System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozdzielonej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

System ten opiera się na koncepcji rozszczepionej ubikwityny, która odnosi się do zdolności ubikwityny do stabilnego podziału na północny terminal NUBI oraz południowy terminal CUB, zdolne do rekonstytucji w pełnowymiarową cząsteczkę pseudoubikwityny. Podczas gdy rekonstytucja ta zachodzi spontanicznie przy użyciu typu dzikiego NUBI, wprowadzenie mutacji izoleucyny 13 na glicynę, tworzącej fragment zwany NUBG, znacznie zmniejsza jego powinowactwo do CUB, blokując tym samym tworzenie pseudoubikwityny. Jeśli NUBG i CUB zostaną odpowiednio połączone z białkiem A i białkiem B, a białka A i B będą zdolne do interakcji, wówczas cząsteczka pseudoubikwityny może zostać ponownie utworzona.

W tej metodzie integralne białka przynęty (bait) są fuzowane z fragmentem CUB połączonym ze sztucznym czynnikiem transkrypcyjnym. Podczas gdy białka ofiary (prey) są fuzowane z fragmentem NUBG, interakcja między przynętą a ofiarą prowadzi do rekonstytucji pseudo-ubikwityny, która z kolei może być rozpoznana przez cytozolowe enzymy deubikwitynizujące, przedstawione jako nożyczki. Enzymy te przecinają łańcuch za C-końcem CUB, uwalniając czynnik transkrypcyjny, który może następnie wniknąć do jądra i aktywować system reporterowy, co pozwala na selektywną izolację i identyfikację komórek, w których zachodzą interakcje przynęta-ofiara.

Witajcie, jestem Janie Snyder z laboratorium Igor STAARs na wydziale genetyki molekularnej i biochemii Uniwersytetu w Toronto. Dzisiaj zaprezentuję procedurę dwuhybrydowego systemu membranowego, znanego jako M2H. W naszym laboratorium wykorzystujemy tę procedurę do badania oddziaływań białek integralnych błon komórkowych. Zaczynajmy.

Przed przeprowadzeniem analizy myth należy zweryfikować, czy koniec N i/lub C białka przynęty znajduje się w cytozolu komórki. Znacznik CUB Lex A VP 16 musi być połączony z białkiem na tym końcu. Ponieważ enzymy deubikwitynujące niezbędne do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego znajdują się w cytozolu, w przypadku nieznanej topologii białka przynęty można stworzyć konstrukty oznakowane na obu końcach (N i C) i, stosując opisany poniżej test kontrolny N-U-B-G-I, sprawdzić, czy którykolwiek z nich nadaje się do użycia w myth, co wskazywałoby, że dany koniec jest cytozolowy.

Następnie zdecyduj, który z dwóch głównych wariantów metody myth jest odpowiedni dla Twojego eksperymentu. W przypadku natywnych białek drożdżowych metodą z wyboru jest zintegrowany myth lub immy. W immy białka są endogennie znakowane tagiem CUB Lex a VP 16, co pozwala na pozostawienie ich pod kontrolą natywnego promotora.

Jest to korzystne, ponieważ poziom ekspresji typu dzikiego Bates pomaga wyeliminować problemy związane z nadekspresją białek, takie jak zwiększona liczba wyników fałszywie dodatnich dla nie rodzimych białek drożdżowych; można zastosować tradycyjny system myth lub T myth, w którym przynęty z tagiem CU B Lex A V VP 16 są nadekspresjonowane ektopoicznie z plazmidu. W niniejszym protokole skupimy się na T myth, ponieważ ta forma myth ma szersze zastosowanie; z wyjątkiem początkowego konstruowania przynęty oraz stosowanych pośrodków, obie formy myth są przeprowadzane w sposób w zasadzie identyczny. Przynęta musi zostać sklonowana do odpowiedniego wektora w celu tagowania i ekspresji.

Obecnie dostępnych jest wiele wektorów T myth, takich jak BV cztery, p, a, BV cztery oraz PCM BV four, które umożliwiają konstrukcję białek z tagami C-końcowymi Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 pod kontrolą odpowiednio bardzo silnego promotora TF one strong, A DH one oraz słabego promotora CYC one. Po wybraniu efektora białkowego należy przeprowadzić trawienie restrykcyjne plazmidu w odpowiednim miejscu restrykcyjnym. Cięcie powinno nastąpić wyłącznie w bezpośrednim sąsiedztwie tagu CU B Lxe VP 16 – powyżej tagu w przypadku tagowania C-końcowego lub poniżej tagu w przypadku tagowania N-końcowego.

Na przykład, przy użyciu wektora PAM BV, idealnym wyborem jest SFI one; po trawieniu plazmidu i przechowywaniu go w temperaturze -20°C do momentu użycia, kolejnym krokiem jest zaprojektowanie starterów do amplifikacji i klonowania interesującego genu. Koniec 5' startera forward musi być komplementarny do około 35 do 40 nukleotydów powyżej miejsca restrykcyjnego. Z kolei koniec 3' musi być komplementarny do pierwszych 18 do 20 nukleotydów genu docelowego, którym jest DRB dwa kodujący beta dwa i receptor generyczny.

W naszym przykładzie koniec 5' startera odwrotnego musi być komplementarny do odwrotnego dopełnienia około 35 do 40 nukleotydów znajdujących się za miejscem restrykcyjnym. Przy jednoczesnym dopasowaniu końca 3' do odwrotnego dopełnienia ostatnich 18 do 20 nukleotydów genu docelowego z pominięciem kodonu stop, jeśli tag CUB Lex say VP 16 jest umieszczany na koniec C, tak jak w przedstawionym przykładzie. W zależności od tego, czy oznakowanie odbywa się na koniec N czy C, należy upewnić się, że wybrane 35 do 40 nukleotydów sekwencji plazmidu użytych w starterze prawym lub odwrotnym pozwoli na sklonowanie genu docelowego w odpowiedniej ramce odczytu z tagiem CU B Lex, a VP 16. Ponieważ w naszym przykładzie oznakowany zostanie koniec C białka A DRB dwa.

Wybrano 35 zasad sekwencji A MBV w prawym primerze w taki sposób, aby sekwencje genów A DRB two oraz CUB znajdowały się w tej samej ramce odczytu; następnie za pomocą PCR z użyciem wybranych primerów amplifikuje się interesujący gen. Parametry PCR będą zależeć od konkretnego enzymu oraz specyficznych primerów, aby stworzyć środowisko umożliwiające zajście homologicznej rekombinacji z naprawą przerwy. Wcześniej trawiony plazmid oraz amplifikowany interesujący gen transformuje się do odpowiedniego szczepu drożdży zgodnie ze standardowym protokołem transformacji drożdży, takim jak opisany przez Geets i Woodsa.

Po wyrośnięciu transformowanych drożdży na płytce, należy pobrać pojedynczą kolonię szczepu i zaszczepić ją w pięciu mililitrach pożywki SD bez leucyny. Pożywki płynne inkubuje się w temperaturze 30 °C przez noc, aż kultura urośnie i osiągnie nasycenie. Komórki należy odwirować przy 700 ×g przez pięć minut i usunąć nadsącz, a następnie wyizolować plazmidowy DNA przynęty z osadu komórkowego, korzystając z dowolnego komercyjnego zestawu do mini-prepu.

Należy postępować zgodnie ze standardowym protokołem, wprowadzając jedną modyfikację w celu zapewnienia wystarczającej lizy komórek drożdży: do osadu po wstępnym resuspensowaniu należy dodać sodowe szklane kulek o stężeniu 0,5 mM, a następnie energicznie mieszać w wstrząsarce (vortex) przez pięć minut. Następnie należy kontynuować zgodnie z komercyjnym protokołem. Wyizolowane DNA drożdży należy wprowadzić do chemicznie kompetentnego szczepu e coli odpowiedniego do propagacji plazmidów, przy wydajności transformacji wynoszącej co najmniej 1 × 10⁷ komórek na µg DNA.

Po wyizolowaniu plazmidowego DNA z transformowanych bakterii e coli, należy zweryfikować poprawność konstrukcji plazmidu przynęty poprzez sekwencjonowanie przed rozpoczęciem użytkowania; szczepy przynęty muszą zostać poddane analizie w celu upewnienia się, że białka przynęty są prawidłowo zlokalizowane w błonie drożdżowej. Lokalizację określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Włączenie cząsteczki YFP do sekwencji znacznika przynęty umożliwia bezpośrednią wizualizację żywych komórek i jest powszechnie stosowane w imy.

Alternatywnie, po ustaleniu prawidłowej lokalizacji białka przynęty, można zastosować standardową metodę immunofluorescencji z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko komponentom Lex A lub VP 16 znacznika. Należy upewnić się, że przynęta nie wykazuje samoaktywacji, tzn. nie aktywuje systemu reporterowego samodzielnie ani w obecności nieoddziałującej białkowej przynęty (prey); aby zweryfikować brak samoaktywacji przynęty, stosujemy test N-U-B-G-I. W tym teście.

Przynęta jest transformowana wchodzącym w interakcję pozytywnym oraz niewchodzącym w interakcję negatywnym kontrolnym białkiem łupu, a następnie różne rozcieńczenia każdego transformanta są naniesione na odpowiednie podłoża selekcyjne. Przynęta musi rosnąć na podłożu selekcyjnym w obecności kontroli pozytywnej i nie rosnąć w obecności kontroli negatywnej, aby nadawała się do użycia w systemie drożdżowych dwóch hybryd. Po walidacji przynęty szczep raportujący w systemie drożdżowych dwóch hybryd zawierający przynętę może zostać poddany transformacji zainteresowaną biblioteką łupów w celu przesiewania interakcji białko-białko.

Aby rozpocząć tę wielkoskalową transformację drożdży, zaszczep pojedynczą kolonię szczepu reporterowego MYT zawierającego przynętę do 5 ml pożywki SD minus leucyna i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy potrząsaniu. Rozcieńcz kulturę nocną w 200 ml pożywki SD minus leucyna i inkubuj w temperaturze 30 °C przy potrząsaniu, aż osiągnie wartość OD 600 od 0,6 do 0,7. Po osiągnięciu docelowej wartości OD 600 podziel 200 ml kultury pomiędzy cztery 50 ml wirówki z nakrętką i odseparuj komórki poprzez wirowanie.

Po przemyciu osadów sterylną podwójnie destylowaną wodą i roztworem trasy DTA z octanem litu, każdy osad zawieszamy w 600 µL roztworu trasy DTA z octanem litu w czterech 15 ml zakręcanych probówkach wirówkowych. Do 600 µL resuspenderowanych komórek dodajemy 2,5 ml roztworu PEG z octanem litu, 100 µL roztworu DNA z plemni łososia oraz 7 µg DNA biblioteki prey. Probówki mieszamy przez jedną minutę, aby zapewnić dokładne połączenie składników, a następnie inkubujemy w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez 45 minut.

Po 45-minutowej inkubacji krótko mieszaj próbki co 15 minut. Do każdej probówki dodaj 160 µL dimetylosulfoksydu lub DMSO i natychmiast wymieszaj poprzez odwracanie probówek. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 minut.

Po zakończeniu szoku termicznego zebrać komórki przez wirowanie i resuspender. Każdy z osadów zawiesić w 3 mL pożywki 2X-Y-P-A-D. Przenieść wszystkie próbki do jednej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL z nakrętką.

Inkubuj komórki w temperaturze 30 °C przez 90 minut w celu ich regeneracji. Odwiruj komórki i resuspenduj osad komórkowy w 4,9 ml sterylnego 0,9% NaCl, wykorzystując 100 µl resuspendowanych komórek. Przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w sterylnym 0,9% NaCl w zakresie od 10x do 10 000x; wysiej 100 µl rozcieńczeń 100x oraz 1000x na podłoża selekcyjne i inkubuj w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.

Płytki te służą jako kontrola i są wykorzystywane do analogicznego obliczenia wydajności transformacji. Pozostałe 4,8 ml resuspensowanych komórek rozdzielić na duże płytki 150 mm i inkubować w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni. Po wyrośnięciu kolonii, pojedyncze kolonie, z których każda reprezentuje komórki zawierające potencjalną parę interakującą przynęta-ofiara (bait-prey), resuspender w 100 µL 0,9% NaCl i nanosić aliquoty 5 µL na pożywkę selektywną zawierającą XG, pozostawiając do wzrostu na okres od dwóch do czterech dni.

Do dalszej analizy wybierane są kolonie wykazujące silny wzrost i niebieski kolor. Po wyizolowaniu i zsekwencjonowaniu plazmidów z pozytywnych kolonii drożdży, należy zebrać i przeanalizować wszystkie dane sekwencyjne, aby sporządzić wstępną listę interaktorów. W celu ponownej weryfikacji tych oddziaływań stosuje się test zależności od przynęty.

W tym teście wszystkie plazmidy prey wykazujące interakcje z zidentyfikowanymi białkami są transformowane z powrotem do oryginalnego szczepu bait oraz do szczepu zawierającego kontrolny sztuczny bait, składający się z pojedynczej domeny transbłonowej połączonej z CUB Lex i tagiem VP 16. Pojedyncze kolonie z tych transformacji zawiesza się w 100 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej i nanosi po 5 µL na odpowiednie podłoża selekcywne z dodatkiem X sc. W idealnych warunkach dla każdego prey należy wybrać wiele transformantów, a zarówno oryginalny bait, jak i sztuczny bait powinny zostać naniesione na tę samą płytkę. Płytki inkubuje się od dwóch do czterech dni w temperaturze 30 °C. Drożdże zawierające sztuczny bait i prey, które powodują aktywację systemu reporterowego, są uznawane za niespecyficzne, a taki konkretny prey jest usuwany z listy interaktorów.

Sygnalizuj wzrost i niebieskie zabarwienie drożdży z przynętą (bait), która nas interesuje, przy jednoczesnym braku tych efektów dla przynęty sztucznej. Potwierdź specyficzną interakcję. Jeśli jednak drożdże zawierające białko ofiary (prey) oraz interesującą nas przynętę nie wykazują wzrostu.

Próbka ta zostaje usunięta z listy interaktorów. Pozostałe próbki stanowią pełną listę interaktorów zidentyfikowanych w badaniu przesiewowym. Po zakończeniu procedury uzyskają Państwo mapę interakcji.

Reprezentuje to zbiór potencjalnych interakcji, które badacz musi poddać dalszej analizie w ramach specyficznych badań określonych indywidualnie dla każdego przypadku. Aby ocenić znaczenie biologiczne każdej z nich, zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia procedury membranowego dwuhybrydowego systemu E (membrane E two hybrid) lub procedury myth w celu zidentyfikowania partnerów interakcyjnych białka zainteresowania. Podczas przeprowadzania procedury myth ważne jest zweryfikowanie, czy analizowane białko posiada swój koniec N i/lub C zlokalizowany w cytozolu komórki, oraz odpowiednie zaprojektowanie strategii znakowania.

Dodatkowo ważne jest, aby dokładnie ocenić, czy szczepy przynęty prawidłowo wykazują ekspresję przynęty oraz czy przynęta jest poprawnie zlokalizowana. Ponadto należy przeprowadzić test kontrolny NUB GI, ponieważ jest on pomocny w ustaleniu warunków przesiewowych. Na koniec należy niezależnie zweryfikować wszystkie interakcje wykryte za pomocą metody myth.

Przestrzeganie tych prostych kroków powinno zapewnić uzyskanie jak najlepszych wyników z procedury myth. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.