허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성 계층화된 신경 배양

이 절차의 전반적인 목표는 성층화된 해마, 1차 해리된 뉴런 배양을 준비하는 것입니다. 절차의 첫 번째 단계는 배아 18일째에 배아를 성교하고 해부하여 성층화된 1차 신경 세포 배양을 얻는 것입니다. 다음 단계는 신경 조직에서 관련 뉴런을 준비하는 것입니다.

마지막 단계는 뉴런을 적절한 밀도로 플레이트화하고 실험을 위해 성장시키는 것입니다. 궁극적으로, 이 방법은 다른 프로토콜과 함께 성별이 결과의 중요한 결정 요인으로 생각되는 모든 연구에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 수컷과 암컷 설치류가 신경 허혈에 다르게 반응하는지 여부와 같은 성별 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요한 몇 가지 준비 중 조직 배양 플레이트와 같이 검토할 가치가 있는 몇 가지 준비가 있었습니다.

준비: 폴리 드 리신을 밀리리터당 0.1밀리그램으로 희석합니다. 그런 다음 층류 조직 배양 후드 아래에서 다중 웰 배양 처리된 멸균 조직 배양 플레이트의 각 웰 바닥을 섭씨 37도에서 밤새 배양하는 것으로 보이는 희석된 폴리 D 라이신으로 넉넉하게 덮습니다. 둘째, 해부 부위, 카운터 및 스코프를 70% 에탄올로 닦아내십시오.

셋째, 크고 평평한 접시에 얼음 라벨을 채우고 60mm 접시에 냉 해부 용액을 충분히 채워 수컷과 암컷의 머리, 뇌와 하마 캄피를 분리합니다. 또한 더 큰 100mm 배양 접시 2개를 저온 해부 완충액으로 채웁니다. 넷째, 15ml 멸균 튜브 2개를 준비합니다.

이 튜브 각각에 한 명의 수컷과 다른 암컷을 표시하고 적절한 양의 해부 완충액을 추가합니다. E 18 배아를 채취할 때는 자궁 뿔과 배아 자루에서 새끼를 조심스럽게 제거하는 것이 중요합니다. 새끼는 연약하기 때문에 각 배아 사이의 자궁 조직을 조심스럽게 잘라 배아 자루를 노출시킵니다.

그런 다음 작고 좁은 가위의 가장자리로 표면의 자루를 매우 조심스럽게 자릅니다. 그런 다음 배아액과 배아를 배아를 손상시키지 않고 구멍을 통해 부드럽게 밀어 넣을 수 있습니다. 새끼를 해부할 때는 구부러진 집게를 사용하여 반복적으로 쓸어넘기는 동작을 하여 창자와 간을 매우 부드럽게 밀어 넣습니다.

이것은 점차적으로 신장의 방광, 그리고 가장 중요하게는 내부 성기를 노출시킵니다. 태아의 성별을 결정할 때 매우 연약한 내부 성기를 방해하지 않도록 부드럽게 해부하는 것이 매우 중요합니다. 수컷 새끼는 신장 바로 아래에 있는 줄무늬 고환의 존재로 식별됩니다.

고환은 신장 크기의 약 1/3에서 1/2 크기이며 때때로 방광 바로 위에 위치합니다. 암컷은 고환이 부족하여 가장 쉽게 식별됩니다. 또한 방광 위에 있는 작은 자궁과 신장 쪽으로 뻗어 있는 나팔관으로 식별할 수 있습니다.

더 높은 배율에서는 난소를 바로 아래의 나팔관 끝에 있는 작고 어두운 기관으로 식별할 수 있으며 때로는 신장 아래에서 뇌를 적출하기 위해 식별할 수 있습니다. 두개골을 쪼갠 후 피부와 두개골을 옆으로 부드럽게 밀어냅니다. 그런 다음 미세수술 가위의 바닥이나 닫힌 각도의 집게로 전뇌에서 뇌간 쪽으로 조심스럽게 뇌를 퍼서 아주 부드럽게 추출합니다.

집게를 조심스럽게 사용하여 추출된 뇌를 냉간 해부로 채워진 깨끗한 라벨이 붙은 접시에 옮깁니다. 완충기. 접시를 얼음에 보관하십시오. 모든 뇌가 적출될 때까지 이 과정을 반복합니다.

이 단계에서는 해부 완충액에 전체 뇌 두 개의 플레이트, 즉 남성 조직과 여성 조직을 위한 두 개의 플레이트가 생성되어야 합니다. 해마를 해부하기 전에 각 반구에서 수막을 매우 조심스럽게 제거하십시오. 혈관이 풍부한 분홍빛이 도는 막입니다.

섬세하게 꼬집고, 들어 올리고, 당깁니다. 멤브레인은 아래의 뇌 조직을 뚫지 않도록 주의합니다. 그런 다음 뇌막을 뇌에서 빼냅니다.

뇌는 겸자 아래로 약간 굴러갈 수 있지만 제자리에 있어야 합니다. 그런 다음 뇌의 어느 영역이 배양되고 연구되고 있는지에 따라 마우스의 뇌를 해부할 수 있습니다. 해부된 뇌 조각을 해부, 완충액으로 채워진 올바르게 표시된 접시에 넣고 얼음 위에 보관했습니다.

마지막 뇌를 해부한 후 적절하게 표시된 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 티슈를 부드럽게 씻으십시오. 냉박리 버퍼를 사용하면 조직이 진공 상태로 손실될 수 있으므로 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거합니다.

피펫을 사용하여 제거한 용액을 깨끗하고 깨끗한 해부 버퍼로 교체합니다. 그런 다음 하마 캄피를 파파로 처리하고 신경 기저 배지로 변경한 후 세척 단계를 반복하고 가장 느린 속도로 설정된 5ml 혈청학적 피펫을 사용하여 부드러운 양질로 조직을 부드럽게 해리합니다. 항상 튜브 측면으로 배출하여 거품이 생기지 않도록 하십시오.

여덟 번째 트라이 후에는 조직이 가라앉도록 합니다. 그런 다음 2ml의 신경 기저 배지를 연관되지 않은 조직에 추가하고 tri process를 반복합니다. 이 과정을 최대 10밀리리터까지 반복합니다.

일부 연관되지 않은 조직이 남아 있지만 더 이상의 결합은 신경 건강이 좋지 않은 결과를 초래합니다. 세포 밀도를 결정하고 준비된 플레이트에 플레이트합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이치고 부유 세포의 원하는 부피를 피펫팅합니다.

이 예에서는 평방 센티미터당 150-200, 000개의 셀이 도금됩니다. 각 플레이트를 로드하기 전에 항상 세포 현탁액을 소용돌이치십시오. 플레이트가 채워지면 부드럽게 휘젓아 세포를 분산시킨 다음 즉시 인큐베이터로 옮깁니다.

최소 24시간 동안 세포를 방해받지 않고 그대로 두십시오. 다음 날, 섭씨 37도까지 따뜻하고 완전한 신경 기초 공급 매체. 24시간 성장 후 각 웰의 도금 매체를 한 번에 하나씩 흡입하고 공급 매체로 교체합니다.

그런 다음 4-7일마다 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 배지의 절반을 새로운 공급 배지로 조심스럽게 교체하면 세포 배양액은 점차적으로 밀도를 잃으면서 2주 동안 생존할 수 있습니다. DNA는 각 배아의 수확된 조직으로부터 분리하였다.

Sex PCR은 남성 특이적 유전자, SRY 및 범용 마커에 대한 프라이머를 사용하여 수행되었습니다. 묘 게닌. 그 결과, 수컷의 1차 해마 뉴런 배양에서 두 조직 풀의 성 특이성을 확인했으며, PJ 34를 가진 PARP의 약리학적 억제는 산소와 포도당 결핍에 대한 신경 보호 효과가 있는 것으로 밝혀졌지만, 여성 배아에서는 나타나지 않았다.

PARP one 녹아웃 마우스에서 제조된 수컷 뉴런 배양물은 TPM 2채널 억제제로 야생형 남성 뉴런의 산소 및 포도당 결핍 또는 OGD 유도 세포 사멸 치료로부터 보호되었습니다. 2. PJ 34 외에 PB는 OGD 2에 대해 더 이상의 신경 보호 효과가 없었다. PB 단독으로 야생형 수컷의 OGD에 신경 보호가 되지만 두 가지가 있습니다.

PB는 수컷 또는 암컷 PARP one 녹아웃 마우스에서 보호하지 않습니다. 이러한 데이터는 PARP one 활성이 TRP M 2 채널의 활성화를 통해 여성이 아닌 남성 뉴런의 뉴런 세포 사멸을 악화시킨다는 가설을 뒷받침합니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 산소, 포도당 결핍, 웨스턴 블로팅 또는 QPCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.