Summary
우리는 달리 일반 실험실 역방향 전사 반응에서 mRNA의 단일 셀 수량로부터 cDNA 수율을 높이기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 참신은 흔들림 vortexing 또는 분쇄보다 효과적으로 microliter 비늘에서 유체를 섞어, 음향 microstreaming의 현상을 활용 micromixer의 사용에 있습니다.
Abstract
세포의 행동과 연관 유전자 발현은 이상적으로 단일 세포 수준에서 이루어집니다. 그것이 베꼈는데를 반대하기 전에 하나의 셀 (1월 1일에서 5일까지 - 50pg 총 RNA의 % 또는 0.01 - 2.5pg mRNA, 셀 하나 당)에있는 불안 정한 mRNA의 작은 금액은 대부분이 저하하기 때문에 그러나, 이것은 쉽게 달성되지 않습니다 안정적인 cDNA 사본으로. 예를 들어, 표준 실험실 시약 및 하드웨어를 사용하여, 유전자의 단지 소수가 질적으로 전지 2마다 평가하실 수 있습니다. mRNA의 단일 셀 금액 구성된 표준 실험실 반전 transcriptase (RT) 반응 (microliter 볼륨에서 즉, 표준 시약)의 효율성을 높이는 한 가지 방법은 그것이 저하되기 전에 mRNA가 cDNA로 변환 수 있도록보다 신속하게 시약을 혼합하는 것입니다. 그러나 microliter 비늘에서 액체 흐름이 층류이기 때문에 이것은 하찮은되지 않습니다, 즉 혼합의 현재 방법 (흔들림 vortexing 및 분쇄 즉)은 효과적으로 시약을 혼합하는 데 충분한 혼란 움직임을 생산하기 위해 실패합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 마이크로 스케일 혼합 기법 3,4을 사용해야합니다. microfluidic 기반의 혼합 기술의 숫자가 성공적으로 RT 반응 수율에게 5-8를 증가하는 개발되었습니다. 그러나, microfluidics 기술은 상대적으로 비싸고 아직 널리 사용할 수없는 전문적인 하드웨어가 필요합니다. 저렴, 더 편리한 솔루션은 바람직합니다. 본 연구의 주요 목적은 mRNA의 단일 셀 수량 구성된 표준 실험실 RT 반응에 소설 "micromixing"기술의 응용은 크게 자신의 cDNA 수확량을 증가하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 우리는 cDNA 산출이 가능하게 약 10 - 100 - 배로 증가 발견 (1) 세포마다 분석하는 유전자의 큰 숫자, 유전자 발현 (2) 더 많은 정량 분석하고, 낮은 풍부한 유전자 (3) 좋은 검출 단일 세포 인치 micromixing는 음향은 9-12 작은 장애물 주위에 전파 음파가 장애물 근처에 의미 흐름을 만드는 현상을 microstreaming을 기반으로합니다. 우리는 주요 단순화와 음향 microstreaming 기반 장치 (이하 "micromixer") 개발, 음향 microstreaming는 시스템이 굴곡 13 작은 반경을 가진 액체 공기 인터페이스를함으로써 오디오 주파수에서 얻을 수 있습니다. 튜브 솔루션 microliter 볼륨의 초승달 모양은 곡률 적절하게 작은 반경을 제공합니다. 오디오 주파수의 사용은 하드웨어가 저렴 13 다용도 수있다는 것을 의미하고 표준 연구소 sonicators 함께 할 수처럼 핵산 및 다른 생화 학적 시약이 손상되지 않습니다.
Protocol
1. RT 반응을 Micromixing
- micromixing과 RT 반응을 수행하기 전에, RT 반응의 원하는 온도로 micromixer를 평형.
- 37 내부 micromixer를 놓고 ° C (또는 RT 공급 업체에서 권장하는 온도) RT 반응의 시작하기 전에 적어도 1 시간 보육.
- 반대 transcriptase 공급자에 따라 RT 믹스를 설정 (Promega, Qiagen에서 Omniscript에서 예 MMTV - RT) 방법 대신 NG - μg의 총 RNA 입력 (예 : 0.1-1pg/μl)의 사용 단일 셀 금액 제외 금액은 공급 업체에 의해 권장합니다.
- 우리는 표준 살균, nuclease없는 200μL 얇은 벽의 PCR 튜브를 사용합니다.
- 그들은 혼합 준비 마자 안전 micromixer에 위치 RT 튜브. micromixer은 RT 반응의 기간 동안 37 ° C 배양기 안에서 유지됩니다.
- 적절한 빈도와 micromixing의 진폭을 선택합니다. 이 예제에서 우리는 150Hz 사용합니다.
- 에 micromixer 스위치 및 RT 반응 (60 분)의 전체 기간 동안 그것을 두십시오.
- micromixer 끄고 RT 반응이 완료되면 RT 튜브를 꺼내.
- 얼음 RT 튜브를 삽입 및 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR 또는 실시간 PCR)과 같은 추가 애플 리케이션을 정상적으로 진행합니다.
2. 대표 결과 :
RT 반응의 맥락에서 micromixing의 장점은 다른 혼합 방법이 (예를 들어, 흔들림 vortexing 또는 분쇄) 사용하는 경우에 상대적으로 cDNA 수확량의 증가이다. 이것은 cDNA를 사용 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR 또는 실시간 PCR)의 후속 분석에 따라, 예를 들어 볼 수 있습니다. 그림 2A 바로 전에 RT 보육 (흑백, "분쇄"로 RT 반응의 분쇄와 비교하여 처음 5 분 동안 micromixing의 효과 (파란색, "micromixed5") 또는 전체 60 분 (빨간색, "micromixed60")를 보여줍니다 ). 이 경우에는 앞의 RT 반응의 부피 25μL이고 그것은 총 RNA의 2.5pg이 포함되어 있습니다. cDNA 대표 Nurr - 1 mRNA를 검출하기위한 primers를 사용하여 qPCR의 흔적은 위에 표시된되며, 수단 ± 같은 실험을 3 반복으로 50 %의 최대 형광에 도달 사이클의 수를 전문가, 대리인은 아래 꾸몄다 있습니다. 별표는 통계적으로 중요한 차이 (Tukey 다중 비교와 편도 ANOVA)을 나타냅니다. 앞의 RT 반응의 전체 60 분 micromixing은 분쇄에 비해 상당한 개선을 생산하는 반면 위의 RT 반응의 첫 번째 5 분 micromixing은 분쇄 이상이 아닌 상당한 개선을 생산합니다, 규모있는 것은 약 15 qPCR에 해당되었다 주기, 평균.
micromixing의 혜택도 얻을 이후 qPCR 제품의 곡선 분석을 용해에서 볼 수 있습니다. 유일한 일관성 qPCR을 생산 처음 5 분 또는 분쇄를위한 micromixing 반면에 이전 RT 반응의 전체 60 분 micromixing 그림 2B에 설명된 실험, 중복 표본의 일관성 qPCR 신호 (그림 2Ba, 2 빨간 흔적) 결과 흔적 (그림 2Ba, 2 블루 흔적 2 검은 흔적, 각각). 회색 흔적은 qPCR 반응 밖으로 버려졌습니다 cDNA있는 부정적인 컨트롤 ( "neg.")입니다. 본 실험에서 qPCR 제품은 확실했다 그들의 온도 (즉, 용해 곡선 분석)을 올렸에 의해 변성되었을 때 그 적절한 PCR 제품 (즉, mRNA의보다 높은 농도는 반대로 qPCR에 의해 베꼈는데 및 증폭했을 때 얻은 동일했습니다 amplicon, 표시되지 데이터) 60 분 (그림 2Bb, 2 붉은 자취)에 대한 micromixed했다만이 다음과 같은 RT 반응을 제시했다. 모든 다른 (즉 micromixed5, 분쇄 및 부정적인 컨트롤)은 대체 amplicon 제품 (예 : 뇌관의 dimers) 생성.
그림 1. 표준 실험실 RT 반응에 micromixing를 적용하기위한 프로토콜의 흐름 다이어그램. 물리적인 원리 참여, micromixer 및 내부 micromixer 구축에 더 자세한 설명은 참고 문헌 13,14에서 제공하는
그림 2. 달리 표준 실험실 RT 반응에서 mRNA의 단일 셀 수량 구성된 RT 반응 앞에 적용 micromixing의 장점을 보여주는 대표 qPCR 데이터입니다. Nurr - 1 유전자를 인코딩 cDNA 나타내는 mRNA를 검출 qPCR 추적 예. 이전 RT 반응이 25μL의 볼륨 총 RNA의 2.5pg 포함되어 ° C 60 분 37 인큐베이터에서 수행되었다. RT 반응은 R의 분쇄에 의해 혼합되었다T는 이전 (빨간색 흔적, "micromixed60"RT 반응 (푸른 흔적 "micromixed5")의 처음 5 분 동안 micromixed 또는 RT 반응의 전체 60 분 micromixed 부화 (검은 흔적, "분쇄")에 혼합 ). 수단 ± 50 % 최대 형광에 도달하는 데 필요한 qPCR 사이클의 수를 전문가, 대리인은 N은 아래 꾸몄다있는이 실험 = 3 반복합니다. 별표 상당한 차이 (Tukey 다중 비교와 단방향 ANOVA)을 나타냅니다. B 다른 qPCR 실험이 25μL의 볼륨 총 RNA의 25pg를 포함하는 RT 반응에 따라 이번 Nurr - 1 cDNA 제품을 검토. qPCR의 흔적 (A)뿐만 아니라 얻은 qPCR 제품의 곡선 분석을 용해가 (B) 다른 혼합 조건 표시됩니다. 아무 cDNA가 이전 RT 반응에 포함되지 않은있는 부정적인 컨트롤도 (회색 흔적 "neg.") 포함되어 있습니다. mRNA의보다 높은 농도로 RT 반응도 수행 및 (b) micromixed60에 대한 (붉은 흔적) 샘플 사람들에게 동일한 용해 곡선 봉우리를 (데이터가 표시되지 않음) 생산되었다.
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Discussion
표준 실험실 RT 반응에 micromixing의 신청 방법은 물론, 참여 할 수 여기에 설명된 모든 방법 (예 : 세포 용해, 레이저 캡처 microdissection)을 통해 수확 mRNA. 그것은 또한 모든 브랜드 또는 형식 RT 시약의 어떤 온도 (micromixer의 재료의 허용 오차 이내), 시간의 기간을 구성하실 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 무작위로 hexamer 또는 oligo - DT primers로 구성된 RT 반응에서 개선 cDNA 수율을 관찰했습니다. 그것은 다음과 같은 제약 조건에 부합하는 다른 생화 학적 변환 (예 : DNA의 하이브리드화 15) 또한 적용될 수 있습니다. 현재 기술의 주요 제약 조건은 반응 곡선 액체 공기 인터페이스 (예 : 초승달 모양) 양식 솔루션의 작은 (microliter) 드롭 내에서 발생해야합니다. 우리는 일상적으로 각각 4.7 또는 6.9mm의 곡률 반지름과 menisci를 생산, 200μL 얇은 벽의 PCR 튜브에 10 25μL의 볼륨을 사용합니다. 이것은 다른 솔루션 사이의 인터페이스를 elongates 드롭에 설정하는 소용돌이 흐름에 대한 일반적인 요구 사항입니다 및 확산이 짧은 timescales 이상의 자리를 대신할 수 있습니다. 이 제약 따라서 micromixing가 사용될 수있는 모든 상황에 적용됩니다. 실제로 작은 볼륨의 사용은 종종 입력 자료 (예 : RNA, DNA)의 금액이 제한되기 때문에 이점 수 있으며, 플러스 상당한 비용 절감은 다른 시약을 만들 수 있습니다. RT 반응 수율을 개선의 구체적인 맥락에서, 반응은 mRNA의 제한 금액을 구성해야합니다. 우리는 입력 RNA의 단일 셀 금액 구성된 micromixing 표준 실험실 RT 반응은 (흔들림 vortexing 또는 분쇄) 혼합 Nurr - 1 그림 이외의 다른 유전자에 대한 포함하는 표준 방법을 통해 약 10 - 100 - 배함으로써 cDNA 수율을 증가시킬 수있다는 것을 보여주 여기에 14. 우리는 또한 개선 입력 RNA의 농도가 14 증가로 감소 보여주었다. 높은 RNA의 농도에서 micromixing의 부재에서 확산의 증가 속도가 저하되기 전에 더 많은 mRNA가 cDNA로 변환 보장하기 때문에 아마도이 있습니다.
micromixing 방법은 반응 솔루션에 대한 반응 선박을 통해 음향 신호의 높은 충실도 전송 도움이 될 것입니다. 우리는 그들이 정확하게 사용 200μL 얇은 벽의 PCR 튜브에 맞게 테이퍼다고 같은 스피커 (그림 1) overlying 아크릴 판에있는 구멍 혼합주의 가공하여이를 도왔습니다. 이것은 튜브와 아크릴 판 및 음향 신호의 그러므로 극대화 전송 사이의 접촉을 극대화. 하나는 또한 그들이 기계 진동의 결과로 혼합하는 동안 나올 수 있기 때문에 반응 튜브가 안전하게 혼합 구멍 내에서 개최되는 것을 보장하기 위해 필요합니다.
음향 microstreaming 우리의 정의는 몇 가지 phenomenologically 기반 정의를보다 넓은 가능성이 있습니다. 그러나, 오히려 phenomenologically보다 근본적으로 이러한 흐름을 분류 라일 16 좋은 리뷰가 있습니다. Navier - 스톡스 방정식의 비선형 용어는 두 번째 명령에서 의미 흐름이되도록 충분히 커야한다. 그 용어는 속도 번 속도 기울기, 우리가 microstreaming 흐름에 상승을 줄 수 속도가 충분히 작은 차이가있는 이상의 길이 척도 (예 : 충분히 큰 속도 기울기를)을하도록하는 일은 때문입니다. 우리의 음향 microstreaming 기반 장치 (이하 "micromixer") 시스템이 굴곡 13 작은 반경을 가진 액체 공기 인터페이스를함으로써 오디오 (즉, 낮은 전력) 주파수에서 음향 microstreaming 수 있습니다. 대조적으로, "음향 스트리밍"는 종종 큰 속도 (즉, 높은 전력)에 의해 큰 만든 비선형 기간에 의해 정의됩니다. 우리의 경우에는 우물에 작은 방울이 진동으로 만든, 드롭의 표면 장력은 함께 그 점도 함께 13 믹싱하는 데 유용 의미 흐름을 만드는 역할을 수 있습니다. 실험은 또한 대형 (10 - 100μm) 입자가 우리가 사용하는보다 큰 진동 방울 내에서 이동할 수 있습니다 것으로 나타났습니다 그러나 이것은 입자 17 특정 다른 메커니즘에 의해 아마이다.
결론적으로, RNA의 단일 셀 금액 구성된 표준 실험실 RT 반응에 micromixing의 응용 프로그램은 크게 자신의 cDNA 수율을 높이는 효과적인 방법입니다. 이 개선은 이상 혼합 microliter 볼륨의 현재 사용할 수있는 방법을 (흔들림 vortexing 또는 분쇄 즉,)를 사용하여 얻을 수있는 이상의 것입니다. 여러 상황이 있지만 RT 혼자 micromixing, 우리 자신을 포함하여 다른 상황에서 큰 사전 것입니다 수행 microfluidics 기반의 장치는 더욱 전문적인 장비와 방법에 대한 필요없이 중요하고 적절한 혜택을 제공하는 인치
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Disclosures
저자는 공개 없어요.
Acknowledgments
이 연구는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (프로젝트 부여 안돼. 6,288,480)와 스코비와 클레어 맥키논 트러스트에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
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