Name: 의 리그닌 아래로 규제 ZEA 메이스 dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 배우세요 옥수수에서 RNAi를 이용해 리그닌을 저해하고 Klason 분석으로 정량하는 방법을. ZmCCR1 유전자 침묵을 통해 바이오에탄올 생산용 생분해성 바이오매스를 개선하는 기술입니다.

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현미경 이미지는 고급 현미경의 미시간 주립 대학 센터의 서비스를 통해 실시되었다. 옥수수 캘러스 아이오와 주립 대학의 옥수수 변환 센터에서 구입했다. 저자는 탄수화물 분석에 대한 기술적 인 지원을 MSU 식물 연구소의 제프리 R. 웨더에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 관대 미시간의 옥수수 마케팅 프로그램 (CMPM) 및 식물 생명 공학 연구를위한 컨소시엄 (CPBR)에 의해 투자되었다.

1. ZmCCR1의 아래 규제에 사용 dsRNAi 구문의 준비 <ol><li> dsRNAi 노크 아웃에 ZmCCR1 유전자를 구성하기 위해 필요한 제한 효소 사이트를 포함한 디자인 유전자 특이 적 프라이머. 두 개의 프라이머 세트는 ZmCCR1의 cDNA의 두 조각 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다 :. 1271 뉴클레오티드 748에서 523 bp의 단편, 그리고 1271 뉴클레오티드 986에서 285 bp의 단편 ZmCCR1의 cDNA는 애리조나 게놈 연구소 (AGI)에서 제공되었다. 더 자세한 내용은 그림 1에 설명되어 있습니다. </li><li> ZmCCR1_748F_BglII 프라이머 (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;)와 ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;)를 사용하여 cDNA를 ZmCCR1 템플릿으로부터 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 큰 단편을 증폭한다. ZmCCR1_986F_BglII 프라이머 (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;)와 ZmCCR1_1271R_SacI (5R을 이용하여 더 작은 프래그먼트 (285 BP)를 증폭17]-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> 개별 제조업체의 지침에 따라을 pGEM-T 쉬운에 조각을 결찰. </li><li> 각각 포함, 개별 형질 전환 체로부터 미니 준비 플라스미드 DNA 분리를 수행을 pGEM-T 상용 미니 준비 플라스미드 키트를 사용하여 구성합니다. </li><li> 두 다이제스트에 BglII과를 NcoI 모두와을 pGEM-T :: ZmCCR1 (523 BP)과 ImpactVector (IV) -1.1 (세포질 발현 벡터). </li><li> IV-1.1 정제 소화 젤로 큰 소화 겔 정제 ZmCCR1 조각 (523 BP)을 결찰. </li><li> IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 BP)에 작은 조각을 삽입하기 위해 BglII에와 SacI에 모두을 pGEM-T :: ZmCCR1 (285 BP)와 IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 BP)를 소화. </li><li> IV-1.1 정제 소화 겔 :: ZmCCR1 (523 BP)에 작은 소화 겔 정제 ZmCCR1 조각 (285 BP)을 결찰. </li><li> 523 BP 285 BP의 fragmen 모두 복제거꾸로 반복 조각의 중간에 238 bp의 스페이서 (그림 1 참조)와 285 bp의 역 반복 서열을 가지는 ZmCCR1의 RNAi가 구성 할 수있는 IV-1.1에 TS. </li><li> 이 대장균 (대장균)에 구축 이동, 그들을 성장과 옥수수 유전자 변형에 대한 충분한 플라스미드 DNA를 얻기 위해 미디 준비 크기의 플라스미드 DNA 분리를 수행합니다. </li></ol> 2. 유전자 변형 옥수수 <ol><li> 텅스텐 입자의 제조 <ol><li> 1.5 ML 튜브에 텅스텐 구슬 60 밀리그램 (M10)을 넣고 2 분 동안 소용돌이로 교반하여 70 % 에탄올 1 ㎖로 씻는다. 23 ° C에서 10 분 동안 배양 한 다음 2 분 동안 18,894 XG에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. </li><li> 2 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 버리고, 1 ㎖ 100 % 에탄올로 3 회 씻는다. 60 ㎎ / ㎖로 미세 입자의 농도를 가지고 멸균 50 % 글리세롤의 1 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 사격에 대한 DNA의 준비 <ol><li> 경기 수1.5 ML 튜브에 50 % 글리세롤 제조 텅스텐 구슬의 50 μL (3 mg)을 에이스. IV-1.1의 5 μL (1 μg) :: ZmCCR1 RNAi의 플라스미드 DNA, 2.5 M 염화칼슘의 50 μL, 0.1 M 스퍼 미딘의 20 μl를 추가합니다. 간단히 위의 시약의 각 추가 사이의 소용돌이. </li><li> 소용돌이 30 초 동안 18,894 XG에 텅스텐 비드 DNA 혼합물 간단히 원심 분리기. 뜨는을 붓고, 70 % 에탄올 140 μL에 펠렛을 재현 탁. 액체를 제거하고 폐기. 100 % 에탄올 140 μl를 추가합니다. 액체를 제거하고 폐기. </li><li> 100 % 에탄올 48 μl를 추가합니다. 이전의 폭격에 최대 4 시간 동안 즉시 사용하거나 얼음에 저장합니다. </li></ol></li><li> 충격 <ol><li> 32 (osmotium로) 적어도 4 시간 전에 폭격에 N6OSM 미디어를 포함하는 100mm 배양 접시의 중간에 (아이오와 주립 대학의 옥수수 변환 센터에서 제공) 3-5 cm 직경 안녕-II 배 발생 옥수수 캘러스를 놓습니다. </li><li> Prepar제조업체의 지침 33에 따라 전자 PSD-1000/He 입자 전달 장치. </li><li> 70 % 에탄올로 챔버 벽을 살균. 멸균 고정 캡으로 멸균 650 PSI 파열 디스크를 넣습니다. 마크로 캐리어, 건조 잠깐의 표면에 M10-DNA 솔루션 5-6 μl를 확산. 로드 마크로 캐리어 및 마이크로 캐리어 발사 어셈블리로 화면을 중지. </li><li> 정지 화면 (L2 = 6 CM) 및 가까운 문에서 선택한 거리에서 챔버에서 마이크로 캐리어 발사 조립 및 옥수수 캘러스를 놓습니다. 와이어 메쉬 스크린에 대해 27 PSI의 진공 가속화. </li><li> 파열판 버스트 및 헬륨 압력 게이지가 제로로 떨어질 때까지 화재 버튼을 누릅니다. 발사 버튼을 놓습니다. </li><li> 27 ° C에서 어둠 속에서 16 시간 동안 N6OSM (삼투 배지) (32)를 포함하는 페트리 접시에 포격 캘러스를 품어 약 10 조각으로 캘러스를 중단하고 N6E (캘러스 유도 배지)에 배양 접시에 32을 전송하고 5 일 동안 배양 난N 27 ° C에서 어둠. </li></ol></li><li> 선택 <ol><li> N6E 5 일 후, N6S 매체 (선택 미디어) 32에 캘러스를 전송합니다. 서브 컬쳐 선택 매체의 모든 캘러스 캘러스 구조를 방해하지 않고 8~12주마다 30 일. </li><li> 8 ~ 10 주 후, 흰색 빠르게 성장하는 부문은 비 증식 부분적으로 괴사 어머니 캘러스 밖으로 성장할 것입니다. 흰색 빠르게 성장하는 조직을 절제하고 신선한 선택 배지 (N6S) (32)을 배양하고 위의 배양을 계속합니다. </li></ol></li><li> 재건 <ol><li> 재생 매체 (32)에 흰색과 빠르게 성장하는 배아 캘러스를 전송하고 1 주 동안 위와 같이 품어. 25 ~ 27 ° C에서 16 시간의 일광과 8 시간의 어둠의 기간에 재생 배 발생 캘러스 스위치 </li><li> 회생이 응원에 3-4주 후 유리 테스트 튜브 매체 (32)를 촬영 전송, 상기와 같이 배양을 계속합니다. 상당한 연구 후OOT 개발은 토양 4 &quot;화분에 묘목을 이식 한 후, 물 꼭지에서주의 깊게 뿌리를 씻어 나타납니다. 촉촉하게 유지하기 위해 플라스틱 가방과 함께 냄비를 커버. 이일은 작은 구멍 비닐 봉투를 한 후. 5-6일 후 비닐 봉투를 제거합니다. 다른 5~6일 위와 같이 배양을 계속합니다. </li></ol></li><li> 온실 <ol><li> 토양 18 &quot;화분에 모종을 전송하고 전체 여름 햇빛 또는 온실 빛을 유지한다. 첫 번째 씨앗은 T 1 세대에 속하는 반면, 초기 재생 식물은 T 0이라고합니다. </li></ol></li></ol> 3. 조직 학적 분석 <ol><li><ol><li> 10 % 중성 포르말린 5 ㎖에 옥수수 잎 중순 갈비뼈를 고정합니다. </li><li> 공정 및 진공 티슈 프로세서를 사용하여 티슈 프로세서 파라핀으로 침투. </li><li> HistoCentre III 임베딩 스테이션을 사용하여 파라핀의 조직을 포함합니다. </li><li> 가장자리에서 초과 파라핀을 제거 한 번 블록KS는 냉각된다. </li><li> 마이크로톰을 사용하여 마이크로톰 4-5 μm의 섹션에 샘플. </li><li> 현미경 슬라이드 및 2-24 시간 동안 56 ° C 배양기에서 건조에 섹션을 배치합니다. 확인 섹션은 완전히 슬라이드에 부착되어 있습니다. </li><li> 23 ℃에서 5 분 동안 크실렌의 두 가지 사항에 Deparaffinize 섹션 </li><li> 수화물은 2 분 동안 100 % 에탄올 두 가지 변경, 23 ℃에서 2 분 95 % 에탄올의 두 가지 변경을 통해 슬라이드 </li><li> 2 분 동안 흐르는 수돗물에 섹션을 씻어. </li><li> 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 톨루이딘 블루 O와 얼룩 DDH 2 O로 간단히 씻어 </li><li> 광학 현미경과 침수 오일 및 시각화 샘플을 커버 슬립을 놓습니다. </li></ol></li><li> 주사 전자 현미경 (SEM) <ol><li> 4 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 횡단 옥수수 잎 중순 갈비뼈를 수정하고 1 ~ 2 시간 동안 4 ° C에서 0.1 M 인산 나트륨 완충액 (pH 7.4). </li><li> 간단히 버퍼의 샘플을 씻어, 그들에 탈수10 분, 3X 각 계조하고 100 % 에탄올에서 15 분 동안 에탄올 시리즈 (25 %, 50 %, 75 %, 95 %). </li><li> 과도 유체로서 액체 이산화탄소를 사용 임계점 건조기에서 탈수 횡단 옥수수 잎 중앙 리브 말린다. </li><li> 높은 진공 탄소 탭을 사용하여 알루미늄 스텁에 건조 된 샘플을 탑재 </li><li> 코트 옥수수 잎 중간 갈비 아르곤 가스로 치환 스퍼터 코팅기에 금 (약 20 nm의 두께)와 알루미늄 스텁에 장착. </li><li> JEOL JSM-6400V (란탄 hexaboride 전자 에미 터) 주사 전자 현미경에 코팅 된 샘플을 검사합니다. </li><li> 디지털 이미지는 분석 프로 소프트웨어 (버전 3.2)을 사용하여 묘사 하였다. </li></ol></li></ol> 4. Klason 리그닌 측정 <ol><li> 2 ㎜의 스크린 공장은 샘플. </li><li> 각 샘플의 수분 함량을 결정하고 값을 기록하는 수분 분석기를 사용한다. </li><li> ~ 각 샘플 1.5 g을 칭량하고 중량을 기록한다. Extract 자동화 된 용매 추출 (추출 당 3 회 ~ 사이클 당 14 분) 또는 속실 렛 장치 (추출 당 8 시간)을 사용하여 두 번째 추출 에탄올 다음에 제 1 추출, 물을 사용하여 샘​​플. (참고 :이 단계는 명백한 Klason 리그닌 함량이 증가, 산 가수 분해 동안 응축하고 정확한 리그닌 측정을 방해 할 수있는 추출액을 제거합니다.) </li><li> 밤새 45 ° C에서 추출 된 샘플을 건조하고이를 데시 케이 터, 다시 무게를 할 수 있습니다. </li><li> 30 ° C.에 인큐베이터를 설정 (샘플 당 삼중 권장) 나사 정상 고압 튜브에 각각 건조, 추출 된 샘플 0.3 g을 측정하고 가장 가까운 0.1 mg의 무게를 기록한다. 각 압력 튜브에 72 % H 2 SO 4 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 유리 또는 테플론 교반 막대를 사용하여 샘​​플을 섞는다. 물이 배양 한 다음 추가 될 때까지 튜브에 교반 막대를 둡니다. </li><li> 인큐베이터에 튜브를 놓고 그 자체30 ° C에서 60 분 동안 150 rpm의 t. 1 시간 후 4 %로 산 농도를 희석 교반로드와 혼합 탈 이온수 84 ㎖를 추가합니다. 물 라인 위의 유리 병의 측면에 샘플의 많은 양이 남지 않도록주의하십시오. </li><li> 단단히 모든 병의 마개를 밀봉 금속 랙 또는 큰 비커에 배치합니다. 1 시간 동안 액체 살균주기를 사용하여 121 ° C에서 압력솥. 그들을 열기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 최소 4 시간 동안 575 ° C에서 가열로에서 필터링 도가니를 미리 재가. 도가니는 한 시간 이상 건조기를에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 진공 도가니 확보 고무 어댑터를 이용하여, 별도의 도가니를 통해 각각의 튜브로부터 용액을 고를. 튜브에 남아있는 입자를 씻어 탈 이온수를 사용합니다. </li><li> 4 시간의 최소 105 ° C에서 리그닌 잔류 물을 건조. 건조 도가니 잔류의 무게를 기록한다. </li><li> 575 ° C를 사용하는 경우, 사전에- 화재 분젠 버너에 샘플이 더 연기 나 재가없는 한 후 24 시간 동안 가열로에 배치, 또는 프로그램 노를 사용하는 경우, - 재를 미리 다음과 같은 프로그램을 사용하지 않는 때까지 : </li><li> 105 ° C 상온에서 진입로와 12 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 10 ° C / 분에서 250 ° C의 램프와 30 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 20 ° C / 분에서 575 ° C의 램프 적어도 180 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 로에서 도가니를 제거하고 데시 케이 터. 도가니 재 무게. </li><li> 다음 식을 이용하여 산 불용성 잔사를 계산 </li></ol><img alt="식 (1)" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> 사전 추출 된 바이오 매스의 M PRE = 질량 후 추출 된 바이오 매스의 M POST = 질량 추출 된 바이오 매스의 M 유리 병 = 질량은 유리 병에 추가 도가니와 리그닌 잔 유의 M 잔류 = 질량UE 도가니와 화산재의 M ASH는 = 질량 사전 추출 된 바이오 매스, 총 중량을 기준으로 전체의 MC = 수분 함량 5. 탄수화물 분석 <ol><li> 세포벽 탄수화물 포스터 등을 기준으로 분석한다. (2010) 프로토콜 31을 수행합니다. 간단히, 동결 건조 식물 재료에서 알코올 불용성 잔류 물을 준비합니다. 그런 다음 트리 플루오로 아세트산과 물질을 가수 분해 및 해당 알디 톨 아세테이트에 용해 된 단당류 유도체와 일치합니다. 중극 질량 분석계에 연결된 가스 크로마토 그래피 (GC)에 의해이 휘발성 유도체를 분석. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포벽 다당류를 심는 미생물 셀룰라아제의 액세스는이 페놀 폴리머 (23)와 연결되어있는 정도에 크게 의존한다. 설탕을 발효 될 수있는 목질 계 바이오 매스 변환 속도에 부정적인 식물 secondadry 세포벽에 입금 리그닌 함량과 상관 관계가있다. 이 상관 관계는 그러한 소수성 (24), 화학 등의 이질성 리그닌의 물성에 기인 한 정규 가수 분해성 intermonomeric의 부재 (25)를 결합하고있다. 본 연구에서는 dsRNAi 기술은 유전자 표적에 유전자 아래로 규제의 다양한 수준을 유도. 구성 ZmCCR1_RNAi에 의해 매개 리그닌 다운 규제는 T1의 transgneic 라인의 갈색 착색 귀착되었다. 브라운 주맥 (BM) 색채가 감소 리그닌 함량과 리그닌 성분에 의해 발생되는 자연적으로 발생하는 현상이다. 다른 자연 occurr 달리만 잎 중반 갈비뼈에 갈색 착색을 보여 에드 ...

목질 계 바이오 매스로부터 바이오 연료 생산으로 인해 미국 1 년에 현재 풍부하는 것이 매우 바람직하며, 농림업 잔기의 지속 수확의 경우, 식품 및 동물 사료의 생산에 사용되는 농경지에 직접 경쟁 할 수있는 능력. 그러나, 현재 미국에서 생성 된 바이오 연료의 주요 소스 옥수수 곡물, 달리, 리그 노 셀룰로오스 물질은 훨씬 더 복잡하고 어려운 무너 뜨리는 수 있습니다. 장쇄 탄수화물, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스, 리그 노 셀룰로오스 성 물질의 발효 중에 당류의 주 소스이며, 식물 세포벽의 많은 유형 또한 리그닌을 포함하고, 병원체의 공격에 대하여 강도, 방위를 제공 phenylpropanoid 중합체 및 소수성 외에 벽을 셀. 식물의 성장과 생존에 필요한 반면, 리그닌은 셀룰로오스 hemicellu의 성공적인 효소 전환에 상당한 장벽을 제공합니다수용성 당을 잃게됩니다. 높은 리그닌 함량을 가진 재료는 일반적으로 (생물학적 변환 경로를 통해) 생물 연료 및 가공 특성 및 제품의 품질에 부정적인 영향으로 인한 펄프와 종이 산업에 모두 덜 바람직한 물질이다. 따라서, 작물 구조 강도 및 방어 시스템을 방해하지 않는 수준에서 리그닌 감소를위한 식물 재료의 유전자 조작은 리그 노 셀룰로오스 바이오 연료와 펄프 및 제지 산업을 모두 생산 비용의 감소를 위해 중요 할 수 있습니다. 옥수수 (ZEA 메이)에서 리그닌 공유 ferulate 및 diferulate 다리를 통해 2 차 전지 벽에 헤미셀룰로오스에 대한 상호 연결되어 있습니다. 리그닌 헤미셀룰로오스 복잡한 이차 전지 벽에 무결성과 힘을 부여 복잡한 매트릭스를 형성, 수소 결합을 통해 셀룰로오스 미세 섬유에 결합한다. 식물 세포벽의 기계적 강도는 크게 리튬의 유형에 의해 결정된다gnin 3-5 소단위. 이전의 연구에서, 리그닌 서브 유닛의 비율을 변경하는 효소 소화 6-11에 뚜렷한 경향을 보이지 않고있다. 그러나, 리그닌 함량의 감소는 일반적으로 변환 (12, 13)의 향상을 보여 endocellulases, cellobiohydrolases 및 β-글루코시다 제 (14)를 포함하여 가수 분해 효소에 의해 식물 소재의 소화율을 증가시키는 열쇠가 될 수 있습니다. 전 사체의 발현 정도를 조절하는 유전 공학 광범위 작물 특성을 개선하기 위해 실시되었다. 안티센스 (15)과 공동 16 억제 기술 등 고급 기술은, 아래로 규제 대상 유전자의 효과적인 수 있습니다. 완전한 유전자 녹아웃은 머리핀 구조 (17) 인트론 접합 RNA를 암호화하는 유전자의 구조를 사용하여 달성되었습니다. 또한, 이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술, 즉 강력하고 효과적인 유전자 발현 미디어대상으로 성적 저하 또는 번역 탄압 중 하나에 의해 작동 토르, 목표 mRNA의 18에 억제 효과의 넓은 범위를 유도하는 강력한 수단을 제공한다. 유전자 침묵 기술은 몇 가지 제한 사항을 보여줍니다. 이러한 기술은 정확하게 전사의 수준을 규제하지 않고는 다른 동종 유전자에 예기치 않은 침묵 효과를 일으킬 수 있습니다. 이 방법에서는, 우리는 dsRNAi은 옥수수 게놈에 생성 수행하는 입자 충격을 채택했다. 현재까지 식물 종의 광대 한 배열이 성공적으로 입자 충격, 아그로 박테 리움 매개 형질 전환, 일렉트로 및 미세 주입 방법을 사용하여 변형되었다. 그것은 가장 효율적이므로 옥수수 유전자 변형에서, 입자 충격 법은 모든 다른 방법에 비해 유리하다. 입자 충격 박테리아에 의존하지 않는, 그래서 방법은 유전자의 유전자, 종의 크기 또는 생물 제약은 무료입니다이긴, 또는 식물의 유전자형. 물리적 유전자 전달체는 높은 변환 효율이 19에서 엽록체로 식물 게놈에 및 경우에 따라 도입 될 고 분자량 DNA 복수 유전자를 가능하게한다. 잎 중앙 리브의 혈관계에서 리그닌 환원은 샘플의 지형 및 조성을 조사하기위한 유리한되는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 가시화 될 수있다. 옥수수 식물, 신나-CoA 환원의 두가 (ZmCCR1 : X98083 및 ZmCCR2 : Y15069) 유전자는 옥수수 게놈 (20)에서 발견되었다. 신나 모일-CoA 환원은 신나 밀 알데히드로 hydroxycinnamoyl 아실-CoA 에스테르의 전환을 촉매한다. 유전자가 모든 lignifying 조직에서 발현되어 있기 때문에 우리는이 효소를 하향 조절하는 ZmCCR1 유전자를 선택했다. 시퀀스 것으로 나타났다 때문에 ZmCCR1 유전자의 3 &#39;말단에 523 개의 뉴클레오티드는 dsRNAi가 구성을 위해 선택되었다ZmCCR2들에 비해보다 다양. 따라서, dsRNAi 구조는 정확하게 21를 입을 오프 대상 피하고 만 ZmCCR1에 바인딩합니다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 세포질 발현 시스템 ImpactVector1.1 태그로 설계 하였다 (1.1 IV) 녹색 조직 특이 적 프로모터를 함유하는, 리불 로스 -1,5 - 비스 포스페이트 카복실 시게나 (RuBisCO). dsRNAi는 형질 전환 식물에서 생성의 효과를 연구하기 위해, 리그닌 함량을 정량 하였다. Klason (산 불용성) 리그닌 측정 리그닌 (22)의 일부를 용해 산성 세제 리그닌 정량 방법에 비해 더 정확한 것으로 알려져있다. 따라서 Klason 리그닌은 형질 전환 된 옥수수 줄기 측정 하였다. 이 절차는 수용성 단당류 (23) 내로 중합체 탄수화물 변환 두 단계의 산 가수 분해로 구성된다. 가수 매스이어서 산 가용성 및 불용성 분획으로 MATERIALS 및 산 불용성 리그닌은 이전 연구 23, 24에 따라 측정 하였다. 이상적으로, 리그닌 분석 전에 결과를 방해 할 수있는 가용성 물질을 제거하기 위해, 가수 분해 단계, 잔사에 존재하는 회분을 고려하여 리그닌 잔기의 후 가수 분해 연소에 물, 에탄올 추출을 포함해야한다. 이 단계없이, 시료의 리그닌 함량을 인위적으로 팽창 될 수있다. 전체 방법은 그러나 우리의 실험을 위해 우리가로 인해 테스트에 사용할 재료의 작은 볼륨으로 이러한 단계를 모두 수행 할 수 없습니다, 여기에 제시되어 다른 두 세포벽 성분, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 리그닌 하향 조절 된 유전자 변형 옥수수 라인 분석 하였다. 이보고되고있다 그 중 하나를 자신의 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 25, 4-coumarate 아래로 조절 된 형질 전환 식물 : CoA를 리가 (4CL) 26, 또는 신나lcohol 탈수소 효소 (CAD)는 27 일 다른 세포 벽 구조 구성 요소의 증가를 보여줍니다. 우리의 연구에서 첫 단계로서, 결정질 셀룰로오스 Updegraff 방법 (28)을 사용하여 측정 하였다. 이 방법은 원래 cellulolytic 세균 및 곰팡이의 다수의 셀룰로오스의 결정을 위해 고안되었다. 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 xylosans을 제거하기 위해 간단히, 분쇄 옥수수의 주식은 Updegraff 시약 (물 : 질산 초산)으로 처리 하였다. 결정 셀룰로오스는 완전히 SO 4 H 2를 추가하여 Saeman 가수 분해를 통해 포도당으로 가수 분해시켰다. 결정 셀룰로오스는 다음 비색 트론 방법 29을 사용하여 측정 하였다. 헤미셀룰로오스의 내용이 변경된 경우를 확인하기 위해, 분쇄 된 수피로부터 단당류 추출물을 트리 플루오로 아세트산을 사용하여 가수 분해 알디 톨 아세테이트의 방법을 사용하여 유도체 화 한 후, 가스 크로마토 그래피 (GC) (30)에 의해 분석 하였다. 결정에 셀에 대한 자세한 절차lulose 내용과 매트릭스 다당류 성분의 분석은 포스터 등으로 설명되어 있습니다. (2010) 31. 여기, 우리는 리그닌에 사용되는 절차에 대해 설명 아래 규제의 RNAi 기술, 입자 충격의 변환 및 바이오 연료 발효 설탕에 옥수수 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 가속 해체를위한 리그닌 분석을 통해 옥수수에서.

<table><tbody><tr><td>N6OSM (삼투압 배지)</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>N6E (굳은살 유도)</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>N6S 매체 (선택 배지)</td><td></td><td></td><td>자체</td></tr> 제작 <tr><td>재생 매체</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>루팅 배지</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린(1 L)</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>Bio-Rad PSD-1000/He 입자 전달 장치</td><td>Hercules, CA, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss PASCAL 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td><td></td><td>명시야 현미경의 경우 488nm 여기 미러, 560nm 방출 필터 및 505-530nm 방출 필터가 있는 Zeiss(Jena, Germany) PASCAL 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 이미지를 기록했습니다. 이미지 분석은 레이저 스캐닝 현미경 PASCAL LSM 버전 3.0 SP3 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.</td></tr><tr><td>Excelsior ES Tissue Processor</td><td>Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCentre III Embedding Station</td><td>Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome Model Reichert 2030</td><td>Reichert, Depew, NY, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emscope Sputter Coater model SC 500</td><td>Ashford, Kent, England</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL JSM-6400V 주사전자현미경</td><td>JEOL Ltd., 일본</td><td></td><td></td>도쿄</tr><tr><td>Fitzpatrick JT-6 동형질 공장</td><td>Continental Process Systems, Inc., 일리노이주</td><td></td><td></td>웨스트몬트</tr><tr><td>MA35 수분 분석기</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>임계점 건조기, Balzers CPD</td><td>Leica Microsysstems Inc, 미국</td><td></td><td></td>일리노이주 버팔로 그로브</tr> 스크류 <tr><td>탑 고압 튜브</td><td>Ace Glass, Vineland, NJ</td> <td># 8648-27</td><td></td></tr><tr><td>스크류 탑 고압 튜브 플러그</td><td>Ace Glass, Vineland, NJ</td> <td># 5845-47</td><td></td></tr></tbody></table>

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; zea 메이스</em&gt; dsrnai 및 klason 리그닌 분석을 통해

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

생물 전환 공정 동안에 대안 바이오 에너지 자원 등 목질 계 바이오 매스의 사용을 촉진하기 위하여, 전처리 단계는 세포벽 탄수화물의 접근성을 증가, 식물 세포벽의 구조를 열 필요가있다. 리그닌, 많은 세포 유형의 벽에 존재하는 폴리 페놀의 재료는, 액세스를 효소 심각한 지장으로 알려져있다. 식물의 구조적 완전성과 방어 시스템을 방해하지 않는 레벨로 리그닌 함량의 감소는 바이오 에탄올 생산 비용을 줄이기 위해 가치있는 단계 일 수있다. 이 연구에서는 유전자 이중 가닥 RNA 간섭 기술을 통해 리그닌 생합성 관련 유전자 중 하나, 신나-CoA 환원 (ZmCCR1)를 아래로 조절했다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 입자 충격 법을 사용하는 옥수수 게놈에 통합 하였다. 형질 전환 옥수수 식물에없이 야생형 대조군 식물과 비교하여 일반적으로 성장형질 전환 식물의 잎 중간 갈비, 껍질에 갈색 착색의 표시를 제외하고, 바이오 매스의 성장이나 방어 메커니즘으로 terfering 및 줄기. 현미경 분석은 조직 학적 분석과 함께, 잎 후벽 섬유 박형화되었지만 다른 주요 혈관 시스템 구성 요소의 구조 및 크기가 변경되지 않았 음을 밝혔다. 유전자 변형 옥수수의 리그닌 함량은 7-8.7 % 감소시키고, 결정 성 셀룰로오스, 리그닌 함량 감소에 응답하여 증가하고, 헤미셀룰로오스는 그대로 남아 있었다. 분석은 탄소 흐름이 셀룰로오스 생합성에 리그닌 생합성에서 변환 된 경우가 있습니다 나타낼 수 있습니다. 이 문서의 RNAi 기술을 통해 옥수수의 리그닌 함량을 하향 조절하기 위해 사용되는 절차를 묘사하고 세포벽 조성은 세포벽 구조에 대한 변형의 효과를 검증하기 위해 사용 분석한다.

우리는 RNAi를 통해 옥수수 식물의 리그닌 함량 감소를 보여 주었다. 입자 충격의 변환 방법은 약 30 % trnasformation 효율을 얻었다. ZmCCR1의 유전자 침묵 일관 T0-T2 세대에서 관찰되었다. 리그닌 감소 된 형질 전환 체는 잎 중간 리브, 껍질, 줄기에 갈색 채색을 표시 제외 야생형 옥수수 식물과 유사하게 성장했다. 조직 학적 분석은 돌연변이 라인 옥수수 잎 중앙 리브 (18)의 후벽 섬유의 셀 벽 두께의 상당한 감소를 나타내고 있음을 보여 주었다. 셀 벽 두께의 감소에도 불구하고, 통 용기, 체관부 및 외피 세포를 포함한 다른 주요 혈관 시스템의 구조는 야생형 제어 (도 2A) (18)와 비교하여 차이점을 공개하지 않았다. 이것은 나에게 줄기에 물 수송, 영양 전송, 또는 기계적 강도 중 하나에 대한 해로운 영향이없는 것을 의미한다N ZmCCR1_RNAi 돌연변이 라인. <p class="jo...

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 RNAi를 통해 옥수수의 리그닌 함량을 감소시켜 바이오에탄올 생산을 위한 소화 가능한 바이오매스 생산을 용이하게 하고, Clayson 리그닌 측정 프로토콜을 사용하여 리그닌 함량을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 리그닌 생합성 관련 유전자인 syn oil COA reductase를 억제하기 위한 옥수수 CCR one RNAi 플라스미드를 구축합니다. 그다음, 입자 충격법(particle bombardment)을 사용하여 옥수수 high two 배아 캘러스에 ZM CCR one RNAi 컨스트럭트를 형질전환시키고, 동형접합체 형질전환 라인을 생성합니다.그런 다음, 형질전환 옥수수의 1세대, 2세대 및 3세대를 대상으로 조직학적 분석과 주사전자현미경 관찰을 통해 표현형 변화를 관찰합니다. 마지막으로, 형질전환 옥수수 라인의 산 불용성 또는 clason 리그닌 함량을 측정하여 비형질전환 옥수수 식물의 리그닌 함량과 비교합니다. 최종적으로, 파티클 bombardment 방식을 사용하고 Clayson 리그닌 측정법으로 분석한 결과, wild type 식물과 비교하여 CCR one 형질전환 옥수수 식물에서 리그닌이 10% 감소했음을 보여주는 결과를 얻습니다. 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 이는 일부 단계가 습득하기 어렵기 때문이며, 이러한 고난도 단계에는 무균 조건에서의 옥수수 배아 캘러스 준비, 플라스미드 DNA를 이용한 파티클 코팅, 그리고 캘러스의 파티클 bombardment가 포함됩니다. Dr.Hossein Aladin, Dr.Gli Brew Han 및 학부생이 참여하였습니다.Donald은 입자 충돌을 통한 절차를 보여줌으로써 이 연구를 시연할 것입니다. 바이오에탄올 생산에 있어 클레이슨 리그닌(clayson lignin) 측정 기술의 시사점은, 다양한 리그노셀룰로오스 소재 내의 클레이슨 리그닌 양에 관한 정보를 제공할 뿐만 아니라, 전처리 과정 중 리그노셀룰로오스 바이오매스가 셀룰로오스 효소에 얼마나 저항적인지에 대한 통찰을 제공한다는 점입니다. 텅스텐 입자를 준비하려면 먼저 60 mg의 텅스텐 비드를 1.5 mL 튜브에 넣으십시오.70% ethanol 1 mL를 첨가하고 2분 동안 vortexing하여 세척합니다. 그런 다음 23 °C에서 10분 동안 배양하고 18,894 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 100% ethanol 1 mL를 사용

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

공촛점 래맨 현미경에 따라 방법은 레이블이없는 식물 세포 벽에 리그닌의 시각화 및 다른 조직, 표본 또는 수종의 lignification의 비교를 내실수 것을 제공됩니다.

라벨 - 무료 현장에서</em식물 세포 벽 Lignification의> 이미징

이 비디오에서는 특수 식물 세포에 존재하는 시린질 리그닌을 염색하기 위한 Maule 염색 기술에 대해 설명합니다. 이 염색 기술은 물관부 및 근막간 섬유의 리그닌 분포를 특성화하는 데 도움이 됩니다.

리그닌을 위한 Maule 염색: 애기장대 탈리아나 줄기 절편에서 리그닌 분포를 특성화하는 기술

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

발달적으로 중요한 많은 유전자는 세포 또는 조직 특이적 발현 패턴을 가지고 있습니다. 본 논문은 야생형과 비교하여 옥수수잎-칼집 경계와 lg1-R 돌연변이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하기 위한 LM RNA-seq 실험에 대해 설명합니다. 여기에서 논의된 실험적 고려 사항은 다른 발달 현상의 전사체 분석에 적용됩니다.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

블 리스, lignification 역학 공부에 대 한 이중 라벨 프로토콜 개발 되었다. 합성 monolignol를 사용 하 여 기자와 SPAAC 및 CuAAC bioorthogonal의 순차적 결합 반응,이 방법론 포장 lignins에서 planta에의 속 규제 요인의 심층 분석 하는 방법 클릭 합니다.

Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

여기, 우리는 여러 바이오 매스 소스 로부터 리그 닌의 에탄올 추출 수행 하는 프로토콜을 제시. 리그 닌 수율 및 β-O-4 콘텐츠 추출 조건의 효과 표시 됩니다. 선택적인 depolymerization 높은 방향족 모노 머 제품을 얻은 lignins에 수행 됩니다.

온화한 에탄올 추출 및 Depolymerization 수율에 미치는 영향에 의해 높은 β-O-4 콘텐츠 리그 닌의 추출

이 프로토콜은 스펙트럼 및 형광 수명 측정을 결합하여 로다민 기반 형광 프로브와 리그닌 폴리머 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 두꺼운 식물 섹션에서 직접 평가하는 원래 의설정에 대해 설명합니다.

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

깊은 유텍 성 용매 기반, 마이크로 파 지원 전처리는 리그노 셀룰로오스 분획 및 고순도 리그닌 복구를위한 녹색, 빠르고 효율적인 공정입니다.

특이한 지중해 리그놀룰로오스 잔류물에서 초고속 리닌 추출

여기서, 우리는 초본 식물 바이오 매스에서 리그닌 함량의 추정을위한 수정 된 TGA 방법을 제시한다. 이 방법은 리그닌과 특정 티오에테르 결합을 형성하여 리그닌 함량을 추정하고, 리그닌 함량 추정을 위해 상대적으로 작은 샘플을 필요로 하기 때문에 클라슨 방법에 비해 이점을 제시한다.

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

배우세요 옥수수에서 RNAi를 이용해 리그닌을 저해하고 Klason 분석으로 정량하는 방법을. ZmCCR1 유전자 침묵을 통해 바이오에탄올 생산용 생분해성 바이오매스를 개선하는 기술입니다.

의 리그닌 아래로 규제

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