론이 급증하지만, 출생 후 사춘기까지 호르몬 수치가 상대적으로 낮다(21에서 검토). 그러므로, 일차 성 호르몬의 유무가 성에 영향을 받는 뉴런의 손상에 대한 감수성의 유일한 결정 요인은 아니다. 실제로, 발달 과정에서 성적 이형성이 형성되어 호르몬 수치가 낮을 때에도 세포 신호와 허혈에 대한 반응의 차이를 초래할 가능성이 있습니다.
성 차이가 성 스테로이드 호르몬의 존재에 의존하는지 아니면 발달 과정에서 확립된 이형성에 기인하는지 여부에 관계없이 추가 연구를 통해 뇌에서 남성과 여성 간의 세포 신호에 차이가 있다는 것이 분명해지고 있습니다. 콜로라도 대학교 의과대학의 Herson Lab에서 우리는 그러한 차이점 중 하나를 확인했습니다. 우리는 칼슘, 나트륨 및 칼륨 투과성 이온 채널인 TRPM2(22,23에서 검토)가 암컷 마우스가 아닌 수컷에서 생체 내 허혈성 모욕 후 신경 세포 사멸을 유도한다는 것을 발견했습니다24. 우리는 TRPM2의 약리학적 억제 또는 유전적 녹다운이 뇌졸중24의 생체 내 중간 경동맥 폐색(MCAO) 모델에서 수컷 마우스에서는 보호하지만 암컷 마우스에서는 보호하지 않는다는 것을 입증했습니다.
유용성에도 불구하고, 허혈성 뉴런 손상의 생체 내 동물 모델은 연구를 위해 뉴런을 구체적으로 표적으로 삼는 것이 어렵거나 불가능하기 때문에 뉴런 사멸에 대한 분자 연구에 제한될 수 있습니다. 이러한 이유로 우리 실험실은 in vivo 작업을 보완하기 위해 1차 분리된 피질 또는 해마 뉴런을 in vitro에서 사용합니다. 1차 분리된 뉴런 배양은 뉴런 손상 및 질병과 관련된 세포 신호 경로를 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 배양의 뉴런은 신경교세포의 입력이 있든 없든 엄격하게 통제된 환경에서 유지될 수 있습니다. 신경교세포(glia)가 없는 경우, 배양에서 관찰되는 모든 반응은 뉴런(neuronal)입니다. 약리학적 제제는 혈액 뇌 장벽을 통한 흡수에 대한 걱정 없이 배양에 투여될 수 있으며, 주어진 신호 전달 경로의 특정 구성 요소를 억제하거나 활성화할 수 있습니다. 분자 생물학은 관심 있는 다양한 단백질을 과발현하거나 녹다운하는 데 사용할 수 있으며, 생체 내 모델 시스템에서는 불가능한 개별 세포에 대해 전기생리학적 측정을 수행할 수 있습니다.
Herson Lab은 배양을 준비하는 데 사용되는 배아를 먼저 성별화하여 1차 분리된 신경 세포 배양의 유용성을 확장합니다. 남성과 여성의 성층화된 뉴런 배양은 남성 뉴런이 여성 뉴런보다 산소와 포도당 결핍 후 뉴런 세포 사멸에 더 취약하다는 것을 명확하게 보여줍니다25. 산소 및 포도당 결핍은 허혈이 뇌의 산소 및 포도당 가용성을 감소시키기 때문에 신경 허혈의 체외 모델로 허용됩니다. 또한, 우리는 분리된 성 계층화 뉴런에 대한 전기생리학적 실험을 통해 TRPM2가 남성 뉴런에서 활성화되지만 여성 뉴런에서는 활성화되지 않는다는 것을 입증했습니다24,26. 우리는 현재 TRPM2 활성24,26의 분자 성 특이적 조절자를 조사하고 있습니다. 여기에서는 성 계층화된 1차 배아 분리된 해마 뉴런 배양을 확립하기 위한 프로토콜을 공유하고 논의하며, DNA 복구 효소인 PARP-1이 TRPM2와 유사한 성별 특이적 방식으로 허혈성 세포 사멸에 기여한다는 것을 시사하는 이 방법을 사용하여 대표적인 데이터를 제시합니다. PARP-1은 산화 스트레스로 인한 DNA 파괴에 의해 활성화됩니다(27,28에서 검토). DNA 손상이 최소화되면 PARP-1 활성이 세포 생존을 향상시키지만, 손상이 과도할 경우 PARP-1 활성이 증가하면 세포 사멸이 악화됩니다. PARP-1은 TRPM2 채널28-31의 알려진 활성제인 폴리(ADP)리보오스를 생성하며, 일부 증거에 따르면 PARP-1은 산화 스트레스에 대한 반응으로 남성의 뇌에서 우선적으로 활성화되지만 여성의 뇌에서는 활성화되지 않는 것으로 나타났습니다32,33. 따라서, PARP-1이 여성이 아닌 남성에서 TRPM2를 활성화하여 산소와 포도당 결핍에 대한 반응으로 신경 세포 사멸을 유도한다는 가설을 세웠습니다.

<table><tbody><tr><td>B27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>인비트로젠</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td><td>없음 Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal, 글루타민 없음, 페놀 레드</td><td>없음 Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine, MW 70,000-150,000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 각진 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 &ndash; 세밀한 곡선 포</td>셉스 <td>파인 사이언스 도구</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>톱니 (런던) 포셉스</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>엑스트라 파인 그레이프 펜치 1 x 2 이빨</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>중간 작동 가위</td><td>Roboz 수술</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>초미세 미세 해부 가위</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 &마이크로; M 나일론 메쉬</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성 계층화된 신경 배양

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

허혈성 손상 및 신경퇴행성 질환에 대한 신경 감수성의 성별 차이는 오랫동안 관찰되어 왔지만 이러한 차이를 유발하는 신호 전달 메커니즘은 불분명합니다. 1차 분리된 배아 신경 세포 배양은 허혈 또는 질병의 결과로 세포 사멸과 관련된 신경 세포 신호 전달을 조사하기 위한 단순화된 실험 모델을 제공합니다. 그러나 오늘날 연구에 사용되는 대부분의 신경 배양은 혼합 성별입니다. 연구자들은 뉴런 손상 및 질병 모델에서 혼합 성 뉴런 배양에서 섹스 스테로이드 치료의 효과를 테스트할 수 있고 실제로 테스트하고 있지만, 축적된 증거는 여성의 뇌가 남성의 뇌와 다르게 안드로겐, 에스트로겐 및 프로게스테론에 반응한다는 것을 시사합니다. 또한, 신생아 수컷과 암컷 설치류는 허혈성 손상에 다르게 반응하며, 수컷은 암컷보다 뇌허혈 후 더 큰 부상을 경험합니다. 따라서 혼합 성 뉴런 배양은 실험 결과를 모호하게 하고 혼란스럽게 할 수 있습니다. 중요한 정보가 누락될 수 있습니다. 이러한 이유로 콜로라도 대학교 의과대학의 Herson Lab은 해마와 피질 모두에서 성 계층화된 1차 분리된 배아 신경 배양을 일상적으로 준비합니다. 배아는 뇌 조직을 채취하기 전에 성별을 정하고 남성과 여성 조직은 별도로 분리되고 별도로 도금되고 별도로 유지됩니다. 이 방법을 사용하여 Herson Lab은 허혈성 세포 사멸에서 이온 채널 TRPM2에 대한 남성 특이적 역할을 입증했습니다. 이 원고에서는 배아 쥐의 성별을 지정하고 성 계층화된 해마 1차 분리된 뉴런 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 공유하고 논의합니다. 이 방법은 성 계층화된 피질 배양을 준비하는 데 적용할 수 있으며, 배아 성교 방법은 성이 결과의 중요한 결정 요인으로 생각되는 모든 연구를 위해 다른 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다.

배아 생쥐의 정확한 성별 판별은 성별로 구분된 일차 뉴런 배양을 준비하는 데 있어 매우 중요한 단계입니다. 정확하게 성별이 판별된 새끼로부터 암수 해마를 분리하여 배양하기 위해, 배아를 성별로 구분하고 피질과 해마를 채취하였습니다. 성별이 섞이지 않도록 주의하며 표준 절차에 따라 각 배아의 채취된 조직에서 게놈 DNA를 분리하였습니다. 수컷 특이적 유전자인 SRY와 공통 마커인 myogenin (Myog) 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하였습니다 (그림 1). Y 염색체 상의 성 결정 부위인 SRY는 고환 형성을 담당하며 일반적으로 성별 마커로 사용됩니다. 분석 결과, 테스트한 모든 암수 뇌 조직에서 Myog가 검출되었으며, SRY 유전자는 성별 판별을 통해 "수컷"으로 확인된 배아 조직에서만 나타났고 "암컷"으로 확인된 조직에서는 나타나지 않았음을 확인하였습니다.
PJ34를 이용한 PARP1의 약리학적 억제는 수컷 배아 유...

일차 분리된 배아 해마 신경 세포 배양은 뉴런 사멸과 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다. 해마의 분리 및 해리 전에 배아를 성별화하면 남성과 여성을 분리하여 배양을 준비할 수 있으며, 이를 통해 연구자는 성별에 따른 세포 신호를 식별하고 조사할 수 있습니다.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

이 절차의 전반적인 목표는 성별로 구분된 해마 일차 분리 뉴런 배양물을 준비하는 것입니다. 첫 번째 단계는 성별 구분된 일차 뉴런 배양물을 얻기 위해 배아 18일차에 배아의 성별을 판별하고 해부하는 것입니다. 다음 단계는 뉴런 조직으로부터 분리 뉴런을 준비하는 것입니다.마지막 단계는 뉴런을 적절한 밀도로 플레이팅하고 실험을 위해 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 이 방법은 다른 프로토콜과 결합하여 성별이 결과의 중요한 결정 요인이라고 생각되는 모든 연구에 활용될 수 있습니다. 본 방법은 수컷과 암컷 설치류가 뉴런 허혈에 서로 다르게 반응하는지 등 젠더 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요한 여러 준비 과정 중 조직 배양 플레이트와 같이 다시 살펴볼 가치가 있는 몇 가지 항목이 있었습니다.준비 단계로 poly-D-lysine을 0.1 mg/mL 농도로 희석합니다. 그 다음, 층류 조직 배양 후드 내에서 멸균 처리된 multi-well 조직 배양 플레이트의 각 웰 바닥을 희석된 poly-D-lysine으로 충분히 코팅합니다. 이 플레이트들을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 두 번째로, 해부 영역, 작업대 및 현미경을 70% ethanol로 닦아내십시오.셋째, 크고 평평한 접시에 얼음을 채우고 라벨을 붙인 뒤, 수컷과 암컷의 머리, 뇌 및 해마를 분리하여 보관할 수 있도록 60 millimeter 접시 여러 개에 차가운 해부 용액을 충분히 채웁니다. 또한, 더 큰 100 millimeter 배양 접시 두 개에 차가운 해부 버퍼를 채웁니다. 넷째, 15 milliliter 멸균 튜브 두 개를 준비합니다.각 튜브에 수컷과 암컷으로 라벨을 부착하고, 각각 적절한 부피의 해부 완충액을 첨가합니다. E 18 배아를 수확할 때는 자궁각과 배아낭에서 각 태아를 조심스럽게 분리하는 것이 중요합니다. 태아가 취약하므로, 배아낭을 노출시키기 위해 각 배아 사이의 자궁 조직을 조심스럽게 절개하십시오.그 후 작고 좁은 가위의 날을 이용하여 표면의 낭을 매우 조심스럽게 절개합니다. 그러면 배아를 손상시키지 않고 개구부를 통해 배아액과 배아를 부드럽게 밀어낼 수 있습니다. 새끼 쥐를 해부할 때는 곡선 핀셋을 사용하여 반복적으로 쓸어내는 동작으로 장과 간을 매우 부드럽게 두측 방향으로 밀어냅니다.이렇게 하면 신장 방광과 무엇보다 중요한 내부 성기관이 점차 노출됩니다. 태아의 성별을 판별할 때, 매우 취약한 내

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허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성별에 따른 뉴런 배양

이 비디오는 rhinal cortex-hippocampus organotypic slices에서 신경 세포 사멸을 평가하는 기술을 보여줍니다. 신경 세포 사멸은 생체 내 간질과 유사한 진화하는 간질 발작을 통해 발생하며, 프로피듐 요오드화물과 면역 형광을 사용하여 죽은 세포의 이중 염색을 통해 감지됩니다.

생체 외 간질 모델에서 세포 사멸을 평가하기 위한 신경 세포 사멸 분석

이 비디오는 세포독성 CD8+ T 세포를 통해 매개되는 뇌세포 사멸을 유도하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 뇌 절편을 얻으면 활성화된 희소돌기아교세포 지향 CD8+ T 세포가 절편으로 전달되어 미엘린 수초와 희소돌기아교세포를 표적으로 합니다. 배양 후, 미엘린과 신경 세포 사멸에 대한 손상은 관심 영역에서 조직학적으로 평가할 수 있습니다.

희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 통해 신경 세포 사멸을 유도하는 생체 외 기술

전신 저혈압과 함께 양측 경동맥 폐색 재현 심각도 해마에 손​​상 쥐 세계적인 뇌 허혈을 생산하고 있습니다. 동물의 주제는 뇌 손상의 예측 패턴 장애인, 그들은 적당하게 복구하고, 사망률은 상대적으로 낮다.

2 혈관 폐색 / 저혈압 : 세계적인 두뇌 국소 빈혈의 쥐 모델

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.

오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

대뇌 피질의 임계 상태 역학 지표의 연결 눈사태, 즉 스케일 - 불변량 spatio - 관자놀이 활동 파열을 연구하는 강력한 방법입니다. 눈사태 정확하게 제어 조건 하에서 평면 통합 다중 전극 어레이 (MEA)와 활동의 장기 측정을 허용 교양 피질의 표면 레이어를 개발에 자발적으로 등장.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

배우세요 성 계층화된 해마 신경 배양법으로 허혈성 세포 사멸 경로를 연구하는 방법입니다. 태아 18일째 성별 분리 후 신경 조직을 분리 배양하여 남녀 특이적 신호 전달 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성 계층화된 신경 배양

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