L'augmentation des rendements d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de la transcriptase inverse en utilisant Microstreaming acoustique

Summary

Nous décrivons une nouvelle méthode pour augmenter le rendement d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de transcription inverse contraire. La nouveauté réside dans l'utilisation d'un micromélangeur, qui utilise le phénomène de la microstreaming acoustique, de mélanger les liquides à l'échelle du microlitre plus efficacement que secouer, vortex ou trituration.

Abstract

L'expression des gènes en corrélation avec le comportement des cellules est idéalement effectué au niveau unicellulaire. Cependant, ce n'est pas facile à réaliser car la petite quantité d'ARNm labiles présents dans une seule cellule (1-5% de 1-50pg ARN total, soit 0,01 2.5pg-ARNm, par cellule ¹⁾ dégrade la plupart du temps avant qu'elle puisse être une transcription inverse dans une copie d'ADNc stables. Par exemple, en utilisant des réactifs de laboratoire standard et matériel, seul un petit nombre de gènes peut être évaluée qualitativement par cellule ^2. Une façon d'augmenter l'efficacité de la norme de laboratoire de la transcriptase inverse (RT) des réactions (réactifs standard dans des volumes microlitre) comprenant une seule cellule quantités d'ARNm serait plus rapide mélanger les réactifs pour l'ARNm peut être converti en ADNc avant qu'il ne se dégrade. Toutefois, ce n'est pas anodin car à l'échelle du microlitre écoulement du liquide est laminaire, c'est à dire les méthodes actuellement disponibles de mélange (c'est à dire secouer, vortex et trituration) ne parviennent pas à produire suffisamment de mouvement chaotique efficacement mélanger les réactifs. Pour résoudre ce problème, micro-échelle des techniques de mélange doivent être utilisées ^3,4. Un certain nombre de technologies basées sur microfluidiques mélange ont été développés avec succès d'augmenter les rendements de réaction RT ^5-8. Cependant, les technologies microfluidiques nécessitent du matériel spécialisé qui est relativement cher et n'est pas encore largement disponibles. Une solution moins coûteuse, plus pratique est souhaitable. L'objectif principal de cette étude est de démontrer comment l'application d'un roman "micromélange" technique de laboratoire standard réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARNm augmente considérablement leurs rendements d'ADNc. Nous trouvons des rendements d'ADNc augmenter d'environ 10 à 100 fois, ce qui permet: (1) un plus grand nombre de gènes à analyser par cellule; (2) une analyse plus quantitative de l'expression des gènes, et (3) une meilleure détection des gènes de faible abondance dans des cellules individuelles. Le micromélange est basé sur acoustiques microstreaming ^9-12, un phénomène où les ondes sonores se propageant autour d'un petit obstacle créer un débit moyen près de l'obstacle. Nous avons développé une acoustique microstreaming basée sur l'appareil («micromélangeur") avec une simplification clés; microstreaming acoustiques peuvent être obtenus à des fréquences audio en s'assurant que le système a une interface liquide-air avec un petit rayon de courbure ^13. Le ménisque d'un volume microlitre de solution dans un tube fournit un rayon suffisamment petit de courbure. L'utilisation des fréquences audio signifie que le matériel peut être peu coûteux et polyvalents ^13, et des acides nucléiques et d'autres réactifs biochimiques ne sont pas endommagés comme ils peuvent être avec sonicateurs de laboratoire standard.

Protocol

1. Micromélange une réaction de RT

1. Avant d'effectuer une réaction de RT avec micromélange, à équilibrer le micromélangeur à la température désirée de la réaction de RT.
   1. Placez le dans un micromélangeur 37 ° C (ou la température recommandée par le fournisseur RT) incubateur pour au moins 1 heure avant le début de la réaction de RT.
2. Mettre en place le mix RT en fonction de la transcriptase inverse du fournisseur (par exemple, MMTV-RT de Promega, Omniscript de Qiagen) des instructions, sauf à usage unique cellule du total des quantités d'entrée ARN (par exemple 0.1-1pg/μl), au lieu de la g-ng quantités recommandées par les fournisseurs.
   1. Nous utilisons la norme stérile, sans nucléase 200 pl à parois minces tubes PCR.
3. Position des tubes RT solidement dans le micromélangeur dès qu'ils sont prêts pour le mixage. Le micromélangeur devrait rester à l'intérieur de l'incubateur 37 ° C pendant la durée de la réaction de RT.
4. Sélectionnez la fréquence appropriée et l'amplitude de micromélange. Dans cet exemple nous utilisons 150Hz.
5. Allumez le micromélangeur le et laissez-le pendant toute la durée de la réaction de RT (60 minutes).
6. Allumez le micromélangeur off et de prendre les tubes RT une fois la réaction de RT est terminée.
7. Placer les tubes sur la glace RT et procéder comme normal avec d'autres applications telles que Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR ou PCR en temps réel).

2. Les résultats représentatifs:

L'avantage de micromélange dans le contexte des réactions RT est une augmentation du rendement par rapport à l'ADNc lorsque d'autres méthodes de mélange (par exemple, secouer, ou vortex trituration) sont utilisés. Ceci peut être vu, par exemple, sur l'analyse ultérieure de l'ADNc en utilisant la polymérase quantitative Réaction chaîne (qPCR ou PCR en temps réel). La figure 2A illustre les effets de micromélange pour les 5 premières minutes (en bleu ", micromixed5") ou les 60 minutes toute (rouge, "micromixed60") par rapport à la trituration de la réaction de RT immédiatement avant l'incubation RT (noir », la trituration" ). Dans ce cas, le volume de la réaction précédente RT a été 25 pi et il contenait 2.5pg d'ARN total. traces qPCR utilisant des amorces conçues pour détecter les ADNc NURR-1 représente l'ARNm sont présentés ci-dessus, et les moyens ± SEM du nombre de cycles pour atteindre la fluorescence maximale de 50% en 3 répétitions de cette même expérience sont tracées ci-dessous. L'astérisque indique une différence statistiquement significative (ANOVA à un facteur avec des comparaisons multiples de Tukey). Notez que pour le micromélange les 5 premières minutes de la réaction précédente RT produit une amélioration non significative au cours de trituration alors micromélange pour les 60 minutes toute la réaction précédente RT a produit une amélioration significative par rapport trituration, dont l'ampleur était équivalente à environ 15 qPCR cycles, en moyenne.

L'avantage de micromélange peut également être vu dans la fonte analyse de la courbe des produits obtenus qPCR ultérieures. Dans l'expérience illustrée dans la figure 2B, micromélange pour les 60 minutes toute la réaction précédente RT abouti à un signal qPCR cohérent dans des échantillons en double (figure 2BA, 2 traces rouges), tandis que micromélange pour les 5 premières minutes ou la trituration ne produit qPCR incompatibles des traces (figure 2BA, 2 bleus et 2 traces traces noires, respectivement). Les traces grises sont des contrôles négatifs («neg.") Dans lequel l'ADNc a été écarté de la réaction PCR quantitative. Lorsque les produits qPCR de cette expérience ont été dénaturées par ramping leur température (ie analyse la courbe de fusion), il était évident que appropriée des produits de PCR (ie un amplicon qui était identique à celle obtenue lorsque les concentrations beaucoup plus élevées d'ARNm ont été reverse transcrit et amplifié par PCR quantitative, données non présentées) étaient présents seulement suite aux réactions RT qui avait été micromixed pendant 60 minutes (figure 2Bb, 2 traces rouges). Tous les autres (c'est à dire micromixed5, la trituration et des contrôles négatifs) générés produits alternatifs amplicon (dimères d'amorces, par exemple).

Figure 1. Schéma du protocole d'application de la norme de laboratoire micromélange réactions RT. Des descriptions plus détaillées du principe physique en cause, le micromélangeur et comment construire une micromélangeur en interne sont fournis dans les références ^13,14

Figure 2. Représentant de données qPCR illustrant les avantages de micromélange appliquée aux précédentes réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARNm dans les autres standards des réactions RT laboratoire. Traces qPCR Un exemple détecter l'ARNm de l'ADNc codant pour la représenter NURR-1 du gène. Les réactions précédentes RT contenue 2.5pg d'ARN total dans un volume de 25 pi et ont été réalisées dans un incubateur à 37 ° C pendant 60 minutes. Réactions RT ont été mélangés par la trituration de la RT mélanger avant d'incubation (traces noires », la trituration»), micromixed pendant les 5 premières minutes de la réaction de RT (traces bleues, "micromixed5») ou micromixed pour les 60 minutes de toute la réaction de RT (traces rouges », micromixed60" ). Moyens ± SEM du nombre de cycles nécessaires pour atteindre qPCR fluorescence maximale de 50% sont tracées ci-dessous pour n = 3 répétitions de cette expérience. L'astérisque indique une différence significative (ANOVA à un facteur avec des comparaisons multiples de Tukey). B Une autre expérience qPCR examinant NURR-1 produit d'ADNc, cette fois suite aux réactions RT contenant 25pg d'ARN total dans un volume de 25 pi. traces qPCR (a) ainsi que la fonte analyse de la courbe des produits obtenus qPCR (b) sont indiqués pour les différentes conditions de mélange. Des contrôles négatifs dans lequel aucun ADNc a été inclus dans la réaction précédente RT sont également inclus (traces grises », neg."). Réactions RT avec des concentrations beaucoup plus élevées d'ARNm ont également été réalisées et produites pics courbe de fusion (données non présentées) identiques à ceux de (b) pour micromixed60 (traces rouges) des échantillons.

Discussion

La méthode d'application de la norme de laboratoire micromélange réactions RT décrites ici peuvent, bien sûr, impliquent l'ARNm récoltés par n'importe quelle méthode (par exemple des cellules de lyse, microdissection laser de capture). Il peut également comprendre toute les marques ou les types de réactifs RT, n'importe quelle température (dans la tolérance des matériaux de l'micromélangeur), et toute période de temps. Par exemple, nous avons observé l'amélioration des rendements d'ADNc à partir des réactions RT comprenant aléatoire hexamère ou oligo-dT amorces. Il pourrait également être appliqué à d'autres transformations biochimiques (hybridation de l'ADN par exemple ¹⁵⁾ se conformant aux contraintes suivantes. La principale contrainte de la technique actuelle est la réaction doit se produire dans un petit (microlitre) goutte de solution qui se forme incurvée liquide-air l'interface (par exemple un ménisque). Nous utilisons régulièrement des volumes de 10 ou 25 pi de 200 pl tubes PCR à paroi mince, produisant ménisques avec des rayons de courbure de 4,7 ou 6,9 mm, respectivement. Ceci est une exigence générale pour un écoulement tourbillonnaire à être mis en place dans la chute, ce qui allonge l'interface entre les différentes solutions et permet la diffusion aura lieu sur de plus courtes échelles de temps. Cette contrainte s'applique donc à toutes les situations dans lesquelles micromélange pourrait être utilisé. En effet l'utilisation de petits volumes peut être un avantage parce que souvent la quantité de matériel d'entrée (par exemple, l'ARN, ADN) est limité, plus importantes économies peuvent être faites sur d'autres réactifs. Dans le contexte spécifique de l'amélioration des rendements réaction de RT, la réaction doit également comporter une quantité limitante d'ARNm. Nous avons montré que micromélange standard de laboratoire des réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARN d'entrée augmente leur rendement ADNc d'environ 10 à 100 fois plus les méthodes standard de mélange (tremblements, vortex ou de trituration), y compris pour d'autres gènes que NURR-1 illustrée ici ^14. Nous avons également montré que cette amélioration diminue à mesure que la concentration de l'ARN d'entrée augmente ^14. Vraisemblablement, c'est parce concentrations d'ARN supérieur, l'augmentation du taux de diffusion en l'absence de micromélange assure plus d'ARNm est converti en ADNc avant qu'il se dégrade.

La méthode micromélange bénéficieront de haute fidélité de transmission du signal acoustique à travers la cuve de réaction à la solution de réaction. Nous avons aidé à atteindre cet objectif par usinage minutieux des trous de mélange dans la plaque en acrylique recouvrant les haut-parleurs (figure 1) tels qu'ils ont été effilé pour s'adapter précisément à la 200 pl tubes à paroi mince PCR utilisées. Cette maximisé le contact entre les tubes et la plaque acrylique et de transmission ainsi maximisée du signal acoustique. On doit également s'assurer que les tubes de réaction sont solidement maintenus dans les trous de mélange, car ils peuvent sortir au cours du mélange en raison des vibrations mécaniques.

Notre définition de microstreaming acoustique est éventuellement plus large que quelques définitions phénoménologiquement basé. Cependant, il ya une bonne critique de Riley ¹⁶ qui classifie ces flux fondamentalement, plutôt que phénoménologiquement. Le terme non-linéaire dans l'équation de Navier-Stokes doit être assez grand pour que au second ordre il ya un débit moyen. Depuis que ce terme est une fois la vitesse d'un gradient de vitesse, ce que nous faisons pour rendre l'échelle de longueur sur laquelle la vitesse varie suffisamment petit (c'est à dire faire le gradient de vitesse suffisamment grande) peut donner lieu à un flux microstreaming. Notre acoustiques microstreaming basée sur l'appareil («micromélangeur") permet microstreaming acoustique au son (ie de faible puissance) des fréquences en s'assurant que le système a une interface liquide-air avec un petit rayon de courbure ^13. En revanche, «acoustique streaming» est souvent définie par un terme non linéaire qui est faite par une grande vitesse de grande taille (puissance élevée). Dans notre cas, une petite goutte dans un puits est fait osciller; la tension de surface de la goutte, en collaboration avec sa viscosité, peut jouer un rôle dans la création d'un débit moyen utile pour le mélange ^13. Des expériences ont également montré que les grandes (10-100 microns) des particules peut être déplacé au sein de grosses gouttes de vibration que nous utilisons, mais ce n'est sans doute par un mécanisme différent spécifique à particules ^17.

En conclusion, l'application de la norme de laboratoire micromélange réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARN est un moyen efficace pour augmenter considérablement leur rendement ADNc. Cette amélioration est au-delà de ce qui peut être réalisé en utilisant des méthodes actuellement disponibles de micro-volumes de mélange (c'est à dire secouer, vortex ou de trituration). Bien qu'il existe de nombreuses circonstances dans lesquelles la microfluidique à base de dispositifs performants RT serait un grand progrès, en d'autres circonstances, y compris la nôtre, micromélange seul fournit des avantages importants et adéquats, sans le besoin d'équipement spécialisé et des méthodes supplémentaires.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008