Aumentar os rendimentos cDNA Single-cell quantidades de mRNA em Laboratório Padrão Reações transcriptase reversa usando Microstreaming Acústico

Summary

Descrevemos um novo método para aumentar a produtividade cDNA de uma única célula quantidades de mRNA em outra padrão de laboratório reações de transcrição reversa. A novidade reside na utilização de um micromisturador, que utiliza o fenômeno da microstreaming acústico, para misturar fluidos em escalas microlitro mais eficaz do que tremer, vórtex ou trituração.

Abstract

Expressão do gene correlacionar com o comportamento das células deve ser feito preferencialmente ao nível de uma única célula. No entanto, este não é facilmente alcançado porque a pequena quantidade de mRNA lábil presente em uma única célula (1-5% de 1-50pg RNA total, ou 0,01 2.5pg-mRNA, por célula ¹⁾ na maior parte degrada antes que possa ser transcrito reverso em uma cópia estável cDNA. Por exemplo, usando reagentes de laboratório padrão e hardware, apenas um pequeno número de genes podem ser avaliados qualitativamente por célula ^2. Uma maneira de aumentar a eficiência do padrão reverso laboratório transcriptase (RT) reações (reagentes ou seja padrão em volumes microlitro) compreendendo uma única célula quantidades de mRNA seria mais rapidamente misturar os reagentes de modo que o mRNA pode ser convertido em cDNA antes que ele se degrada. No entanto, este não é trivial, pois em escalas microlitro fluxo de líquido é laminar, isto é, métodos atualmente disponíveis de misturar (isto é, agitação, vórtex e trituração) deixar de produzir movimento caótico suficiente para efetivamente misturar reagentes. Para resolver este problema, micro-escala de técnicas de mixagem tem que ser usado ^3,4. Uma série de microfluídicos tecnologias baseadas em mistura, foram desenvolvidas com sucesso aumentar o rendimento de reação RT ^5-8. No entanto, as tecnologias de microfluídica requerem hardware especializado que é relativamente caro e ainda não amplamente disponível. Uma solução mais barata, mais conveniente é desejável. O objetivo principal deste estudo é demonstrar como a aplicação de uma nova técnica "micromixing" a norma reações laboratório RT composto de uma única célula quantidades de mRNA aumenta significativamente sua produção de cDNA. Encontramos rendimentos cDNA aumentar em cerca de 1-10 vezes, o que permite: (1) um maior número de genes a ser analisados ​​por célula; (2) uma análise mais quantitativa da expressão do gene, e (3) melhor detecção de baixa abundância genes em células individuais. O micromixing é baseado em acústica microstreaming ^12/09, um fenômeno onde as ondas sonoras propagando em torno de um pequeno obstáculo criar uma vazão média perto do obstáculo. Temos desenvolvido um dispositivo baseado em microstreaming acústica ("micromisturador") com uma simplificação chave; microstreaming acústico pode ser alcançado em freqüências de áudio, assegurando o sistema tem uma interface líquido-ar com um pequeno raio de curvatura ^13. O menisco de um volume microlitro de solução em um tubo fornece um raio de curvatura pequeno adequadamente. O uso de freqüências de áudio significa que o hardware pode ser barato e versátil ^13, e ácidos nucléicos e outros reagentes bioquímicos não são danificadas, como eles podem estar com sonicators padrão de laboratório.

Protocol

1. Micromixing uma reação RT

1. Antes de executar uma reação de RT com micromixing, equilibrar a micromisturador para a temperatura desejada da reação de RT.
   1. Coloque o micromisturador dentro de um 37 ° C (ou a temperatura recomendada pelo fornecedor RT) incubadora de pelo menos 1 hora antes do início da reação de RT.
2. Configure o mix RT de acordo com a transcriptase reversa do fornecedor (por exemplo, MMTV-RT da Promega, Omniscript da Qiagen) instruções, excepto o uso de uma única célula quantidades de RNA total de entrada (por exemplo, 0.1-1pg/μl), ao invés do g-ng quantidades recomendadas pelos fornecedores.
   1. Usamos padrão estéril, livre de nuclease 200μL tubos de paredes finas PCR.
3. Posição tubos RT firmemente na micromisturador assim que estão prontos para a mistura. O micromisturador deve permanecer dentro da incubadora de 37 ° C para a duração da reação de RT.
4. Selecione a freqüência adequada e amplitude de micromixing. Neste exemplo, vamos usar 150Hz.
5. Mudar o micromisturador sobre e deixe-a por toda a duração da reação de RT (60 minutos).
6. Mudar o micromisturador e levar os tubos RT uma vez a reação RT está completa.
7. Coloque os tubos no gelo RT e prossiga normalmente com outras aplicações, tais como Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (qPCR ou PCR em tempo real).

2. Resultados representativos:

O benefício de micromixing no contexto de reações RT é um aumento no rendimento em relação ao cDNA quando outros métodos de mistura (por exemplo, agitação, vórtex ou trituração) são utilizados. Isto pode ser visto, por exemplo, na análise subseqüente do cDNA Reação em Cadeia da Polimerase utilizando quantitativa (qPCR ou PCR em tempo real). Figura 2A ilustra os efeitos da micromixing para os primeiros cinco minutos (azul, "micromixed5") ou a totalidade de 60 minutos (vermelho ", micromixed60") em comparação com a trituração da reação RT imediatamente anterior à incubação RT (preto, "trituração" ). Neste caso o volume da reação de RT anterior foi 25μL e continha 2.5pg de RNA total. traços qPCR usando oligonucleotídeos desenhados para detectar cDNA representando Nurr-1 mRNA são mostrados acima, e os meios ± SEMs do número de ciclos para chegar a fluorescência máxima de 50% em três repetições deste mesmo experimento são plotados abaixo. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significativa (one-way ANOVA com comparações múltiplas de Tukey). Note-se que micromixing para os primeiros cinco minutos da reação RT anterior produziu uma melhoria não significativa mais de trituração enquanto micromixing para toda a 60 minutos da reação RT anterior produziu uma melhoria significativa sobre a trituração, a magnitude do que foi equivalente a cerca de 15 qPCR ciclos, em média.

O benefício de micromixing também pode ser visto na análise da curva de fusão dos produtos qPCR subseqüentes obtidos. No experimento ilustrado na Figura 2B, micromixing para toda a 60 minutos da reação RT anteriores resultaram em um sinal consistente qPCR em amostras duplicadas (Figura 2BA, 2 traços vermelhos), enquanto micromixing para os primeiros 5 minutos ou trituração só produziu qPCR inconsistentes traços (Figura 2BA, 2 traços azuis e dois traços negros, respectivamente). Os traços cinza são controles negativos ("neg.") Na qual cDNA foi deixado de fora da reação qPCR. Quando os produtos qPCR deste experimento foram desnaturados por ramping sua temperatura (isto é, análise da curva de fusão) era evidente que certos produtos PCR (ou seja, um amplicon que era idêntico ao obtido quando as concentrações muito maiores de mRNA foram transcritas e reverter amplificado pela qPCR, dados não mostrados) estavam presentes apenas reações seguintes RT que tinha sido micromixed por 60 minutos (Figura 2BB, 2 traços vermelhos). Todos os outros (isto é, micromixed5, trituração e controles negativos) gerados produtos amplicon alternativo (por exemplo, dímeros primer).

Figura 1. Diagrama de fluxo do protocolo para aplicação micromixing a reações padrão de laboratório RT. Descrições mais detalhadas sobre o princípio físico envolvido, a micromisturador e como construir um micromisturador in-house são fornecidos nas referências ^13,14

Figura 2. Dados Representante qPCR ilustrando os benefícios da micromixing aplicado a reações anteriores RT composto de uma única célula quantidades de mRNA em outra forma padrão de reações de laboratório RT. Vestígios Um Exemplo qPCR detectar mRNA representando cDNA que codifica a Nurr-1 gene. As reações anteriores RT contidas 2.5pg de RNA total em um volume de 25μL e foram realizadas em uma incubadora a 37 ° C por 60 minutos. RT reações foram misturados por trituração do RT misturar antes de incubação (traços pretos ", trituração"), micromixed durante os primeiros cinco minutos da reação de RT (traços azuis ", micromixed5") ou micromixed para toda a 60 minutos da reação de RT (traços vermelhos ", micromixed60" ). Médias ± SEMs do número de ciclos de qPCR necessária para alcançar a fluorescência máxima de 50% são plotados abaixo para n = 3 repetições deste experimento. Asterisco indica uma diferença significativa (one-way ANOVA com comparações múltiplas de Tukey). Experimento B Outra qPCR examinar Nurr-1 produto cDNA, desta vez seguintes reações RT contendo 25pg de RNA total em um volume de 25μL. traços qPCR (a), bem como análise da curva de fusão dos produtos obtidos qPCR (b) são mostradas para as diferentes condições de mistura. Controles negativos em que nenhum cDNA foi incluído na reação de RT anteriores também estão incluídos (traços cinza ", neg."). RT reações com concentrações muito maiores de mRNA também foram realizadas e produziram picos de fusão curva (dados não mostrados) idênticos aos (b) para micromixed60 (traços vermelhos) amostras.

Discussion

O método de aplicação do micromixing a reações padrão de laboratório RT descrito aqui pode, evidentemente, envolvem mRNA colhidas através de qualquer método (por exemplo, células de lise, microdissecção de captura de laser). Pode também incluir quaisquer marcas ou tipos de reagentes RT, qualquer temperatura (dentro da tolerância dos materiais do micromisturador), e qualquer período de tempo. Por exemplo, temos observado melhoria rendimentos cDNA a partir de reações RT compreendendo hexâmero aleatória ou oligo-dT primers. Também pode ser aplicado a outras transformações bioquímicas (por exemplo, hibridação DNA ¹⁵⁾ em conformidade com as seguintes restrições. A principal limitação da técnica atual é a reação deve ocorrer dentro de uma gota (microlitro) pequena de solução que forma uma interface líquido ar-curvada (por exemplo, um menisco). Nós usam rotineiramente volumes de 10 ou 25μL em 200μL tubos de paredes finas PCR, produzindo meniscos com raios de curvatura de 4,7 ou 6,9 milímetros, respectivamente. Esta é uma exigência geral de um fluxo vórtice de ser criada em queda, o que alonga a interface entre diferentes soluções e permite a difusão a ocorrer em escalas de tempo mais curto. Esta restrição, portanto, se aplica a todas as situações em que micromixing pode ser usado. Na verdade, o uso de pequenos volumes pode ser uma vantagem porque muitas vezes a quantidade de material de entrada (por exemplo, RNA, DNA) é limitada, além de economias significativas podem ser feitas em outros reagentes. No contexto específico de melhorar os rendimentos de reação RT, a reação deve também incluir uma quantidade limite de mRNA. Nós mostramos que micromixing padrão reações laboratório RT composto de uma única célula quantidades de RNA de entrada aumenta o seu rendimento em cerca de cDNA 1-10 vezes em relação aos métodos padrão de mistura (agitação, vórtex ou trituração), inclusive para outros genes do que Nurr-1 ilustrado aqui ^14. Nós também mostramos esta melhoria diminui à medida que a concentração de RNA de entrada aumenta ^14. Presumivelmente, isso é porque em concentrações mais elevadas de RNA, o aumento da taxa de difusão na ausência de micromixing garante mais mRNA é convertido em cDNA antes que ele se degrada.

O método micromixing irão beneficiar de alta fidelidade da transmissão do sinal acústico através do vaso de reação para a solução de reação. Nós ajudamos a conseguir este cuidado de usinagem dos furos de mistura na placa de acrílico que cobre o alto-falantes (Figura 1) de tal forma que eles foram afiladas com precisão caber a 200μL tubos de paredes finas PCR utilizado. Este maximizado o contato entre os tubos ea placa de acrílico e de transmissão, portanto, maximizado do sinal acústico. Também é necessário assegurar que os tubos de reação são solidamente mantidos dentro dos buracos mistura porque pode sair durante a mistura, como resultado das vibrações mecânicas.

Nossa definição de microstreaming acústica é, possivelmente, mais amplo do que algumas definições fenomenologicamente-based. No entanto, há uma boa revisão por Riley ^16, que classifica esses fluxos, fundamentalmente, ao invés de fenomenologicamente. O termo não-linear na equação de Navier-Stokes tem que ser grande o suficiente para que a segunda ordem há uma vazão média. Uma vez que esse termo é uma vezes a velocidade de um gradiente de velocidade, nada podemos fazer para tornar a escala de comprimento sobre o qual a velocidade varia suficientemente pequena (isto é, fazer o gradiente de velocidade suficientemente grande) pode dar origem a um fluxo microstreaming. Nosso dispositivo microstreaming baseado acústica ("micromisturador") permite microstreaming acústico em áudio (ou seja, de baixa potência) freqüências, assegurando o sistema tem uma interface líquido-ar com um pequeno raio de curvatura ^13. Em contraste, a "acústica streaming" é geralmente definido por um termo não-linear que é feita a grande velocidade por um grande (ou seja, de alta potência). No nosso caso, uma pequena queda em um poço é feita a oscilar, a tensão superficial da gota, juntamente com a sua viscosidade, pode desempenhar um papel na criação de uma vazão média útil para misturar ^13. Experimentos também mostraram que as grandes (10-100μm) partículas podem ser movidos em grandes gotas de vibração do que nós usamos, no entanto, este é, provavelmente, por um mecanismo diferente específicas para partículas ^17.

Em conclusão, a aplicação de micromixing a reações padrão de laboratório RT composto de uma única célula quantidades de RNA é uma forma eficaz de aumentar drasticamente o seu rendimento cDNA. Esta melhoria é bem acima do que pode ser conseguido usando métodos atualmente disponíveis de volumes microlitro de mistura (ou seja, a tremer, vórtex ou trituração). Embora existam muitas circunstâncias em que a microfluídica dispositivos baseados em desempenho RT seria um grande avanço, em outras circunstâncias, inclusive a nossa, micromixing sozinho fornece benefício significativo e adequada, sem a necessidade de equipamentos especializados adicionais e métodos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008