System dwuhybrydowy (MYTH) oparty na błonie drożdży opartych na podzielonej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji interakcji białko-białko

System mitów opiera się na koncepcji rozszczepionej ubikwityny, która odnosi się do zdolności ubikwityny do stabilnego rozdzielania na końcowe końcowe i końcowe połówki CUB UBI i C, zdolne do rekonstytucji w cząsteczkę pseudo ubikwityny o pełnej długości. Podczas gdy ta rekonstytucja jest spontaniczna w przypadku stosowania mutacji ISIN 13 do glicyny typu dzikiego, wytworzenie fragmentu o nazwie NUBG znacznie zmniejsza jego powinowactwo do CUV, blokując w ten sposób tworzenie ubikwityny pseu. Jeśli NUBG i CUB zostaną połączone odpowiednio z białkiem A i białkiem B, a A i B są zdolne do interakcji, wówczas cząsteczka ubikwityny pseu może ponownie powstać.

W micie przynęty z integralną membraną są połączone do ataku, składające się z fragmentu CUB połączonego ze sztucznym czynnikiem transkrypcyjnym. Podczas gdy pochwały są łączone z fragmentem NUBG, interakcja między przynętą a zdobyczą prowadzi do rekonstytucji pseudo ubikwityny, która z kolei może być rozpoznana przez cytozolowe enzymy de ubikwitynowane zilustrowane jako nożyczki. Enzymy te rozszczepiają się po końcu C CUB, uwalniając czynnik transkrypcyjny, który może następnie dostać się do jądra i systemu reporterowego aktywatora, umożliwiając selektywną izolację i identyfikację komórek, w których zachodzą interakcje z ofiarą BA.

Cześć, nazywam się Janie Snyder i pracuję w Igor STAARs Lab na wydziale genetyki molekularnej i biochemii na Uniwersytecie w Toronto. Dzisiaj pokażę wam procedurę stosowania dwóch hybryd lub mitów błonowych, a my używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania interakcji integralnych białek błonowych. Więc zacznijmy.

Przed przeprowadzeniem analizy mitów sprawdź, czy białko przynęty ma swój koniec N i/lub C w cytozolu komórki. Znacznik CUB Lex A VP 16 musi być połączony z białkiem na takim końcu. Ponieważ biokwitynowane enzymy niezbędne do uwalniania czynnika transkrypcyjnego znajdują się w cytozolu, jeśli topologia białka przynęty nie jest znana, możesz wygenerować konstrukty oznaczone zarówno na końcu NNC, jak i za pomocą testu kontrolnego N-U-B-G-I opisz wkrótce, sprawdź, czy któryś z nich nadaje się do użycia w micie, wskazując w ten sposób, że konkretny koniec jest cytozolowy.

Następnie zdecyduj, który z dwóch głównych wariantów mitu jest odpowiedni dla Twojego eksperymentu. W przypadku rodzimych białek drożdży metodą z wyboru jest zintegrowany mit lub immy. W Imy Bates są endogennie oznaczone znacznikiem CUB Lex a VP 16, pozostawiając je pod kontrolą ich rodzimego promotora.

Jest to korzystne, ponieważ poziom ekspresji typu dzikiego Batesa pomaga wyeliminować problemy związane z nadekspresją białka, takie jak zwiększona liczba wyników fałszywie dodatnich dla nierodzimych białek drożdży, można zastosować tradycyjny mit lub mit T, w którym przynęta znacznika CU B Lex A V VP 16 jest nadmiernie eksprymowana miejscowo ECT z plazmidu. W tym protokole skupimy się na micie T, ponieważ ta forma mitu ma szersze zastosowanie, z wyjątkiem początkowej konstrukcji przynęty i użytych mediów, obie formy mitu są realizowane w zasadniczo identyczny sposób. Przynęta musi zostać sklonowana do odpowiedniego wektora do tagowania i wyrażania.

Obecnie dostępne są różne wektory mitu T, takie jak BV cztery, p, a, BV cztery i PCM BV cztery, które pozwalają na budowę c terminalnie oznaczonych Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 pod kontrolą bardzo silnego TF jednego silnego A DH i słabego jednego promotora. Po wybraniu efektora zespołowego, restrykcja trawi plazmid w odpowiednim miejscu restrykcyjnym. Rozszczepienie powinno następować tylko w bezpośrednim sąsiedztwie znacznika CU B Lxe VP 16 przed znacznikiem w przypadku znakowania terminala C lub za znacznikiem w przypadku znakowania terminala N.

Na przykład, przy użyciu wektora PAM BV, SFI One jest idealnym wyborem, po strawieniu plazmidu przechowywanym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu gotowości do użycia, następnym krokiem jest zaprojektowanie starterów do amplifikacji i klonowania interesującego genu. Pięć głównych końców startera przedniego musi pasować do około 35 do 40 nukleotydów przed miejscem ograniczenia. Podczas gdy trzy główne końce muszą pasować do pierwszych 18 do 20 nukleotydów docelowego genu, który jest DRB dwa kodującym receptor beta dwa i generyczny.

W naszym przykładzie pięć głównych końców startera odwrotnego musi pasować do odwrotnego dopełniacza około 35 do 40 nukleotydów za miejscem restrykcji. Z trzema pierwszymi końcami pasującymi do odwrotnego dopełnienia ostatnich 18 do 20 nukleotydów docelowego genu, pomijając kod zatrzymania, jeśli znacznik CUB Lex powiedzmy, że VP 16 jest umieszczany na końcu C, jak to się robi w pokazanym przykładzie, w zależności od tego, czy wykonywane jest znakowanie końcówek N czy C, upewnij się, że wybrane 35 do 40 nukleotydów sekwencji plazmidowej użytej w starterze do przodu lub do tyłu powoduje klonowanie genu docelowego w ramce z CU B Lex, znacznikiem VP 16. Ponieważ w naszym przykładzie koniec C białka A DRB dwa zostanie oznaczony.

35 podstaw sekwencji A MBV w odwróconym starterze został wybrany w taki sposób, że sekwencje genu A DRB dwa i CUB leżą w tej samej ramce odczytu, amplifikują interesujący gen przez PCR przy użyciu wybranych starterów. Parametry PCR będą zależeć od konkretnego enzymu i specyficznych starterów użytych w celu zapewnienia środowiska, w którym może wystąpić rekombinacja homologiczna naprawy luki. Wcześniej strawiony plazmid i amplifikowany gen będący przedmiotem zainteresowania są przekształcane w odpowiedni szczep drożdży przy użyciu standardowego protokołu transformacji drożdży, takiego jak ten opisany przez Geetsa i Woodsa.

Gdy przekształcone drożdże wyrosną na płytce, wybierz pojedynczą kolonię szczepu i zaszczep ją w pięciu mililitrach SD minus leucyna. Płynne podłoża rosną w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc po tym, jak kultura wyrośnie przez noc i osiągnie nasycenie. Odwirować komórki w temperaturze 700 GS na pięć minut i usunąć supernatant izolować DNA z osocza przynęty z osadu komórkowego za pomocą dowolnego dostępnego w handlu mini zestawu przygotowawczego.

Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem z jedną modyfikacją w celu zapewnienia wystarczającej lizy komórek drożdży w małej objętości 0,5 milimolowych kulek ze szkła sodowo-wapniowego do osadu po wstępnym zawieszeniu resus i energicznie wiruj przez pięć minut. Następnie postępuj zgodnie z protokołem komercyjnym w normalny sposób. Przekształć wyizolowane DNA drożdży w chemicznie kompetentny szczep E. coli odpowiedni do rozmnażania plazmidu o wydajności przemiany co najmniej jeden razy 10 do siódmej komórki na mikrogram DNA.

Po pobraniu DNA osocza z przekształconej E. coli, należy sprawdzić prawidłową budowę plazmidu przynęty poprzez sekwencjonowanie przed użyciem Szczepy przynęty muszą zostać przeanalizowane, aby upewnić się, że białka przynęty są prawidłowo zlokalizowane w błonie drożdży. Lokalizację określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Włączenie cząsteczki YFP do sekwencji znacznika przynęty pozwoli na bezpośrednią wizualizację żywych komórek i jest powszechnie stosowane w imy.

Alternatywnie, standardowe podejście immunofluorescencyjne z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko składnikom Lex A lub VP 16 znacznika może być stosowane po ustaleniu prawidłowej lokalizacji przynęty. Konieczne jest upewnienie się, że przynęta nie aktywuje się samoczynnie IE, nie aktywuje systemu reportera samodzielnie lub w obecności nieinteraktywnych pochwał, aby upewnić się, że przynęta nie aktywuje się samoczynnie, stosujemy test N-U-B-G-I. W tym teście.

Przynęta jest przekształcana z oddziałującymi pozytywnymi i nieoddziałującymi pochwałami kontroli negatywnej, a następnie różne rozcieńczenia każdego transformantu są wykrywane na odpowiednich pożywkach selektywnych. Abate musi rosnąć na pożywkach selektywnych w obecności kontroli dodatniej i nie rośnie w obecności kontroli ujemnej, aby nadawać się do wykorzystania w micie. Po walidacji przynęty, szczep reportera mitu zawierający przynętę może zostać przekształcony za pomocą biblioteki ofiar w celu zbadania interakcji białek białkowych.

Aby rozpocząć tę transformację drożdży na dużą skalę, zaszczepij pojedynczą kolonię szczepu reporterskiego myth zawierającego twoją przynętę w pięciu mililitrach pożywki SD minus leucyna i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Rozcieńczyć kulturę przez noc w 200 mililitrach SD minus pożywka leucynowa i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wstrząsaniem, aż osiągnie OD 600 od 0,6 do 0,7. Po osiągnięciu docelowego OD 600 podziel 200-mililitrową kulturę między cztery 50-mililitrowe probówki wirówkowe z nakrętką śrubową i zbierz komórki przez wirowanie.

Po umyciu granulek sterylną podwójnie destylowaną wodą i roztworem octanu litu trissy DTA, zawieszamy każdą osadkę w 600 mikrolitrach roztworu octanu litu trissy DTA do każdej z czterech 15-mililitrowych probówek wirówek śrubowych. Dodaj 2,5 mililitra roztworu octanu litu PEG, dwa 600 mikrolitrów zawieszonych komórek, 100 mikrolitrów roztworu DNA plemników łososia i siedem mikrogramów DNA z biblioteki zdobyczy cztery. Wyślij SMS do probówek przez jedną minutę, aby zapewnić dokładne wymieszanie, a następnie inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 45 minut.

Mieszać krótko co 15 minut po 45-minutowej inkubacji. Dodaj 160 mikrolitrów dimetylosulfotlenku lub DMSO do każdej probówki i natychmiast wymieszaj, odwracając probówki. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Po zakończeniu szoku cieplnego zbierz komórki przez odwirowanie i reus. Zawieś każdy z granulek w trzech mililitrach dwóch X-Y-P-A-D. Zebrać wszystkie próbki razem w jednej probówce wirówkowej z zakrętką o pojemności 50 mililitrów.

Inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut w celu odzyskania komórek. Odwirować komórki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4,9 mililitra sterylnego 0,9% chlorku sodu przy użyciu 100 mikrolitrów zawieszonych komórek. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie w sterylnym 0,9% chlorku sodu w zakresie od 10 x do 10 000 x płytka, 100 mikrolitrów 100 x i 1000 x rozcieńczenia na selektywnych pożywkach i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Płytki te służą jako kontrola i służą do równomiernego obliczania wydajności transformacji. Podziel pozostałe 4,8 mililitra zawieszonych komórek i płytkę na dużych 150-milimetrowych płytkach i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Gdy kolonie wyrosną, resus zawiesza pojedyncze kolonie, z których każda reprezentuje komórki zawierające potencjalną interakcję pary ofiar przynęty w 100 mikrolitrach 0,9% chlorku sodu i umieszcza pięć mikrolitrów podwielokrotności w selektywnych pożywkach zawierających XG, aby mogły rosnąć tylko przez dwa do czterech dni.

Do dalszej analizy wybierane są kolonie, które wykazują silny wzrost i niebieski kolor. Po wyizolowaniu i zsekwencjonowaniu plazmidów z dodatnich kolonii drożdży, skompiluj i przeanalizuj wszystkie dane sekwencjonowania, aby stworzyć wstępną listę interaktorów. Aby ponownie sprawdzić te interakcje, stosuje się test zależności od przynęty.

W tym teście wszystkie plazmy ofiar wyrażające zidentyfikowane interakcje są przekształcane z powrotem w oryginalny szczep przynęty, a także szczep zawierający kontrolną sztuczną przynętę składającą się z pojedynczej domeny transbłonowej połączonej z CUB Lex, znacznikiem VP 16 ponownie zawiesić pojedyncze kolonie z tych przemian w 100 mikrolitrach sterylnej podwójnie destylowanej wody i umieścić pięć mikrolitrów pod odpowiednią selektywną pożywką plus X sc. Idealnie, Dla każdej ofiary należy wybrać wiele transformantów, a zarówno oryginalną przynętę, jak i sztuczną przynętę należy dostrzec na tej samej płycie. Inkubuj płytki przez dwa do czterech dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, drożdże przenoszące sztuczną przynętę w zdobyczy, które powodują aktywację systemu reporterowego, są uważane za rozwiązłe, a konkretna ofiara jest usuwana z listy interaktorów.

Pochwała, która powoduje wzrost i niebieskie zabarwienie drożdży za pomocą interesującej przynęty, ale nie sztucznej przynęty. Potwierdź konkretną interakcję. Jeśli jednak drożdże będące schronieniem dla zdobyczy i przynęty nie rosną.

Ta ofiara jest usuwana z listy interaktorów. Pozostałe pochwały stanowią pełną listę interaktorów zidentyfikowanych na ekranie mitu. Po zakończeniu procedury mitu otrzymasz mapę domu interakcji.

Jest to zbiór interakcji z kandydatami, które badacz musi dalej analizować za pomocą konkretnych badań określanych indywidualnie dla każdego przypadku. Aby ocenić biologiczne znaczenie każdego z nich, właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić procedurę hybrydową lub mityczną błony E two w celu zidentyfikowania oddziałujących partnerów białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przeprowadzając procedurę mitu, ważne jest, aby sprawdzić, czy interesujący Cię obiekt ma swój koniec i/lub koniec C znajdujący się w cito komórki i odpowiednio zaprojektować strategię tagowania.

Ponadto ważne jest, aby dokładnie ocenić, czy szczepy przynęty prawidłowo wyrażają przynętę i czy przynęta jest prawidłowo zlokalizowana. Ponadto ważne jest, aby wykonać test NUB GI Control, ponieważ jest on przydatny w ustaleniu warunków przesiewowych. Na koniec pamiętaj, aby niezależnie zweryfikować wszystkie interakcje, które wykryjesz za pomocą mitu.

Wykonanie tych prostych kroków powinno zapewnić uzyskanie najlepszych możliwych wyników procedury mitu. Cóż, to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.