System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

System ten opiera się na koncepcji rozdzielonej ubikwityny, która odnosi się do zdolności ubikwityny do stabilnego rozdzielenia na połówkę N-końcową NUBI oraz C-końcową CUB, zdolne do ponownego połączenia w pełnowymiarową cząsteczkę pseudo-ubikwityny. Choć proces ten zachodzi samoistnie przy użyciu NUBI typu dzikiego, wprowadzenie mutacji izoleucyny 13 na glicynę, tworzącej fragment zwany NUBG, znacznie zmniejsza jego powinowactwo do CUB, co blokuje tworzenie pseudo-ubikwityny. Jeśli NUBG i CUB zostaną odpowiednio połączone z białkiem A i białkiem B, a białka A i B będą zdolne do oddziaływania, wówczas cząsteczka pseudo-ubikwityny może ponownie zostać utworzona.

W systemie myth przynęty błony integralnej są fuzowane z fragmentem CUB połączonym ze sztucznym czynnikiem transkrypcyjnym. Podczas gdy ofiary są fuzowane z fragmentem NUBG, interakcja między przynętą a ofiarą prowadzi do rekonstrukcji pseudo-ubikwityny, która z kolei może być rozpoznawana przez cytozolowe enzymy deubikwitynizujące, przedstawione jako nożyczki. Enzymy te dokonują cięcia po końcu C fragmentu CUB, uwalniając czynnik transkrypcyjny, który może następnie wniknąć do jądra i aktywować system reporterowy, umożliwiając selektywną izolację i identyfikację komórek, w których zachodzą interakcje przynęta-ofiara.

Witajcie, jestem Janie Snyder z laboratorium Igor STAARs na wydziale genetyki molekularnej i biochemii Uniwersytetu w Toronto. Dzisiaj zaprezentuję procedurę dwuhybrydowego systemu membranowego, czyli systemu M2H, którego używamy w naszym laboratorium do badania oddziaływań białek błon integralnych. Zacznijmy zatem.

Przed przeprowadzeniem analizy MYTH należy zweryfikować, czy białko przynęty posiada swój koniec N i/lub C w cytosolu komórki. Znacznik CUB Lex A VP 16 musi być połączony z białkiem na tym końcu. Ponieważ enzymy odubikwitynujące, niezbędne do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego, znajdują się w cytosolu, w przypadku nieznanej topologii białka przynęty można stworzyć konstrukty znaczone na obu końcach (N i C) i, korzystając z opisanego poniżej testu kontrolnego N-U-B-G-I, sprawdzić, czy którykolwiek z nich nadaje się do zastosowania w MYTH, co wskaże, który konkretny koniec znajduje się w cytosolu.

Następnie należy zdecydować, który z dwóch głównych wariantów techniki myth jest odpowiedni dla danego eksperymentu. W przypadku natywnych białek drożdżowych metodą z wyboru jest zintegrowany myth lub immy. W systemie immy białka są endogennie znakowane tagiem CUB Lex a VP 16, co pozwala na pozostawienie ich pod kontrolą natywnego promotora.

Jest to korzystne, ponieważ poziom ekspresji typu dzikiego dla Bates pomaga wyeliminować problemy związane z nadekspresją białek, takie jak zwiększona liczba wyników fałszywie dodatnich dla nienatywnych białek drożdżowych; można zastosować tradycyjny system myth lub T myth, w którym przynęta z tagiem CU B Lex A V VP 16 jest nadeksponowana ektopowo z plazmidu. W niniejszym protokole skupimy się na T myth, ponieważ ta forma systemu myth znajduje szersze zastosowanie; z wyjątkiem początkowej konstrukcji przynęty oraz stosowanych pożywek, obie formy systemu myth są przeprowadzane w zasadniczo identyczny sposób. Przynęta musi zostać sklonowana do odpowiedniego wektora w celu tagowania i ekspresji.

Obecnie dostępnych jest wiele wektorów T myth, takich jak BV cztery, p, a, BV cztery oraz PCM BV cztery, które umożliwiają konstrukcję białek z tagami C-końcowymi Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 pod kontrolą odpowiednio bardzo silnego promotora TF jeden, silnego A DH jeden oraz słabego CYC jeden. Po wybraniu efektora zespołu należy przeprowadzić trawienie restrykcyjne plazmidu w odpowiednim miejscu restrykcyjnym. Cięcie powinno nastąpić wyłącznie w bezpośrednim sąsiedztwie tagu CU B Lxe VP 16 – powyżej tagu w przypadku tagowania C-końcowego lub poniżej w przypadku tagowania N-końcowego.

Na przykład przy użyciu wektora PAM BV idealnym wyborem jest SFI one; po trawieniu plazmidu i przechowywaniu go w temperaturze -20 °C do momentu użycia, kolejnym krokiem jest zaprojektowanie starterów do amplifikacji i klonowania genu docelowego. Koniec 5' startera bezpośredniego musi odpowiadać około 35 do 40 nukleotydom powyżej miejsca restrykcyjnego. Natomiast koniec 3' musi odpowiadać pierwszym 18 do 20 nukleotydom genu docelowego, którym jest DRB two kodujący receptor beta dwa i generyczny.

W naszym przykładzie koniec 5' prawego primeru musi odpowiadać odwrotnej komplementarności około 35 do 40 nukleotydów w kierunku 3' od miejsca restrykcyjnego. Koniec 3' musi odpowiadać odwrotnej komplementarności ostatnich 18 do 20 nukleotydów genu docelowego, pomijając kodon stop, jeśli znacznik CUB Lex VP 16 jest umieszczany na koniec C-terminalny, tak jak w przedstawionym przykładzie. W zależności od tego, czy wykonywane jest znakowanie N-terminalne czy C-terminalne, należy upewnić się, że wybrane 35 do 40 nukleotydów sekwencji plazmidu użytych w primerze prawym lub lewym skutkuje sklonowaniem genu docelowego w jednej ramce odczytu ze znacznikiem CUB Lex VP 16. W naszym przykładzie znakowany będzie koniec C-terminalny białka A DRB 2.

Wybrano 35 zasad sekwencji A MBV w primerze odwrotnym w taki sposób, aby sekwencje genów A DRB two oraz CUB znajdowały się w tej samej ramce odczytu; następnie należy przeprowadzić amplifikację genu docelowego metodą PCR przy użyciu wybranych primerów. Parametry PCR będą zależeć od konkretnego enzymu i specyficznych primerów, aby zapewnić warunki umożliwiające zajście homologicznej rekombinacji z naprawą luki (gap repair). Wcześniej potrawiony plazmid oraz amplifikowany gen docelowy są transformowane do odpowiedniego szczepu drożdży zgodnie ze standardowym protokołem transformacji drożdży, takim jak opisany przez Geets i Woodsa.

Po tym, jak zmodyfikowane drożdże urosną na płytce, należy wybrać pojedynczą kolonię szczepu i zaszczepić ją w pięciu mililitrach pożywki SD minus leucyna. Pożywki płynne inkubuje się w temperaturze 30 °C przez noc, aż kultura urośnie i osiągnie fazę nasycenia. Komórki należy odwirować przy 700 ×g przez pięć minut, usunąć nadsącz i wyizolować plazmidowy DNA przynęty z osadu komórkowego, korzystając z dowolnego komercyjnego zestawu do mini-prep.

Należy postępować zgodnie ze standardowym protokołem, wprowadzając jedną modyfikację w celu zapewnienia wystarczającej lizy komórek drożdży: do osadu po wstępnym resuspensowaniu należy dodać szklane kuleczki z wapna sodowanego o stężeniu 0,5 mM, a następnie intensywnie mieszać w wirówce typu vortex przez pięć minut. Następnie należy kontynuować zgodnie z komercyjnym protokołem. Wyizolowane DNA drożdży należy wprowadzić do chemicznie kompetentnego szczepu E. coli nadającego się do propagacji plazmidów, przy wydajności transformacji wynoszącej co najmniej 1 × 10⁷ komórek na µg DNA.

Po wyizolowaniu plazmidowego DNA z transformowanych bakterii e coli, należy zweryfikować poprawność konstrukcji plazmidu przynęci poprzez sekwencjonowanie przed jego użyciem; szczepy z przynętą muszą zostać poddane analizie w celu upewnienia się, że białka przynęci są prawidłowo zlokalizowane w błonie drożdżowej. Lokalizację określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Włączenie cząsteczki YFP do sekwencji tagu przynęty umożliwia bezpośrednią wizualizację żywych komórek i jest powszechnie stosowane w imy.

Alternatywnie, po ustaleniu prawidłowej lokalizacji przynęty, można zastosować standardową metodę immunofluorescencji z użyciem przeciwciał przeciwko komponentom Lex A lub VP 16 znacznika. Należy upewnić się, że przynęta nie wykazuje samoopacowania, tzn. nie aktywuje systemu reporterowego samodzielnie lub w obecności nieoddziałującej przynęty. Aby potwierdzić brak samoopacowania przynęty, stosujemy test N-U-B-G-I. W teście tym.

Przynęta zostaje poddana transformacji za pomocą oddziałujących pozytywnych oraz nieoddziałujących negatywnych kontrolnych ofiar, a następnie różne rozcieńczenia każdego transformanta nanosi się na odpowiednie podłoża selekcyjne. Przynęta musi rosnąć na podłożu selekcyjnym w obecności kontroli pozytywnej i nie rosnąć w obecności kontroli negatywnej, aby nadawać się do użytku w systemie drożdżowym dwuhybrydowym. Po walidacji przynęty, szczep reporterowy do systemu drożdżowego dwuhybrydowego zawierający przynętę może zostać poddany transformacji interesującą biblioteką ofiar w celu przesiewania interakcji białko-białko.

Aby rozpocząć tę wielkoskalową transformację drożdży, należy zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu reporterowego zawierającego białko przynętę w 5 mL podłoża SD bez leucyny i inkubować przez noc w temperaturze 30°C z wytrząsaniem. Kulturę nocną należy rozcieńczyć w 200 mL podłoża SD bez leucyny i inkubować w temperaturze 30°C z wytrząsaniem do momentu osiągnięcia OD 600 na poziomie 0,6–0,7. Po osiągnięciu docelowej wartości OD 600 należy podzielić 200 mL kultury pomiędzy cztery 50 mL probówki wirówkowe z nakrętką i zebrać komórki poprzez wirowanie.

Po przemyciu osadów sterylną wodą dwukrotnie destylowaną oraz roztworem trasy DTA octanu litu, każdy osad zawiesza się w 600 µL roztworu trasy DTA octanu litu w czterech 15 ml zakręcanych probówkach wirówkowych. Do 600 µL zawiesiny komórek dodaje się 2,5 ml roztworu PEG z octanem litu, 100 µL roztworu DNA z nasienia łososia oraz 7 µg DNA biblioteki prey. Probówki miesza się przez jedną minutę, aby zapewnić dokładne wymieszanie, a następnie inkubuje w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 45 minut.

Krótko mieszaj co 15 minut po 45 minutowej inkubacji. Do każdej probówki dodaj 160 µL dimetylosulfoksyd lub DMSO i natychmiast wymieszaj, odwracając probówki. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 minut.

Po zakończeniu szoku termicznego zebrać komórki poprzez wirowanie i resuspender. Każdy z osadów zawiesić w trzech mililitrach 2X-Y-P-A-D. Przenieść wszystkie próbki do jednej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów z nakrętką.

Inkubuj komórki w temperaturze 30 °C przez 90 minut w celu ich regeneracji. Odwiruj komórki i resuspenduj osad komórkowy w 4,9 ml sterylnego 0,9% chlorku sodu, wykorzystując 100 µl resuspendowanych komórek. Przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w sterylnym 0,9% chlorku sodu w zakresie od 10x do 10 000x; wysiej 100 µl rozcieńczeń 100x i 1000x na podłoża selekcyjne i inkubuj w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.

Płytki te służą jako kontrola i są wykorzystywane do analogicznego obliczenia wydajności transformacji. Pozostałe 4,8 ml resuspensowanych komórek rozdzielić na duże płytki 150 mm i inkubować w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni. Po wyroście kolonii, pojedyncze kolonie reprezentujące komórki zawierające potencjalną parę oddziałującą przynęta-ofiara resuspensować w 100 µl 0,9% chlorku sodu i wysiać alikwoty 5 µl na pożywkę selektywną zawierającą XG; inkubować przez dwa do czterech dni.

Do dalszych analiz wybierane są kolonie wykazujące silny wzrost i niebieski kolor. Po wyizolowaniu i zsekwencjonowaniu plazmidów z pozytywnych kolonii drożdży, należy zebrać i przeanalizować wszystkie dane z sekwencjonowania, aby sporządzić wstępną listę interaktorów. W celu ponownej weryfikacji tych oddziaływań stosuje się test zależności od przynęty.

W tym teście wszystkie plazmidy prey wykazujące zidentyfikowane interakcje są transformowane z powrotem do oryginalnego szczepu bait, a także do szczepu zawierającego kontrolną sztuczną przynętę (artificial bait), składającą się z pojedynczej domeny transbłonowej połączonej z CUB Lex i tagiem VP 16. Pojedyncze kolonie z tych transformacji resuspender się w 100 µl sterylnej wody dwukrotnie destylowanej, a następnie nanosi się objętości 5 µl na odpowiednie podłoża selekcyjne z dodatkiem X sc. W idealnym przypadku dla każdej przynęty (prey) należy wybrać wiele transformantów, a zarówno oryginalną przynętę (bait), jak i sztuczną przynętę, należy nanieść na tę samą płytkę. Płytki inkubuje się od dwóch do czterech dni w temperaturze 30 °C. Drożdże zawierające sztuczną przynętę, w których prey powodują aktywację systemu reporterowego, są uznawane za nieswoiste (promiscuous), a taka konkretna przynęta (prey) jest usuwana z listy interaktorów.

Obserwuj wzrost i niebieskie zabarwienie drożdży z przynętą (bait), która jest przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym braku wzrostu dla przynęty sztucznej. Potwierdza to specyficzną interakcję. Jeśli jednak drożdże zawierające ofiarę (prey) oraz badaną przynętę nie wykazują wzrostu.

Tę ofiarę usuwa się z listy interaktorów. Pozostałe ofiary stanowią pełną listę interaktorów zidentyfikowanych w badaniu przesiewowym. Po zakończeniu procedury przesiewowej uzyskasz mapę interakcji.

Reprezentuje to zbiór potencjalnych oddziaływań, które badacz musi następnie poddać dalszej analizie w ramach specyficznych badań określonych indywidualnie dla każdego przypadku. Aby ocenić znaczenie biologiczne każdego z nich, pokazaliśmy właśnie, jak przeprowadzić procedurę dwuhybrydową w błonie (membrane E two hybrid) lub procedurę myth w celu zidentyfikowania partnerów oddziałujących z białkiem docelowym. Podczas przeprowadzania procedury myth ważne jest zweryfikowanie, czy koniec N- lub C-białka docelowego znajduje się w cytosolu komórki, a następnie odpowiednie zaprojektowanie strategii znakowania.

Dodatkowo należy starannie ocenić, czy szczepy przynęty prawidłowo wykazują ekspresję przynęty oraz czy jest ona odpowiednio zlokalizowana. Ponadto istotne jest przeprowadzenie testu kontrolnego NUB GI, ponieważ jest on pomocny w ustalaniu warunków przesiewowych. Na koniec należy niezależnie zweryfikować wszystkie interakcje wykryte za pomocą metody myth.

Postępowanie zgodnie z tymi prostymi krokami powinno zapewnić uzyskanie jak najlepszych wyników z procedury mitycznej. To już wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w eksperymentach.