Aumentar el rendimiento de cDNA a partir de una sola célula cantidades de ARNm en las reacciones de laboratorio estándar de la transcriptasa inversa con microcorrientes acústica

Summary

Se describe un nuevo método para aumentar el rendimiento de cDNA a partir de una sola célula cantidades de ARNm en las reacciones de laboratorio estándar de lo contrario la transcripción inversa. La novedad reside en el uso de un micromixer, que utiliza el fenómeno de las microcorrientes acústica, para mezclar líquidos a escalas microlitro con más eficacia que temblores, agitación o trituración.

Abstract

La correlación de la expresión génica con el comportamiento celular está muy bien hecho a nivel de una sola célula. Sin embargo, esto no es fácil de lograr debido a que la pequeña cantidad de ARNm lábil presente en una sola célula (1-5% de 1-50pg ARN total, o ARNm de 0,01 2.5pg, por celda ¹⁾ en su mayoría se degrada antes de que se transcriben de forma inversa en una copia de cDNA estable. Por ejemplo, utilizando reactivos de laboratorio y de hardware, sólo un pequeño número de genes pueden ser evaluadas cualitativamente por la celda ^2. Una forma de aumentar la eficiencia de los métodos de laboratorio de la transcriptasa inversa (RT), las reacciones (es decir, los reactivos estándar en los volúmenes de microlitros) que comprende una sola célula cantidades de ARNm sería confundir más rápidamente los reactivos para el ARNm puede ser convertido a cDNA antes de que se degrada. Sin embargo, esto no es trivial, ya que a escalas microlitro de flujo de líquido es laminar, es decir, los métodos actualmente disponibles de la mezcla (es decir, temblores, agitación y trituración) no produce un movimiento caótico suficiente para mezclar con eficacia los reactivos. Para resolver este problema, micro-escala de técnicas de mezcla que se utilizará ^3,4. Una serie de microfluidos tecnologías basadas en la mezcla, se han desarrollado con éxito aumentar el rendimiento de la reacción RT ^8.5. Sin embargo, las tecnologías de microfluidos requieren hardware especializado que es relativamente caro y que aún no están ampliamente disponibles. Una solución más barata, más cómoda es deseable. El objetivo principal de este estudio es demostrar cómo la aplicación de una novela "micromezcla" técnica estándar de laboratorio las reacciones de RT que comprende una sola célula cantidades de ARNm aumenta significativamente el rendimiento de sus ADNc. Nos encontramos con los rendimientos de cDNA un aumento de aproximadamente 10 a 100 veces, lo que permite: (1) un mayor número de genes a ser analizados por la célula, (2) análisis cuantitativo de la expresión génica, y (3) una mejor detección de los genes de baja abundancia en las células individuales. El micromezcla se basa en acústico microcorrientes ^12.09, un fenómeno por el cual las ondas de sonido alrededor de propagación de un pequeño obstáculo crear un flujo promedio cerca del obstáculo. Hemos desarrollado una acústica microcorrientes dispositivo basado en ("micromixer"), con una simplificación clave; microcorrientes acústica se puede conseguir en las frecuencias de audio, asegurando que el sistema tiene una interfase líquido-aire con un pequeño radio de curvatura ^13. El menisco de un volumen de microlitro de solución en un tubo ofrece un radio de curvatura apropiado pequeños. El uso de las frecuencias de audio significa que el hardware puede ser barato y versátil ^13, y los ácidos nucleicos y otros reactivos bioquímicos no son dañados como pueden ser con sonicadores estándar de laboratorio.

Protocol

1. Micromezcla una reacción RT

1. Antes de realizar una reacción de RT con micromezcla, equilibrar la micromixer a la temperatura deseada de la reacción de RT.
   1. Coloque el micromixer dentro de 37 ° C (o la temperatura recomendada por el proveedor RT) incubadora de al menos 1 hora antes del inicio de la reacción de RT.
2. Establecer la mezcla de RT de acuerdo con el proveedor de la transcriptasa inversa de (por ejemplo, MMTV-RT de Promega, Omniscript de Qiagen) instrucciones, excepto el uso de una sola célula cantidades de ARN total de entrada (por ejemplo, 0.1-1pg/μl), en lugar de la g-ng cantidades recomendadas por los proveedores.
   1. Utilizamos estándar estéril, libre de nucleasa 200μL tubos de pared delgada PCR.
3. Posición RT tubos firmemente en la micromixer tan pronto como estén listos para mezclar. El micromixer debe permanecer dentro de la incubadora a 37 ° C durante la duración de la reacción de RT.
4. Seleccione la frecuencia adecuada y la amplitud de micromezcla. En este ejemplo vamos a usar 150Hz.
5. Cambiar el micromixer adelante y dejar actuar durante toda la duración de la reacción de RT (60 minutos).
6. Cambiar el micromixer fuera y tomar los tubos RT una vez que la reacción de RT se ha completado.
7. Coloque los tubos de RT en el hielo y continuar de forma normal con otras aplicaciones como la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR o PCR en tiempo real).

2. Los resultados representativos:

El beneficio de micromezcla en el contexto de las reacciones de RT es un aumento en el rendimiento de cDNA en relación con los otros métodos de mezcla (por ejemplo, temblores, agitación o trituración) se utilizan. Esto se puede ver, por ejemplo, en el análisis posterior de los cDNA utilizando cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR cuantitativa o PCR en tiempo real). Figura 2A muestra los efectos de micromezcla durante los primeros 5 minutos (azul, "micromixed5") o la totalidad de 60 minutos (de color rojo, "micromixed60"), en comparación con la trituración de la reacción de RT inmediatamente antes de la incubación RT (negro, "trituración" ). En este caso el volumen de la anterior reacción de RT se 25μL y contenía 2.5pg de ARN total. rastros qPCR utilizando los primers diseñados para detectar cDNA Nurr-1 representa ARNm se muestra arriba, y las medias ± SEM del número de ciclos para alcanzar el 50% máximo de fluorescencia en 3 repeticiones de este mismo experimento se representan a continuación. El asterisco indica una diferencia estadísticamente significativa (ANOVA de un factor con comparaciones múltiples de Tukey). Tenga en cuenta que micromezcla para los primeros 5 minutos de la anterior reacción RT producido una mejora no significativa en la trituración, mientras que para toda la micromezcla 60 minutos de la anterior reacción RT producido una mejora significativa en la trituración, la magnitud de lo que equivale a aproximadamente el 15 qPCR ciclos, en promedio.

El beneficio de micromezcla también se puede ver en análisis de la curva de fusión de los productos obtenidos qPCR posteriores. En el experimento ilustrado en la Figura 2B, micromezcla para todo el 60 minutos de la anterior reacción RT dio lugar a una señal de qPCR consistente en duplicados de las muestras (Figura 2Ba, 2 rastros de color rojo), mientras que micromezcla durante los primeros 5 minutos o trituración sólo se produce qPCR inconsistente rastros (Figura 2Ba, dos azules y dos rastros rastros negro, respectivamente). Las huellas grises son los controles negativos ("neg.") En el que cDNA fue dejado fuera de la reacción de qPCR. Cuando los productos qPCR de este experimento fueron desnaturalizados por la rampa de su temperatura (es decir, análisis de la curva de fusión), era evidente que los productos de PCR apropiada (es decir, una amplificación que era idéntica a la obtenida en concentraciones mucho más elevadas de ARNm se transcribe inversa y amplificado por PCR cuantitativa, datos no mostrados) sólo estaban presentes las siguientes reacciones de RT que se había micromixed durante 60 minutos (Figura 2Bb, 2 rastros de color rojo). Todos los demás (es decir, micromixed5, trituración y controles negativos) generado productos alternativos de amplificación (por ejemplo, dímeros de primers).

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo para la aplicación de micromezcla a métodos de laboratorio las reacciones de RT. Descripciones más detalladas de los principios físicos involucrados, micromixer y cómo construir un micromixer de la casa se ​​proporcionan en las referencias ^13,14

Figura 2. Representante qPCR datos que ilustran los beneficios de micromezcla se aplica a las reacciones de RT anterior que comprende una sola célula cantidades de ARNm de otra manera estándar de laboratorio las reacciones de RT. Un ejemplo de las huellas qPCR detección de ARNm cDNA que codifica para la representación de Nurr-1 gen. Lo anterior reacciones de RT contiene 2.5pg de ARN total en un volumen de 25μL y se llevaron a cabo en una incubadora a 37 ° C durante 60 minutos. RT reacciones fueron mezclados por trituración de la RT mezcla antes de la incubación (huellas negro "trituración"), micromixed durante los primeros 5 minutos de la reacción RT (huellas azules ", micromixed5") o para toda la micromixed 60 minutos de la reacción RT (trazas rojas ", micromixed60" ). Media ± SEM del número de ciclos de PCR cuantitativa para llegar al 50% máximo de fluorescencia se representan a continuación para n = 3 repeticiones de este experimento. El asterisco indica una diferencia significativa (ANOVA de un factor con comparaciones múltiples de Tukey). B Otro experimento qPCR examinar Nurr-1 cDNA producto, esta vez después de las reacciones de RT contiene 25pg de ARN total en un volumen de 25μL. rastros qPCR (a), así como análisis de la curva de fusión de los productos obtenidos qPCR (b) se muestran las condiciones de mezcla diferentes. Los controles negativos en los que no cDNA fue incluido en la anterior reacción RT también se incluyen (los rastros grises ", neg."). Reacciones de RT con concentraciones mucho más elevadas de ARNm se realizaron y produjeron picos de la curva de fusión (datos no mostrados) idénticas a las de (b) para micromixed60 (trazas rojas) muestras.

Discussion

El método de aplicación de micromezcla a métodos de laboratorio las reacciones de RT descritos aquí pueden, por supuesto, implica ARNm cosechado a través de cualquier método (por ejemplo, células de lisis, láser microdisección de captura). También puede comprender cualquiera de las marcas o tipos de reactivos RT, cualquier temperatura (dentro de la tolerancia de los materiales de la micromixer), y cualquier período de tiempo. Por ejemplo, hemos observado que mejora los rendimientos de cDNA a partir de las reacciones de RT que comprende al azar hexamer o cebadores oligo-dT. También podría aplicarse a otras transformaciones bioquímicas (por ejemplo, la hibridación de ADN ¹⁵⁾ conforme a las siguientes restricciones. La principal limitación de la técnica actual es la reacción debe producirse dentro de un pequeño (microlitro) gota de la solución que forma una curva líquido-aire de interfaz (por ejemplo, un menisco). Nosotros usamos los volúmenes de 10 ó 25μL en 200μL tubos de pared delgada PCR, la producción de meniscos con radios de curvatura de 4.7 o 6.9 mm, respectivamente. Este es un requisito general para un flujo de vórtice que se creará en la caída, que se alarga la interfaz entre las distintas soluciones y permite la difusión que tendrá lugar en plazos más cortos. Esta restricción se aplica a todas las situaciones en las que micromezcla pueden ser utilizados. De hecho, el uso de pequeñas cantidades puede ser una ventaja, porque a menudo la cantidad de material de entrada (por ejemplo, ARN, ADN) se limita, además de importantes ahorros se pueden hacer en otros reactivos. En el contexto específico de mejora de los rendimientos RT reacción, la reacción también debe incluir una limitación de cantidad de ARNm. Hemos demostrado que micromezcla estándar de laboratorio, que comprende las reacciones de RT sola célula cantidades de ARN de entrada aumenta su rendimiento cDNA por aproximadamente 10 100 veces más de los métodos estándar de la mezcla (temblores, agitación o trituración), incluidos los de otros genes que Nurr-1 se ilustra aquí ^14. También hemos demostrado que esto mejora disminuye a medida que la concentración de ARN de entrada aumenta ^14. Es de suponer que esto se debe a mayores concentraciones de ARN, el aumento de la tasa de difusión en la ausencia de micromezcla asegura más de ARNm se convierte en ADNc antes de que se degrada.

El método micromezcla se beneficiarán de la alta fidelidad de la transmisión de la señal acústica a través del recipiente de reacción para la solución de reacción. Hemos ayudado a lograr este objetivo mecanizado cuidado de los agujeros de la mezcla en la placa de acrílico que recubre los altavoces (Figura 1) de tal manera que se cónico para adaptarse con precisión la 200μL tubos de pared delgada de PCR utilizado. Esto maximiza el contacto entre los tubos y la placa de acrílico y por lo tanto, maximiza la transmisión de la señal acústica. También es necesario asegurarse de que los tubos de reacción se mantendrá de forma segura dentro de los agujeros de la mezcla, ya que pueden salir durante la mezcla, como resultado de las vibraciones mecánicas.

Nuestra definición de microcorrientes acústica es, posiblemente, más amplia que algunas definiciones fenomenológico basado. Sin embargo, hay una buena revisión por Riley ^16, que clasifica a estos flujos, fundamentalmente, en vez de vista fenomenológico. El término no lineal en la ecuación de Navier-Stokes tiene que ser lo suficientemente grande como para que en segundo orden, hay un flujo medio. A partir de ese plazo es un par de veces la velocidad de un gradiente de velocidad, nada podemos hacer para que la escala de longitud más que la velocidad varía suficientemente pequeño (es decir, que el gradiente de velocidad lo suficientemente grande) puede dar lugar a un flujo de microcorrientes. Nuestra acústica microcorrientes dispositivo basado en ("micromixer") permite microcorrientes acústico en audio (es decir, de baja potencia) frecuencias, asegurando que el sistema tiene una interfase líquido-aire con un pequeño radio de curvatura ^13. Por el contrario, "la transmisión acústica" se define a menudo por un término no lineal que se hace grande por una gran velocidad (es decir, el poder de alto). En nuestro caso, una pequeña gota en un pozo se hace oscilar, la tensión superficial de la gota, así como su viscosidad, puede jugar un papel en la creación de un flujo medio útil para la mezcla ^13. Los experimentos han demostrado también que los grandes (10-100μm), las partículas se pueden mover dentro de las gotas más grandes vibración de lo que uso, pero esto es probablemente por un mecanismo diferente a las partículas específicas ^17.

En conclusión, la aplicación de micromezcla a métodos de laboratorio las reacciones de RT que comprende una sola célula cantidades de ARN es una forma efectiva de aumentar drásticamente su rendimiento cDNA. Esta mejora es más allá de lo que se puede lograr utilizando los métodos actualmente disponibles de los volúmenes de microlitros de mezcla (es decir, temblores, agitación o trituración). Aunque hay muchas circunstancias en las que los dispositivos basados ​​en microfluídica realizar RT sería un gran avance, en otras circunstancias, incluyendo la nuestra, micromezcla sólo proporciona un beneficio significativo y adecuado sin necesidad de equipos más especializados y métodos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus Bioscience	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega Corp.	C1181
AMV-RT	Promega Corp.	M5101
dNTP set	Promega Corp.	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega Corp.	N2111
Nuclease-Free Water	Promega Corp.	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008