차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 1차 쥐, 뇌 미세혈관 내피 세포 또는 MBX를 얻는 것입니다. 이것은 먼저 성체 마우스의 수막이 없는 전뇌를 분리한 다음 균질화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서, 조직 균질액은 효소 분해에 의해 추가로 처리됩니다.

그런 다음 마지막 단계에서 내피 세포를 밀도, 기울기, 원심분리로 분리하고 세포 배양을 위해 도금합니다. 궁극적으로, CD 31 발현을 위해 분리된 세포의 면역형광 염색을 사용하여 MB 메카 배양의 순도를 확인할 수 있습니다. 불멸화된 뇌, 내피 세포주의 사용과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 일차 세포로 얻은 결과가 in vivo 상황에 더 나은 전달성을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 예를 들어 면역 세포 사고에 관여하는 경로와 같은 혈액 뇌 장벽 검색 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 중추 신경계의 신경 혈관, 감염성, 염증성 또는 퇴행성 질환의 치료로 확장됩니다. 혈액 뇌 장벽 기능 장애는 이러한 질병의 병원체에 결정적으로 관여합니다.

이 절차는 우리 연구실의 대학원생인 Lisa Eeping이 시연할 것입니다. 10 주, 8 주에서 12 주까지의 뇌를 분리 한 후 C 57 BL 6 마리의 마우스는 조직을 5 밀리리터의 멸균 PBS에 저장합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 뇌간, 소뇌 및 시상을 제거한 다음 멸균 압지에 각 뇌를 조심스럽게 굴립니다.

수막을 제거하려면 50 밀리리터 매 튜브에 뇌를 넣고 13.5 밀리리터의 DM em을 첨가 한 다음 25 밀리리터 피펫으로 조직을 다진 다음 배지가 유백색이 될 때까지 10 밀리리터 피펫으로 조직을 다집니다. 콜라겐 분해 효소와 DNA의 조직을 섭씨 37도의 궤도 셰이커에서 180RPM으로 소화합니다. 한 시간 후, 조직 현탁액에 10ml의 DM em을 첨가하고 1000Gs 및 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.

느슨한 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 폐기한 다음 25ml 피펫을 사용하여 25ml의 B-S-A-D-M-E-M 펠릿을 약 25회 트라이빙합니다. 세포를 다시 회전시킨 후 직경이 큰 깨진 유리 피펫을 사용하여 유백색 상부 미엘린 층을 제거합니다. 그런 다음 일반 PE 또는 피펫으로 BSA 층을 제거합니다.

펠릿을 9 밀리리터의 DM em에 재현탁시킨 다음 1 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 디스크 공간과 0.1 밀리리터의 DNA를 세포에 첨가합니다. 섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 180RPM으로 용액을 분해합니다. 분해하는 동안 초원심분리기에서 perca 밀도 구배를 설정합니다.

한 시간 후, 반응을 중단하기 위해 분해된 세포 현탁액에 10 밀리리터의 DM E em을 첨가한 다음 세포를 스핀다운시키고 펠렛을 다시 현탁시킵니다.DM E em 2 밀리리터에 당 호출 구배의 위에 세포 현탁액을 조심스럽게 첨가한 다음 원심분리에 의해 세포를 분리합니다. 분리 후에는 세포가 흐린 계면으로 보일 수 있습니다. 멸균 바늘을 따라 30도 각도로 계면에 조심스럽게 담그고 약 12ml의 용액을 수집합니다.

가능한 한 적은 오염으로 많은 세포를 얻기 위해 계면이 보이지 않는 경우가 많습니다. 소량의 인터페이스를 흡인해야 합니다. 그 외에도, 멸균 바늘의 끝은 계면의 모든 부분으로 신중하고 지속적으로 이동해야하며, 세포를 5 밀리리터의 DM em을 포함하는 새로운 50 밀리리터 팔콘으로 옮긴 다음 세포를 다시 회전 시킨 후, 세포 배양 플레이트의 1 평방 센티미터 표면 당 0.2 밀리리터의 내피 세포 배지에 입천장을 현탁시킵니다.

다음으로, 코팅된 세포 배양 플레이트에서 코팅 용액을 제거하고 두 번의 연속 세척 단계를 통해 모든 웰을 멸균 PBS로 헹굽니다. 마지막으로, 멸균 인큐베이터에서 섭씨 37도와 5% 이산화탄소의 내피 세포 배지에서 세포 배양을 유지합니다. 격리 직후 2-3일마다 배지를 교체합니다.

쥐, BM e 및 오염 세포는 세포 배양에서 떠다니는 것을 관찰할 수 있는 역암을 형성합니다. 마이신을 사용한 중간 처리는 오염 세포가 순수 마이신 매개 세포 독성에 훨씬 더 취약하고 영향을받지 않은 BM E가 5 일까지 콜라겐 4 개의 피브로넥틴 코팅 세포 배양 플레이트에 부착하기 시작하고, BME는 약 80-90 %의 밀도로 증식하여 단단히 포장된 단층을 형성하기 때문에 쥐 BMAX를 선택합니다. puram Mycin 선택에 의해 전형적인 방추체 모양의 외관을 특징으로 하는 종방향으로 정렬되고 겹치지 않는 접촉 억제 세포, 내피 세포 마커 CD 31에 의해 확인된 바와 같이 최대 99%murine BMAX의 고순도에 도달합니다. BM E는 밀접한 접합 단백질에 의해 상호 연결된 단단히 밀봉된 단층을 형성합니다.

7-8일간의 배양 후, 이러한 세포층은 제곱센티미터당 20-30옴 사이의 전기 저항에 대한 안정적인 값을 구축하고 이때 풍부한 커패시턴스를 통해 세포 이동 실험 또는 Evans blue 또는 dextran을 사용한 투과성 테스트와 같은 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 이 절차에 따라 4-5시간 내에 수행할 수 있습니다. 이동 분석, 투과성 실험 또는 전기 생리학적 측정과 같은 다른 방법을 수행하여 예를 들어 특정 실험 조건에서 면역 세포 이동이 어떻게 변경되는지와 같은 선구적인 질문을 해결할 수 있습니다.

또는 철분 채널은 혈액 뇌 장벽 조절에 어떻게 관여합니까? 이 비디오를 시청한 후에는 기계적 균질화, 효소, 분해 및 밀도 구배 원심분리를 통해 소변, 뇌 미세혈관 내피 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.