Steigende cDNA Erträge aus Einzel-Zell-Mengen von mRNA in Standard Laboratory Reverse-Transkriptase-Reaktionen mit Acoustic Microstreaming

Summary

Wir beschreiben ein neuartiges Verfahren zur Erhöhung der cDNA-Ausbeute von Single-Cell-Mengen von mRNA in sonst üblichen Labor reverse Transkription Reaktionen. Die Neuheit besteht in der Verwendung von einem Mikromischer, die das Phänomen der akustischen Microstreaming nutzt, um Flüssigkeiten bei Mikroliter Skalen effektiver Mix als Schütteln, Vortexen oder Verreibung.

Abstract

Die Korrelation der Genexpression mit Zellverhalten ist ideal an den Single-Cell-Ebene getan. Dies ist jedoch nicht leicht zu erreichen, weil die geringe Menge an labile mRNA in einer einzigen Zelle (1-5% der 1-50pg Gesamt-RNA oder 0,01-2.5pg mRNA, pro Zelle ¹⁾ meist abbaut, bevor sie transkribiert werden rückgängig machen kann in eine stabile cDNA-Kopie. Zum Beispiel unter Verwendung von Standard-Labor Reagenzien und Hardware können nur eine kleine Anzahl von Genen qualitativ pro Zelle ² bewertet. Eine Möglichkeit, die Effizienz der Standard-Labor-Reverse-Transkriptase (RT)-Reaktionen (zB Standard-Reagenzien in mikrolitergroßen) mit Single-Cell-Mengen von mRNA zu erhöhen wäre, schneller zu mischen Reagenzien, so dass die mRNA in cDNA umgewandelt werden können, bevor es abgebaut wird. Dies ist jedoch nicht trivial, weil bei Mikroliter Flüssigkeit Skalen Strömung laminar, dh derzeit verfügbaren Methoden der Durchmischung (dh Zittern, Vortexen und Verreibung) nicht genügend chaotische Bewegung effektiv Reagenzien zu produzieren. Um dieses Problem zu lösen, haben Mikro-Maßstab Mischtechniken verwendet ^3,4 sein. Eine Reihe von mikrofluidischen-basierte Misch-Technologien entwickelt worden, die erfolgreich erhöhen RT Reaktionsausbeuten ^5-8. Allerdings erfordern Mikrofluidik-Technologien spezialisierte Hardware, die relativ teuer und noch nicht allgemein verfügbar ist. Eine billigere, bequemere Lösung ist wünschenswert. Das Hauptziel dieser Studie ist es zu demonstrieren, wie Einsatz eines neuartigen "Mikrovermischung" Technik, um Standard-Labor-RT-Reaktionen mit Single-Cell-Mengen von mRNA signifikant erhöht ihre cDNA ergibt. Wir finden cDNA Erträge um etwa 10 bis 100-fache, die ermöglicht zu erhöhen: (1) eine größere Anzahl von Genen pro Zelle analysiert werden, (2) mehr quantitative Analyse der Genexpression, und (3) eine bessere Erkennung von Low-Fülle Gene in einzelnen Zellen. Die Mikrovermischung auf akustische Microstreaming ^9-12, ein Phänomen, wo die Schallwellen ausbreiten um ein kleines Hindernis zu schaffen eine mittlere Strömung in der Nähe des Hindernisses auf. Wir haben eine akustische Microstreaming-basierten Gerät ("Mikromischer") mit einer Schlüssellänge Vereinfachung entwickelt, akustische Microstreaming kann bei Audio-Frequenzen, indem sichergestellt wird das System über einen Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle mit einem kleinen Krümmungsradius ¹³ erreicht werden. Der Meniskus einer Mikroliter Volumen der Lösung in einer Röhre bietet eine entsprechend kleinen Krümmungsradius. Die Verwendung von Audio-Frequenzen bedeutet, dass die Hardware kann kostengünstig und vielseitig ¹³ und Nukleinsäuren und anderen biochemischen Reagenzien dürfen nicht beschädigt sein, wie sie mit Standard-Labor sonicators werden kann.

Protocol

1. Mikrovermischung RT Reaction

1. Vor der Durchführung einer RT-Reaktion mit Mikrovermischung, bringen die Mikromischer auf die gewünschte Temperatur der RT-Reaktion.
   1. Legen Sie die Mikromischer in einem 37 ° C (oder die Temperatur durch die RT Lieferant empfohlen) Inkubator für mindestens 1 Stunde vor Beginn der RT-Reaktion.
2. Richten Sie die RT-Mix nach dem Reverse-Transkriptase-Lieferanten (zB MMTV-RT von Promega, Omniscript von Qiagen) Anweisungen, außer Nutzung Single-Cell-Mengen-Eingang Gesamt-RNA (z. B. 0.1-1pg/μl), anstelle der ng-pg Beträge, die Lieferanten zu empfehlen.
   1. Wir verwenden Standard-sterile, Nuklease-freies 200 ul dünnwandigen PCR-Gefäße.
3. Position RT Rohre sicher in den Mikromischer, sobald sie bereit sind für das Mischen sind. Die Mikromischer sollte innerhalb der 37 ° C Inkubator für die Dauer der RT-Reaktion bleiben.
4. Wählen Sie die gewünschte Frequenz und Amplitude Mikrovermischung. In diesem Beispiel verwenden wir 150Hz.
5. Schalten Sie den Mikromischer auf und lassen Sie es für die gesamte Dauer der RT-Reaktion (60 Minuten).
6. Schalten Sie den Mikromischer aus und nehmen Sie die RT Rohre aus, wenn die RT-Reaktion abgeschlossen ist.
7. Legen Sie die RT Röhrchen auf Eis, und fahren wie gewohnt mit weiteren Anwendungen wie quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR oder real-time PCR).

2. Repräsentative Ergebnisse:

Der Vorteil der Mikrovermischung im Rahmen der RT-Reaktionen ist eine Erhöhung der cDNA Ausbeute bezogen auf, wenn andere Mischverfahren (zB Zittern, Vortexen oder Verreibung) verwendet werden. Dies zeigt sich zum Beispiel bei der anschließenden Analyse der cDNA mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR oder real-time PCR) werden. Abbildung 2A zeigt die Auswirkungen der Mikrovermischung für die ersten 5 Minuten (blau, "micromixed5") oder den gesamten 60 Minuten (rot, "micromixed60"), verglichen mit Verreibung der RT-Reaktion unmittelbar vor der RT Inkubation (schwarz, "Verreiben" ). In diesem Fall wird die Lautstärke des vorangegangenen RT-Reaktion wurde 25 &mgr; l, und es enthielt 2.5pg von Gesamt-RNA. qPCR Spuren unter Verwendung der Primer entwickelt, um cDNA repräsentiert Nurr-1 mRNA erkennen sind oben gezeigt, und die Mittelwerte ± SEM der Anzahl der Zyklen bis 50% maximale Fluoreszenz in 3 Wiederholungen desselben Experiments zu erreichen sind nachfolgend dargestellt. Das Sternchen bedeutet einen statistisch signifikanten Unterschied (one-way ANOVA mit Tukey multiple Vergleiche). Beachten Sie, dass Mikrovermischung für die ersten 5 Minuten des vorangegangenen RT-Reaktion eine nicht-signifikante Verbesserung gegenüber Verreibung hergestellt, während Mikrovermischung für den gesamten 60 Minuten der vorhergehenden RT-Reaktion zu einer signifikanten Verbesserung gegenüber Verreibung, deren Größe entsprach etwa 15 qPCR Zyklen im Durchschnitt.

Der Vorteil der Mikrovermischung kann auch in Schmelzkurvenanalyse der nachfolgenden qPCR erhaltenen Produkte gesehen werden. In dem Experiment in Abbildung 2B dargestellt, Mikrovermischung für den gesamten 60 Minuten der vorhergehenden RT-Reaktion führte zu einer konsequenten qPCR-Signal in zwei Proben (Abbildung 2Ba, 2 rote Spuren), während Mikrovermischung für die ersten 5 Minuten oder Verreibung nur produziert inkonsistent qPCR Spuren (Abbildung 2Ba, 2 blaue Spuren und 2 schwarzen Spuren, jeweils). Der graue Spuren sind negative Kontrollen ("neg."), In der cDNA aus der qPCR-Reaktion wurde nach links. Wenn die qPCR Produkten aus diesem Experiment wurden denaturiert durch Rampen ihre Temperatur (dh Schmelzkurvenanalyse) war es offensichtlich, dass geeignete PCR-Produkte (dh ein Amplikon derjenigen identisch ist, erhält man, wenn viel höhere Konzentrationen des mRNA revers transkribiert wurden und durch qPCR amplifiziert wurde, Daten nicht gezeigt) waren nur folgende RT Reaktionen, die für 60 Minuten (Abbildung 2Bb, 2 rote Spuren) war micromixed. Alle anderen (dh micromixed5, Zerreiben und negative Kontrollen) generiert alternative Amplikon Produkte (zB Primer-Dimere).

Abbildung 1. Fließschema des Protokolls für die Anwendung Mikrovermischung Standard-Labor-RT-Reaktionen. Genauere Beschreibungen des physikalischen Prinzips beteiligt, die Mikromischer und wie eine in-house Mikromischer bauen in Verweise ^13,14 zur Verfügung gestellt

Abbildung 2. Representative qPCR-Daten, welche die Vorteile der Mikrovermischung zu vorangegangenen RT-Reaktionen mit Single-Cell-Mengen von mRNA in sonst üblichen Labor-RT-Reaktionen eingesetzt. Ein Beispiel qPCR Spuren erkennen cDNA repräsentiert mRNA codiert Nurr-1-Gen. Die vorstehenden RT Reaktionen enthielten 2.5pg von Gesamt-RNA in einem Volumen von 25 &mgr; l und wurden in einem Brutschrank bei 37 ° C für 60 Minuten durchgeführt. RT-Reaktionen wurden durch Verreiben der R gemischtT-Mix vor der Inkubation (schwarz Spuren ", Verreibung"), während der ersten 5 Minuten der RT-Reaktion (blau Spuren ", micromixed5") micromixed oder micromixed für den gesamten 60 Minuten der RT-Reaktion (rot Spuren ", micromixed60" ). Mittelwert ± SEM der Anzahl der qPCR-Zyklen erforderlich, um 50% maximale Fluoreszenz zu erreichen sind nachfolgend für n = 3 dargestellt Wiederholungen dieses Experiments. Asterisk zeigt einen signifikanten Unterschied (one-way ANOVA mit Tukey multiple Vergleiche). B Ein weiterer qPCR Experiment untersucht Nurr-1 cDNA-Produkt, diesmal nach RT-Reaktionen, die 25pg von Gesamt-RNA in einem Volumen von 25 &mgr; l. qPCR Spuren (a) sowie Schmelzkurvenanalyse der qPCR Produkten erhalten (b) sind für die verschiedenen Misch-Bedingungen gezeigt. Negative Kontrollen, in denen keine cDNA in den vorangegangenen RT-Reaktion enthalten war sind ebenfalls enthalten (graue Spuren ", neg."). RT-Reaktionen mit sehr viel höheren Konzentrationen von mRNA wurden ebenfalls durchgeführt und produziert Schmelzkurve Peaks (Daten nicht gezeigt) identisch mit denen in (b) für micromixed60 (rote Kurven) Proben.

Discussion

Die Methode der Anwendung von Mikrovermischung Standard-Labor-RT hier beschriebenen Reaktionen kann natürlich beinhalten mRNA geerntet über einen beliebigen Methode (zB Zell-Lyse-, Laser-Mikrodissektion). Es kann auch eine beliebige Marken oder Typen von RT-Reagenzien, bei jeder Temperatur (innerhalb der Toleranz von den Materialien der Mikromischer) und einen beliebigen Zeitraum. Zum Beispiel haben wir eine verbesserte cDNA Erträge aus RT-Reaktionen mit random Hexamer oder Oligo-dT-Primer beobachtet. Es könnte auch auf andere biochemische Veränderungen (zB DNA-Hybridisierung ¹⁵⁾ gemäß den folgenden Bedingungen angewendet werden. Das wichtigste Hindernis der aktuellen Technik ist die Reaktion muss innerhalb eines kleinen (Mikroliter) Tropfen Lösung, die eine gekrümmte Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche (zB Meniskus) Formen auftreten. Wir verwenden routinemäßig Volumina von 10 oder 25 &mgr; l in 200 ul dünnwandigen PCR-Gefäße, Herstellung Menisken mit Krümmungsradien von 4,7 oder 6,9 mm, bzw.. Dies ist eine allgemeine Voraussetzung für eine Wirbelströmung bis in den Tropfen, die die Schnittstelle zwischen verschiedenen Lösungen verlängert eingestellt werden und ermöglicht Diffusion erfolgen über kürzere Zeiträume zu nehmen. Diese Einschränkung gilt daher für alle Situationen, in denen Mikrovermischung verwendet werden könnten. Denn die Verwendung von kleinen Mengen kann ein Vorteil sein, weil oft die Menge der Input-Material (zB RNA, DNA) ist begrenzt, plus erhebliche Einsparungen auf anderen Reagenzien hergestellt werden. Im konkreten Zusammenhang mit der Verbesserung RT Reaktionsausbeuten, muss die Reaktion auch eine Begrenzung der Menge an mRNA. Wir haben gezeigt, dass Mikrovermischung Standard Labor RT-Reaktionen mit Single-Cell-Mengen von RNA-Eingang ihrer cDNA Ertragssteigerungen von rund 10 bis 100-fache gegenüber herkömmlichen Methoden der Durchmischung (Schütteln, Vortexen oder Verreibung), auch für anderer Gene als Nurr-1 dargestellt hier ^14. Wir haben auch gezeigt, diese Verbesserung verringert sich die Konzentration der RNA-Eingang erhöht ^14. Vermutlich ist dies, weil bei höheren RNA-Konzentrationen sorgt die erhöhte Diffusion in Abwesenheit des Mikrovermischung mehr mRNA zu cDNA umgewandelt wird, bevor es abgebaut wird.

Die Mikrovermischung Methode wird von High-Fidelity-Übertragung des akustischen Signals durch das Reaktionsgefäß, um die Reaktion Lösung profitieren. Wir halfen erreichen dies durch sorgfältige Bearbeitung der Misch-Löcher in die Acrylplatte über dem Lautsprecher (Abbildung 1), so dass sie verjüngt, um exakt auf die 200 ul dünnwandigen PCR-Gefäße verwendet wurden. Dies maximiert den Kontakt zwischen den Rohren und der Acrylplatte und somit maximiert Übertragung des akustischen Signals. Man muss auch sicherstellen, dass die Reaktionsrohre sicher sind innerhalb der Misch-Löcher gehalten, weil sie kommen kann beim Mischen als Folge der mechanischen Schwingungen.

Unsere Definition von akustischen Microstreaming ist möglicherweise weiter als einige phänomenologisch-basierten Definitionen. Es gibt jedoch eine gute Bewertung von Riley ^16, diese Ströme klassifiziert grundlegend, als phänomenologisch. Der nichtlineare Term in der Navier-Stokes-Gleichung muss groß genug sein, so dass am zweiten Ordnung gibt es eine mittlere Strömungsgeschwindigkeit. Da dieser Begriff ist eine Geschwindigkeit mal Geschwindigkeitsgradienten, alles, was wir tun, um die Längenskala, über die die Geschwindigkeit variiert hinreichend klein (dh machen die Geschwindigkeitsgradienten groß genug) machen kann zu einer Microstreaming flow zu geben. Unsere akustische Microstreaming-basierten Gerät ("Mikromischer") ermöglicht akustische Microstreaming bei Audio (dh low power) Frequenzen, indem sichergestellt wird das System über einen Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle mit einem kleinen Krümmungsradius ^13. Im Gegensatz dazu "acoustic streaming" wird oft durch eine nichtlineare Begriff, der groß gemacht wird von einer großen Geschwindigkeit (dh hohe Leistung) definiert. In unserem Fall ist ein kleiner Tropfen in einem gut zum Schwingen gebracht, die Oberflächenspannung des Tropfens, zusammen mit seiner Viskosität, eine Rolle bei der Schaffung einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit nützlich für das Mischen spielen ^13. Versuche haben auch gezeigt, dass große (10-100 um) Partikel in größeren schwingenden Tropfen, als wir verwenden können verschoben werden, aber dies ist wahrscheinlich durch einen anderen Mechanismus spezifisch für Partikel ^17.

Zusammenfassend ist die Anwendung von Mikrovermischung Standard-Labor-RT-Reaktionen mit Single-Cell-RNA-Mengen ein effektiver Weg, drastisch erhöhen ihre cDNA-Ausbeute. Diese Verbesserung ist über und über was erreicht werden kann mit den derzeit verfügbaren Methoden der Vermischung mikrolitergroßen (dh Zittern, Vortexen oder Verreibung) werden. Obwohl es viele Umstände, in denen der Mikrofluidik-basierten Geräten durchführen RT wäre ein großer Fortschritt sein, in anderen Fällen, einschließlich unserer eigenen, Mikrovermischung allein bietet erhebliche und angemessene profitieren, ohne die Notwendigkeit weiterer spezieller Ausrüstung und Methoden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008